[국내논문]종 식별 분자 마커 개발을 위한 섬모충류 Euplotes의 small subunit ribosomal RNA 변이성 분석 Analysis of Genetic Variation in the Small Subunit Ribosomal RNA Gene of Euplotes Ciliates for Developing Species Diagnostic Molecular Marker원문보기
Small subunit ribosomal RNA (18S rRNA)의 loop 부위들의 변이를 분석하여 해양 섬모충류의 종 특이 유전적 마커로써 이용 가능성을 확인하고자 9종의 Euplotes (Hypotrichia : Ciliophora)에 대하여 18S rRNA 유전자의 염기서열변이성을 조사하였다. 연구 결과에 의하면 V1, V3 그리고 V5 부위는 종간 변이가 없었고, V7과 V8은 종간변이는 높으나 염기서열의 길이가 각각 44 bp와 79 bp로 길이가 짧아서 충분한 유전 정보를 가지기 어렵기 때문에이 부위들은 종특이 분자마커로 적합하지 않았다. 그러나 V2와 V4부위는 $1.75{\sim}20.61%$로 높은 변이성을 보여주었고 종간 계통 관계도 잘 나타내었다. 또한 염기서열의 길이도 각각 123 bp와 306 bp로 마커 개발에 충분한 길이를 가지고 있었다. 따라서 18S rRNA의 V2와 V4부위는 섬모충류의 종 특이 분자 마커 개발에 가장 적합한 부위라는 결론을 얻었다.
Small subunit ribosomal RNA (18S rRNA)의 loop 부위들의 변이를 분석하여 해양 섬모충류의 종 특이 유전적 마커로써 이용 가능성을 확인하고자 9종의 Euplotes (Hypotrichia : Ciliophora)에 대하여 18S rRNA 유전자의 염기서열 변이성을 조사하였다. 연구 결과에 의하면 V1, V3 그리고 V5 부위는 종간 변이가 없었고, V7과 V8은 종간변이는 높으나 염기서열의 길이가 각각 44 bp와 79 bp로 길이가 짧아서 충분한 유전 정보를 가지기 어렵기 때문에이 부위들은 종특이 분자마커로 적합하지 않았다. 그러나 V2와 V4부위는 $1.75{\sim}20.61%$로 높은 변이성을 보여주었고 종간 계통 관계도 잘 나타내었다. 또한 염기서열의 길이도 각각 123 bp와 306 bp로 마커 개발에 충분한 길이를 가지고 있었다. 따라서 18S rRNA의 V2와 V4부위는 섬모충류의 종 특이 분자 마커 개발에 가장 적합한 부위라는 결론을 얻었다.
To verify which loop regions of 18S rRNA gene are suitable as species-specific genetic markers in ciliates, we analyzed the genetic variation of 18S rRNA gene among 9 Euplotes species (Hypotrichia : Ciliophora). In our result, no inter-specific variation was detected from V1, V3 and V5 regions, and ...
To verify which loop regions of 18S rRNA gene are suitable as species-specific genetic markers in ciliates, we analyzed the genetic variation of 18S rRNA gene among 9 Euplotes species (Hypotrichia : Ciliophora). In our result, no inter-specific variation was detected from V1, V3 and V5 regions, and the length of V7 and V8 are 44 bp and 79 bp, respectively, which are too short to make genetic marker. In contrast, V2 and V4 may be good candidate segments of species-specific diagnostic molecular markers because these two regions are most variable ($1.75{\sim}20.61%$) and showed good inter-specific phylogeny. Furthermore, the sequences of V2 and V4 are 123 bp and 306 bp, respectively in length which are enough to make species-specific marker.
To verify which loop regions of 18S rRNA gene are suitable as species-specific genetic markers in ciliates, we analyzed the genetic variation of 18S rRNA gene among 9 Euplotes species (Hypotrichia : Ciliophora). In our result, no inter-specific variation was detected from V1, V3 and V5 regions, and the length of V7 and V8 are 44 bp and 79 bp, respectively, which are too short to make genetic marker. In contrast, V2 and V4 may be good candidate segments of species-specific diagnostic molecular markers because these two regions are most variable ($1.75{\sim}20.61%$) and showed good inter-specific phylogeny. Furthermore, the sequences of V2 and V4 are 123 bp and 306 bp, respectively in length which are enough to make species-specific marker.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 섬모충류 그룹 내에서 담수, 기수, 해양 등에 광범위하게 분포하며 형태 및 분자적 연구가 비교적 잘 이루어진 Euplotes(Hypotrichia: Ciliophora) 속을 대상으로 18S rRNA의 부위별 염기서열 변이성 연구를 통해 종 식별에 보다 적합한 18S rRNA의 염기서열 부위를 선별하고자 한다.
제안 방법
배양된 생시료를 해부현미경 하에서 마이크로 피펫으로 50개체 이상을 추출하여 1.5 ml microcentrifuge tube에 넣어 해수를 제거한 후 DNeasy Tissue kit(Qiagene)으로 제조사의 프로토콜에 의거하여 게놈 DNA를 추출하였다. 18S rRNA 증폭을 위해 50 ng의 게놈 DNA, 5 unit의 Taq polymerase(Takara), 5µl의 X10 buffer (Promega), 5µl의 25 mM MgCl2(Promega), 18S rRNA의 범용프라이머를 사용하여(Medlin et al.
5 ml microcentrifuge tube에 넣어 해수를 제거한 후 DNeasy Tissue kit(Qiagene)으로 제조사의 프로토콜에 의거하여 게놈 DNA를 추출하였다. 18S rRNA 증폭을 위해 50 ng의 게놈 DNA, 5 unit의 Taq polymerase(Takara), 5µl의 X10 buffer (Promega), 5µl의 25 mM MgCl2(Promega), 18S rRNA의 범용프라이머를 사용하여(Medlin et al., 1988; forward primer, EuKA: 5'-CTG GTT GAT CCT GCC AG-3'; reverse primer, EuKB: 5'- TGA TCC TTC YGC AGG TTC-3') forward primer 와 reverse primer를 각각 5 pmole 첨가 한 후, 반응 부피를 50µl로 맞추었다. 중합효소연쇄반응은 핵산증폭기 모델 2400(PE Applied Biosystems)을 이용하여 94 oC 2분 처리 후 95 oC 15초, 55 oC 30 초, 72 oC 3분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72 oC 5분 처리하는 조건으로 수행하였다.
, 1988; forward primer, EuKA: 5'-CTG GTT GAT CCT GCC AG-3'; reverse primer, EuKB: 5'- TGA TCC TTC YGC AGG TTC-3') forward primer 와 reverse primer를 각각 5 pmole 첨가 한 후, 반응 부피를 50µl로 맞추었다. 중합효소연쇄반응은 핵산증폭기 모델 2400(PE Applied Biosystems)을 이용하여 94 oC 2분 처리 후 95 oC 15초, 55 oC 30 초, 72 oC 3분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72 oC 5분 처리하는 조건으로 수행하였다.
반응 후 PCR 산물을 AccuPrepPCR Purification kit (Bioneer) 를 이용하여 정제 한 후, 증폭된 산물을 pGEM-T Easy vector (Promega)에 제품에서 제시한 방법을 따라 접합(ligation)하였다. 이를 E.
coli 에 형질 전환시켜 ampicillin (50µg/µl)이 포함된 LB 평판배지에서 청색-백색(blue-white) 클론 선별법으로 선별하였다. 선별된 클론들을 벡터 및 18S rRNA 유전자 범용 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결정은 ABI 3100 자동 염기서열 결정 장치(Applied Biosystems)를 이용하였다.
변이성 분석을 위해 본 연구에서 확인된 Euplotes 2종의 18S rRNA와 GenBank에서 추출한 7종 11개 염기서열을 사용하여 총 9종 13개 염기서열을 ClustalX (Thompson et al., 1997)로 정렬하였다. E.
1). 변이성 분석은 Mega 3.1 (Kumar et al., 2004)을 이용하여 p-distance 값을 사용하여 종내(intra-specific) 및 종간(inter- specific) 변이성을 구하였다. 계통수는 Mega 3.
9종의 염기서열의 부위별 변이성을 분석하기 위하여 18S rRNA 전체를 변이부위와 보존부위(conserved region: 변이부위를 제외한 부위)로 나누어서 p-distance로 분석하였다. 그 결과 변이부위를 모두 제외한 보존부위의 종간 변이성은 0.
61%의 최대 변이성을 보였다 (Table 3). Euplotes 종간 계통 유연관계를 보고자 9종에 대한 NJ tree를 구성하였다. 전체 18S rRNA를 이용한 경우(Fig.
대상 데이터
선별된 클론들을 벡터 및 18S rRNA 유전자 범용 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결정은 ABI 3100 자동 염기서열 결정 장치(Applied Biosystems)를 이용하였다.
, 1997)로 정렬하였다. E. aediculatus 염기서열 5개는 종내 변이성 분석에 이용되었으며, 이 중 Eaed1 (AF508756)을 종간 변이성 분석에 이용하여 총 9종 9개 염기서열이 종간 변이성 분석에 사용되었다(Table 1). 유전자 변이성 분석에 사용된 Euplotes의 변이부위 선정은 18S rRNA의 2차 구조가 밝혀져 있는 Tetrahymena canadensis에 의거하여진 핵 생물에는 나타나지 않는 V6 부위를 제외한 8개 변이부위 (variable region; V1, V2, V3, V4, V5, V7, V8, V9)를 선정하였다(Fig.
aediculatus 염기서열 5개는 종내 변이성 분석에 이용되었으며, 이 중 Eaed1 (AF508756)을 종간 변이성 분석에 이용하여 총 9종 9개 염기서열이 종간 변이성 분석에 사용되었다(Table 1). 유전자 변이성 분석에 사용된 Euplotes의 변이부위 선정은 18S rRNA의 2차 구조가 밝혀져 있는 Tetrahymena canadensis에 의거하여진 핵 생물에는 나타나지 않는 V6 부위를 제외한 8개 변이부위 (variable region; V1, V2, V3, V4, V5, V7, V8, V9)를 선정하였다(Fig. 1). 변이성 분석은 Mega 3.
이론/모형
인천 연안수에서 채집한 Euplotes 2종을 수온 20 oC, 염분 31 psu, 광주기 12:12h(명:암)의 조건하에서 순배양 하였으며 배양된 시료를 Quantitative Protargol Staining(QPS: Montagnes and Lynn, 1987) 방법을 이용하여 동정하였다.
25);"> PCR Purification kit (Bioneer) 를 이용하여 정제 한 후, 증폭된 산물을 pGEM-T Easy vector (Promega)에 제품에서 제시한 방법을 따라 접합(ligation)하였다. 이를 E. coli 에 형질 전환시켜 ampicillin (50µg/µl)이 포함된 LB 평판배지에서 청색-백색(blue-white) 클론 선별법으로 선별하였다. 선별된 클론들을 벡터 및 18S rRNA 유전자 범용 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
, 2004)을 이용하여 p-distance 값을 사용하여 종내(intra-specific) 및 종간(inter- specific) 변이성을 구하였다. 계통수는 Mega 3.1의 neighbor-joining (NJ) 방법으로 구하였는데 Kimura 2-parameter를 거리계수 선택 (distance option)으로 사용하였다.
성능/효과
raikovi로 동정되었다. 두 종에 대한 18S rRNA의 전체(complete) 염기서열 길이는 E. raikovi는 1, 858 bp, E. vannus는 1, 848 bp이며 염기서열 내 GC 비율은 각각 45.8%와 44.2%였다(Table 1).
인천에서 채집된 Euplotes 두 종과 GenBank에서 추출한 7종의 종간 분석에 사용된 염기서열의 정렬길이는 1, 966 bp이었고(Fig. 1) 9종의 18S rRNA 전체 염기서열의 종간 pairwise p-distance 값은 최소 1.84%, 최대 11.50%, 평균 5.99%이었다.
부위)로 나누어서 p-distance로 분석하였다. 그 결과 변이부위를 모두 제외한 보존부위의 종간 변이성은 0.81-5.87%(평균 2.95%) 로 변위부위가 포함된 전체 염기서열의 종간 변이성(평균 5.99%) 보다 2배 낮게 나타났다(Table 2). V1에서 V9까지 변이부위에 따른 평균 종간 p-distance 결과는 0.
99%) 보다 2배 낮게 나타났다(Table 2). V1에서 V9까지 변이부위에 따른 평균 종간 p-distance 결과는 0.62-28.81%로 나타났고 8개 변이부위에 대한 각각의 분석결과 9종의 정렬된 염기서열의 길이는 V1의 길이가 26 bp로 가장 짧았고, V4가 306 bp로 가장 길었다 (Table 2).
00%값을 나타냈다. 따라서 100 bp 이상의 길이를 갖는 V2 및 V4 부위에 대한 종간 p-distance 값을 구하면, V2 부위의 종간 최소 변이성은 1.83% (Euplotes aediculatus와 E. eurystomus 및 E. woodruffi 사이)이고 최대 변이성은 17.43% (E. raikovi와 E. aediculatus, E. octocarinatus 및 E. woodruffi 사이)를 보였고, V4부위는 E. eurystomus와 E. woodruffi 간에 1.75%로 최소 변이성을 보였고, E. chron과 E. eurystomus 및 E. woodruffi 사이, 그리고 E. raikovi 와 E. vannus 사이에서 동일하게 20.61%의 최대 변이성을 보였다 (Table 3). Euplotes 종간 계통 유연관계를 보고자 9종에 대한 NJ tree를 구성하였다.
2C) 부위만을 사용하여 만든 계통수 간에는 차이가 나타나지 않았으며, 동일한 계통 수지 상(topology)을 보여 주었다. 염기서열의 보존부위와 변이부위에서의 종내 변이성을 분석한 결과 Euplotes aediculatus 5개 염기서열간에는 변이성이 나타나지 않았다(0.00%).
9종의 Euplotes 18S rRNA 전체 염기서열을 사용한 분석에서근연 종간의 종간 변이성이 평균 5.99%로 나타났다. 최근 DNA 분류에 많이 활용되고 있는 부위(Floyd et al.
42%로 오히려 전체 18S rRNA의 변이성보다도 낮았다. 반면 변이부위 길이가 100 bp 이상으로 충분한 정보를 가지고 있을 것으로 예상되는 V2와 V4부위의 평균 종간 변이성은 각각 8.82% 및 13.49%로 전체 염기서열에 비해 V2는 1.47배, V4 는 2.25배로 전체 18S rRNA 염기서열을 이용할 때 보다 변이성이 2배 이상 높게 나왔다(Table 2). 한편 전체 18S rRNA 염기서열을 사용해 만든 NJ tree(Fig.
2C)가 동일한 계통 수지상 (topology)을 보여주었다. 이러한 결과는 전체 18S rRNA 염기서열과 마찬가지로 개별 변이부위(V2 및 V4)도 계통적(phylogenetic) 시그널을 포함하고 있음을 보여주는 것으로 V2 및 V4부위가 개별적으로도 종 식별에 활용될 수 있음을 시사 하였다. 한편 변이부위가 대상 생물의 계통 관계를 잘 보여주고 있음은 초파리를 비롯하여 다양한 진핵 생물을 대상으로 한 하위단계 계통 관계 연구에서도 확인된 바 있어 본 연구결과를 지지한다고 할 수 있다.
본 연구 결과에 의하면 Euplotes의 정렬간격(gap)을 포함한 V2 와 V4부위의 정렬된 염기서열 길이는 188 bp와 315 bp로써 한 번의 염기서열결정(sequencing)으로 얻을 수 있는 적당한 길이를 가지고 있다. 또한 V2와 V4부위 앞, 뒤에 존재하는 stem부위는 염기서열의 보존성이 매우 높아 진핵 생물 전체를 통해 사용될 수 있는 범용 프라이머를 만들 수 있는 부위가 존재하고 있어 실험의 용이성도 높은 유전자 부위라 말할 수 있다.
인천연안에서 채집된 Euplotes는 형태 분류를 통해서 E. vannus와 E. raikovi로 동정되었다. 두 종에 대한 18S rRNA의 전체(complete) 염기서열 길이는 E.
후속연구
진 핵 생물의 18S rRNA는 대부분 1, 800 bp 내외의 염기 길이를 가지고 있어 전체 염기서열을 종 식별에 활용하기에는 길이가 다소 길다고 할 수 있다. 따라서 18S rRNA를 종 식별에 효율적으로 활용하기 위해서는 이 유전자의 구조적 특성에 대한 연구를 통해서 종 식별 해상력이 높으면서도 한번의 염기서열 결정 실험으로 확인할 수 있는 부위의 선정이 필요하다. 하지만 섬모충류의 염기서열 특성에 관한 기존 연구가 부족하기 때문에 표준화된 부위가 결정되어 있지 않아 연구자에 따라 임의로 부위를 선정해 사용하고 있다.
따라서 섬모충류가 매우 분화된 분류군이라는 점을 감안하면 CO1 유전자가 모든 섬모충류 분류군에 적용되기에는 쉽지 않을 것으로 예상된다. 반면에 진핵 생물의 18S rRNA는 염기서열의 보존성이 높아 모든 진핵 생물이 유사한 특성을 보여주고 있고, 범용 프라이머(universal primer)도 쉽게 제작할 수 있으며, 또한 이미 많은 분류군에서 연구 성과가 축적되어 있어서 18S rRNA가 종 식별에 적합하다는 것이 확인될 수 있다면 연구가 미진한 다른 어떤 유전자를 이용하는 것보다 훨씬 효과적으로 광범위한 분류군의 종 식별에 활용될 수 있을 것이다. 18S rRNA는 단백질 합성에 관여하는 리보솜의 구성성분으로 생체 내에서 기능을 발휘하기 위해서는 자기 접합(self pairing) 에의한 2차 구조를 형성한다(Neefs et al.
그러나 많은 연구에서 유전자의 변이성이 분류군에 따라 큰 차이가 있다고 보고 된바 있으며 18S rRNA에 대한 연구 또한 상위 분류군 연구에 치우쳐 진행되어 온 관계로 근연 분류군간의 계통 관계에 대한 연구는 의외로 부족하다. 따라서 다양한 분류군의 종 식별에 유전자의 변이성을 이용하는 것이 적합하다는 판단을 하기에 충분한 연구 결과가 축적되어 있지 않으며 이와 같은 이유로 18S rRNA의 변이 부위를 다양한 진핵 생물의 종 식별에 활용하기 위해서는 변이 부위의 유전자 내(intragenomic), 종내 및 종간 변이성에 대한 면밀한 조사가 먼저 선행될 필요성이 있다.
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