본 연구에서는 청국장에서 biogenic amine의 함량을 조사하고, 이를 생성하는 미생물의 스크리닝 및 biogenic amine 형성 등을 통하여 생성원인을 규명하고자 하였다. 그 결과 국내 시판 청국장에는 putrescine, histamine, tryptamine 등 11종의 biogenic amine이 검출되었으며, 이 중 tyramine이 $4.2{\pm}0.9-483.1{\pm}28.4mg/kg$의 범위를 보여주여 다른 amine에 비하여 높게 나타났다. 청국장내 균주는 B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. licheniformis 등이 분리 동정되었고, 이들 균주에 대한 탈탄산 효소 활성 스크리닝을 살펴본 결과 모두 양성(+) 반응을 보여주었다. 최종적으로 균주에 대한 biogenic amine 생성을 확인하였을 때, 청국장내 존재하는 균주가 탈탄산 효소 활성을 통하여 biogenic amine 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 청국장에서 biogenic amine의 함량을 조사하고, 이를 생성하는 미생물의 스크리닝 및 biogenic amine 형성 등을 통하여 생성원인을 규명하고자 하였다. 그 결과 국내 시판 청국장에는 putrescine, histamine, tryptamine 등 11종의 biogenic amine이 검출되었으며, 이 중 tyramine이 $4.2{\pm}0.9-483.1{\pm}28.4mg/kg$의 범위를 보여주여 다른 amine에 비하여 높게 나타났다. 청국장내 균주는 B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. licheniformis 등이 분리 동정되었고, 이들 균주에 대한 탈탄산 효소 활성 스크리닝을 살펴본 결과 모두 양성(+) 반응을 보여주었다. 최종적으로 균주에 대한 biogenic amine 생성을 확인하였을 때, 청국장내 존재하는 균주가 탈탄산 효소 활성을 통하여 biogenic amine 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
The potential to produce biogenic amines was investigated in microbial strains isolated from fermented soybean paste, cheonggukjang. The typical levels of 11 biogenic amines, including putrescine, histamine, and tryptamine, were analyzed in commercial cheonggukjang. The tyramine and histamine levels...
The potential to produce biogenic amines was investigated in microbial strains isolated from fermented soybean paste, cheonggukjang. The typical levels of 11 biogenic amines, including putrescine, histamine, and tryptamine, were analyzed in commercial cheonggukjang. The tyramine and histamine levels in the samples ranged from 4.2 to 483.1 mg $kg^{-1}$ and 0.2 to $70.3mg\;kg^{-l}$, respectively. A total of 4 microbial strains of Bacillus sp. were isolated from cheonggukjang. The Bacillus sp. were identified as B. amyloliquefaciens, B. subtilis, and B. licheniformis based on phenotypic characteristics, which included using the VITEK system. The screening plate method for detecting amino acid decarboxylase positive microorganisms was performed. The results fer amino decarboxylation were positive, and biogenic amine formation was evaluated by the confirmation of amine-forming capacity.
The potential to produce biogenic amines was investigated in microbial strains isolated from fermented soybean paste, cheonggukjang. The typical levels of 11 biogenic amines, including putrescine, histamine, and tryptamine, were analyzed in commercial cheonggukjang. The tyramine and histamine levels in the samples ranged from 4.2 to 483.1 mg $kg^{-1}$ and 0.2 to $70.3mg\;kg^{-l}$, respectively. A total of 4 microbial strains of Bacillus sp. were isolated from cheonggukjang. The Bacillus sp. were identified as B. amyloliquefaciens, B. subtilis, and B. licheniformis based on phenotypic characteristics, which included using the VITEK system. The screening plate method for detecting amino acid decarboxylase positive microorganisms was performed. The results fer amino decarboxylation were positive, and biogenic amine formation was evaluated by the confirmation of amine-forming capacity.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 국내 시판 청국장에서 BA의 함량을 조사하고, BA을 생성하는 미생물의 스크리닝을 통하여 생성 원인을 규명하고자 한다.
제안 방법
BA의 분석은 일본 위생시험법(17)의 불휘발성부패 아민 분석법을 변형하여 사용하였다. 시료 약 2-5 g을 취하여 산성용액(0.
확인하였다. MRS 및 NA broth에 agar를 넣지 않고, 0.005% pyridoxal-5-phosphate, 0.5% tyrosine, 0.25% histidine, 0.25% ornithine과 0.25% lysine을 첨가하고, 3(FC에서 4일간 배양하였다. BA의 측정에는 배양된 broth 2mL을 원심분리기(Union 55R, Hanil)를 이용하여 12, 696 xg에서 5분간 원심분리하여 상등액을 사용하였다.
Nutrient agar plate상에서 청국장 내의 균들을 배양한 다음 colony 의 형태, 크기 및 점질물 생성 정도 등에 따라 LB 배지, MRS 배지에 재배양시켜 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 1차적으로 Bdgey's manual of systematic bacteriology 방법(18)에 의하여 그람염색, 세포 형태, 운동성, catalase, oxidase 등 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 뒤, 그람 음성, 효모 및 Bacillus sp.
균주를 동정하기 위하여 NA 배지에 생성된 colony 각각을 LB 배지 및 MRS 배지에 도말한 후 배양기(HB-102LP, Hanbaek, Bucheon, Korea)에서 30℃, 24시간 배양하여 콜로니 색상과 형태 등을 기준으로 균주들을 분리하였다.
은 활성이 다른 탈탄산 효소를 지닐 수 있을 수 있기 때문에 시판 청국장 내의 미생물의 분리 . 동정 및 탈탄산효소 활성을 스크리닝을 하였다.
방법에 의하여 측정하였다. 동정된 균주를 아미노산이 첨가되지 않은 배지(대조구)와 아미노산이 첨가된 배지(시험구)에 도말하고 배양기(Hanbaek)에서 30℃, 4일간 배양한 뒤 탈탄산 효소 활성을 확인하였다. 배지의 조성은 Table 1과 같으며, 탈탄산효소 활성 유무에 따라 배지에서 colony가 형성되고, 주위에 색이 대조되는 환이 생긴다.
동정된 균주의 amine 생성은 아미노산이 들어있는 배지에 균을 접종한 뒤 TYR, HIS, PUT, CAD의 정성 및 정량 분석을 통하여 확인하였다. MRS 및 NA broth에 agar를 넣지 않고, 0.
분리된 균주는 1차적으로 Bdgey's manual of systematic bacteriology 방법(18)에 의하여 그람염색, 세포 형태, 운동성, catalase, oxidase 등 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 뒤, 그람 음성, 효모 및 Bacillus sp.의 종류로 나누고, 각각 증류수에 현탁한 뒤 VITEK 2 COMPACT으로분리한 균을 동정하였다.
일반적으로 BA는 유리아미노산에서 미생물의 탈탄산 효소작용으로 인하여 생성되므로, 분리된 균주의 탈탄산효소 활성을 통하여 BA의 생성원인을 살펴보았다. 이러한 탈탄산 효소작용은 bromocresol purple과 같은 pH 지표물질을 함유하고 있는 배지에 분리 균주를 배양하여 변화되는 양상에 따라 확인할 수 있는데 (19, 27), 양성(+) 반응은 배지에서 colony가 형성되고, 주위에 색이 대조되는 환이 생긴 경우이다.
대상 데이터
) 및 유도체 시약 dansyl chloride는 Sigma Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였고, HPLC 등급의 acetonitrilee Baker(Fair- lawn, NJ, USA)에서 구입하였다.
청국장은 전라남도 목포, 순창, 광주, 충청북도 상촌, 경기도 양평, 경상남도 함양 및 시판청국장 10종을 수집하였다. Biogenic amine의 표준품으로 putrescine(PUT) dihydrochloride, cadaverine (CAD), spermidine(SPD), spermine(SPM), tryptamine (TRY), hista- mine(HIS) dihydrochloride, tyramine(TYR) hydrochloride, p-phe- nylethylamine(PHE) hydrochloride, serotonin(SER) hydrochloride, noradrenaline(NOR) hydrochloride, dopamine(DOP) hydrochloride 와 내부 표준물질로서 사용되는 l, 7-diaminoheptane(I.
이론/모형
각 배지에서 분리된 균주는 1차적으로 Bergey's manual of systematic bacteriology 방법(18)에 의하여 그람 염색, 세포 형태, 운동성, catalase 및 oxidase 등의 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였다. 분리된 균주의 특성증 그람 음성, 양^, 효모 및 Bacillus sp.
동정된 균주의 탈탄산효소 활성 스크리닝은 Bover-Cid and Holzap:fel(19)의 방법에 의하여 측정하였다. 동정된 균주를 아미노산이 첨가되지 않은 배지(대조구)와 아미노산이 첨가된 배지(시험구)에 도말하고 배양기(Hanbaek)에서 30℃, 4일간 배양한 뒤 탈탄산 효소 활성을 확인하였다.
6 McF, 2 McF로 현탁하였다. 동정분석에는 VITEK 2 COMPACT(BioMerieux, Marcy-PEltoile, France)를 이용하여 분석하였다. 시험 결과는 96- 99%의 유사율(excellent), 93-95% 의 유사율(very good), 89-92%의유사율(good), 85-88%의 유사율(acceptable)으로 정확히 동정된 균주, low discrimination, unidentified로 추가 감별 시험이 필요한 균주로 검토하였다.
성능/효과
나타낸 결과이다. 10개의 broth에 균주를 첨가하여 100% positive한 활성을 보인 것은 +, 70% 이상의 활성을 보인 것은 +/ - 70% 이하의 활성을 보인 것은 -로 표시하였을 때, 전체적으로 모든 아미노산에 있어 탈탄산 활성을 보여주었다. 각 균주에 대한 활성과 amine 생성량을 살펴보면, B.
형성하고, catalase test에서 양성으로 나타났다. 64개의 생화학적 반응 결과를 살펴본 결과 B. amykdiquefaciens는 92%의유사율, B. subtilis는 93%의 유사율, B. licheniformis는 95%의 유사율로 동정되었다. 청국장에 있는 균주로 B.
10개의 broth에 균주를 첨가하여 100% positive한 활성을 보인 것은 +, 70% 이상의 활성을 보인 것은 +/ - 70% 이하의 활성을 보인 것은 -로 표시하였을 때, 전체적으로 모든 아미노산에 있어 탈탄산 활성을 보여주었다. 각 균주에 대한 활성과 amine 생성량을 살펴보면, B. wbtilis의 경우 모든 아미노산에 70%의 활성을 보여주었고, histidine에 대한 활성이 높게 나타났다. 이 때문에 broth의 arninej- 측정하였을 때 HIS가 204.
이러한 탈탄산 효소작용은 bromocresol purple과 같은 pH 지표물질을 함유하고 있는 배지에 분리 균주를 배양하여 변화되는 양상에 따라 확인할 수 있는데 (19, 27), 양성(+) 반응은 배지에서 colony가 형성되고, 주위에 색이 대조되는 환이 생긴 경우이다. 본 연구에서 분리한 균주의 탈탄산 효소 활성을 확인한 결과 모두 양성(+) 반응을 보여줌으로써 탈탄산효소 활성을 확인할 수 있었다. Bover-Cid와 Holza- pfbl(19)는 56개의 미생물종들에 대하여 각각의 strain별 탈탄산 효소 활성을 측정하였는데, 개선된 배지를 사용하였을 경우 보다 정확하게 탈탄산효소 활성을 측정할 수 있다고 하였고, 이러한 탈탄산 효소 활성이 biogenic amine을 생성할 수 있다고 보고하였다.
동정분석에는 VITEK 2 COMPACT(BioMerieux, Marcy-PEltoile, France)를 이용하여 분석하였다. 시험 결과는 96- 99%의 유사율(excellent), 93-95% 의 유사율(very good), 89-92%의유사율(good), 85-88%의 유사율(acceptable)으로 정확히 동정된 균주, low discrimination, unidentified로 추가 감별 시험이 필요한 균주로 검토하였다.
Tsai 등(11)은 청국장과 유사하게 발효.제조되는 g如에서 HIS을 유발하는 세균으로 B. subtilis 2종과 S. pasteuri 2종을 분리한 다음이들 균이 HIS을 생성한다고 하였는데, 청국장에서의 주요 균으로 B. subtilis가 발견됨으로써 청국장 내 HUS의 생성원인을 밝혀낼 수 있었다. 그러나 청국장 발효에 관여하는 B.
하지만 청국장은 발효 동안 BA 으로 변환될 가능성이 있는 serine, proline, histidine, glutamic acid, aspartic acid, phenylalanine 등의 유리아미노산을 생성한다는 연구 결과가 보고 되어 있어 (21) 시판 청국장에 대한 BA의 함량을 조사하였다(Table 2).측정 결과 청국장에서는 PUT, HIS, TYR 등을 포함하여 11종의 BA이 검출되었으며, 이 중 TYR이 4.2+0.9- 483.1±28.4㎎/㎏의 범위를 보여주어 다른 amine에 비하여 높게 나타났다. TYR의 경우 심혈관계에 작용하여 혈관 수축과 심박활동을 증가시킴으로써 혈압상승을 유발할 수 있기 때문에(22), monoamine oxidase inhibitors(MAOIs) 의약품을 복용하는 환자에게는 TYR이 많이 함유된 청국장의 섭취가 고혈압 위기를 야기시킬 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
Bover-Cid와 Holza- pfbl(19)는 56개의 미생물종들에 대하여 각각의 strain별 탈탄산 효소 활성을 측정하였는데, 개선된 배지를 사용하였을 경우 보다 정확하게 탈탄산효소 활성을 측정할 수 있다고 하였고, 이러한 탈탄산 효소 활성이 biogenic amine을 생성할 수 있다고 보고하였다. 또한 Rice 등(28)의 경우 Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Photobacterium, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus 등이 한 개 혹은 여러 아미노산으로부터 탈탄산효소 활성을 가진다고 하여 추후 식품 중 이들 미생물에 대한 존재여부를 확인하고, amine 함량에 대한 조사가 필요할 것으로 사료된다.
참고문헌 (28)
Silla Santos MH. Biogenic amines: Their importance in foods. Int. J. Food Microbiol. 29: 213-231 (1996)
Ten Brink B, Damink C, Joosten HM, Huis in't Veld JH. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol. 11: 73-84 (1990)
Konings WN, Lolkema JS, Bolhuis H, Van Veen HW, Poolman B, Driessen AJM. The role of transport processes in survival of lactic acid bacteria. Anton. Van. Leeuw. 71: 117-128 (1997)
Paleologos EK, Savvaidis IN, Konotominas MG. Biogenic amines formation and its relation to microbiological and sensory attributes in ice-stored whole, gutted, and filleted Mediterranean sea base (Dicentrarchus labrax). Food Microbiol. 21: 549-557 (2004)
Kim YS, Jung HJ, Park YS, Yu TS. Characteristics of flavor and functionality of Bacillus subtilis K-20 cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 475-478 (2003)
Lee MY, Park SY, Jung KO, Park KY, Kim SD. Quality and functional characteristics of cheonggukjang prepared with various Bacillus sp. isolated from traditional cheonggukjang. J. Food Sci. 70: M191-M196 (2005)
Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. Isolation of immuno-stimulating strain Bacillus pumilus JB-1 from cheonggukjang and fermentational characteristics of JB-1. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 32: 291-296 (2004)
Kim SS, Lee JH, Ahn YS, Kim JH, Kang DK. A fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens D4-7 isolated from cheonggukjang: Its characterization and influence of additive on thermostability. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 31: 271-276 (2003)
Cho TY, Han GH, Bahn KN, Son YW, Jang MR, Lee CH, Kim SH, Kim DB, Kim SB. Evaluation of biogenic amines in Korean commercial fermented foods. Korean J. Food Sci. Technol. 38: 730-737 (2006)
Tsai YH, Chang SC, Kung HF. Histamine contents and histamine- forming bacteria in natto products in Taiwan. Food Control. 18: 1026-1030 (2007)
Chu CH, Bjeldanes LF. Effects of diamines polyamines and tuna fish extracts on the binding of histamine to mucin in vitro. J. Food Sci. 47: 7980-7988 (1981)
Bjeldanes LF, Schutz DE, Morris MM. On the aetiology of scombroid poisoning: Cadaverine potentiation histamine toxicity in guinea pig. Food Cosmet. Toxicol. 16: 157-159 (1978)
Gardini F, Martuscelli M, Caruso MC, Galgano F, Crudele MA, Favati F, Guerzoni ME, Suzzi G. Effect of pH, temperature, and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity, and biogenic amine production of Enterococcus faecalis. Int. J. Food Microbiol. 64: 105-117 (2001)
Enes Dapkevicius MLN, Robert Nout MJ, Rombouts FM, Houben JH, Wymenga W. Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 57: 107-114 (2000)
Kim WK, Choi, KH, Kim YT, Park HH, Choi JY, Lee YS, Oh HI, Kwon IB, Lee SY. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from cheonggukjang. Appl. Environ. Microb. 62: 2482- 2488 (1996)
Seok YR, Kim YH, Kim S, Woo HS, Kim TW, Lee SH, Choi C. Change of protein and amino acid composition during cheonggukjang fermentation using Bacillus licheniformis CN-115. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 37: 65-71 (1994)
Joosten HMLG. The biogenic amine contents of Dutch cheese and their toxicological significance. Neth. Milk Dairy J. 42: 25- 42 (1988)
Kim YS, Jung HJ, Park YS, Yu TS. Characteristics of flavor and functionality of Bacillus subtilis K-20 cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 475-478 (2003)
Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. Isolation of immuno-stmulating strain Bacillus pumilus JB-1 from cheonggukjang and fermentational characteristics of JB-1. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 32: 291-296 (2004)
Kim SS. Lee JH, Ahn YS, Kim JH, Kang DK. A fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens D4-7 isolated from cheonggukjang: Its characterization and influence of additive on thermostability. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 31: 271-276 (2003)
Lee MY, Park SY, Jung KO, Park KY, Kim SD. Quality and functional characteristics of cheonggukjang prepared with various Bacillus sp. isolated from traditional cheonggukjang. J. Food Sci. 70: M191-M196 (2005)
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