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문제 정의
- 그러나 이 방법 역시 고가의 정교한 자동화된 분석 장비로부터 생산된 아날로그형 정보와 다시 이들 정보를 디지털 정보로 전환하여 최종 DNA profile을 형성하는 과정에서 해석상의 오류를 발생시키는 여러 요인이 잠재하고 있어 체계화되고 공인된 여러 실험실 간의 교차검증 시스템의 운용이 매우 중요하며 이해 당사자 간의 시시비비를 가릴 정도의 검정력 및 신뢰성을 얻기 위해서는 제주마 집단의 유전적 특성 및 개체식별을 가장 잘 표현할 수 있는 최적의 유전자 표지(MS)를 검증하고 이들을 다수 확보하여 이를 분석할 필요가 있다. 따라서 본 연구는제주마 집단과 외래품종 간 유전적 차별성을 분석하고 이에 근거한 제주마 집단에서 개체의 식별에 가장 적절한 유전자표지(&S)를 설정하고 혈통 확인을 위한 동일성 검증 및 친자감별을 위해 분석되는 유전자 표지에 따른 오류 확률을 통계적으로 해석하여 보다 효율적인 개체식별 체계 검증을 통한 유전자 감식시스템을 이용한 제주마 경마시스템의 적용모델을 제시하고자 실시하였다.
- 본 연구는 서로 다른 상염색체에 위치하고 있는 초위성체유전 표지를 활용하여 제주마 집단의 타 품종과의 차별적 유전 특성 분석과 제주마 집단에서 활용할 수 있는 효율적인 개체 식별시스템 설정을 위해 수행되었다. 공시재료로서는 5 품종에서 총 191 두가 사용되었으며 13종의 좌위에 대한 개체별 유전자형을 분석하였다.
가설 설정
- Ht : Expected total heterozygosity.
제안 방법
- 13종marker를 통해 품종 특이성에 근거한 개체 확인 유용성 평가를 위해 서로 다른 유전적 특성을 가지고 있는 5품종에서 유전자 표지별이형접합도를 계산하였다. 개별적 유전자 좌위에 있어서 대립 유전자 수는 HMS6 좌위에서 7개로 가장 적었으며 ASB17에서는 가장 많은 16종의 대립유전자가 발견되었다.
- 2000년 국제동물유전학회 말 분과위원회에서 9개의 microsatellite DNA marker를 국제최소검사 항목으로 지정한 microsatellite 좌위들 중 3종에 대한 대립 유전자 출현 양상을 각 품종별로 비교하였다 (Fig. 1). 즉 분석 대상 유전표지별 집단 간 대립유전자 발현 양상을 비교해보면 특이한 집단별 품종 특이성을 발견할 수 있었다.
- 수행하였다. GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) 에서각 반응액의 총량을 10 μ1 PCR reaction으로 하고 약 50 ng template DNA, 20 ng each primer, 1.25 mM each of dNTP, 0.5 U, Taq DNA polymerases (Promega)과 1 μ 1 10X PCR buffer mM(100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KC1, 0.01% gelatin, 0.25% nonidet P40 and 20 mM MgCb)을 이용하여 95℃에서 5분간 첫 반응을 시작하여, 94℃에서 30초, microsatellites marker에 따라 53~55C에서 1분간, 72C에서 1분으로 35회 반복 반응을 실시하고 마지막으로 신장 반응은 72℃ 에서 10분간 실시하여 종료하였다. PCR 수행 후 증폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard와 잘 혼합하여, 5% polyacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Applied Biosystems) 를 사용하였다.
- PCR 반응은 형광염색된 microsatellites의 색상과 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 multiplex PCR을 수행하였고, 일부의 microsatellites는 단일 marker로서 PCR 을 수행하였다. GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) 에서각 반응액의 총량을 10 μ1 PCR reaction으로 하고 약 50 ng template DNA, 20 ng each primer, 1.
- 25% nonidet P40 and 20 mM MgCb)을 이용하여 95℃에서 5분간 첫 반응을 시작하여, 94℃에서 30초, microsatellites marker에 따라 53~55C에서 1분간, 72C에서 1분으로 35회 반복 반응을 실시하고 마지막으로 신장 반응은 72℃ 에서 10분간 실시하여 종료하였다. PCR 수행 후 증폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard와 잘 혼합하여, 5% polyacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Applied Biosystems) 를 사용하였다. Genescan analysis software (version 3.
- Table 3에서는 분석 대상이 5품종에 대한 관련 유전자 표지들에 대한 marker로서 유용성을 판단하기 위해 이형접합도 및 다형성 정보량(PIC)을 제시하였다. ATH5 좌위와 HMS7의 경우 다른 도입 4품종에서 비교적 다양성이 높은 것으로 추정되었지만 제주마 집단에서는 매우 낮은 다양성을 보였다.
- 제주마 집단에서 비교적 유전표지의 출현빈도 양상이 극단적으로 치우치지 않으며 개체식별에 용이한 수준의 대립유전자를 발현시키는 9종의 유전표지를 대상으로 개별 유전표지의 개체 식별력 및 누적 개체식별력을 제시하였다(Table 4). 이러한 개체식별력의 추정통계량은 혈연관계가 없는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타내지 않은 확률을 나타내고 있으며 이는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타낼 확률 추정치와 비교하였다.
대상 데이터
- 공시재료는 후보 유전자 표지(MS)의 말 품종별 발현 특성의 분석을 위해 제주도 축산진 홍원에 보유 중인 제주마 41두, 현재 국내 경주마로 사용 중인 품종으로 한국마사회 유전자 검사실로 의뢰된 더러브렛 44두, 더 러브렛종과 제주마 교잡종 56두, 몽고 수입마 39두, 그리고 쿼터호스 종 11두 등 모두 191두를 대상으로 하였다(Table 1).유전자 감정을 위한 좌위는 ISAG(국제동물유전학회)에서 말의 유전적 다양성 연구를 위해 개체식별 및 친자감정 등에 활용하도록 권장하는 국제 최소 표준 9종을 포함한 총 13종의 microsatellite를 사용하였다 [2, 3].
- 식별시스템 설정을 위해 수행되었다. 공시재료로서는 5 품종에서 총 191 두가 사용되었으며 13종의 좌위에 대한 개체별 유전자형을 분석하였다. 이들 13종에서 출현된 총 대립유전자 수는 제주마의 경우 155종이 나타났다.
- 대상으로 하였다(Table 1).유전자 감정을 위한 좌위는 ISAG(국제동물유전학회)에서 말의 유전적 다양성 연구를 위해 개체식별 및 친자감정 등에 활용하도록 권장하는 국제 최소 표준 9종을 포함한 총 13종의 microsatellite를 사용하였다 [2, 3].
데이터처리
- PCR 수행 후 증폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard와 잘 혼합하여, 5% polyacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Applied Biosystems) 를 사용하였다. Genescan analysis software (version 3.1)을 이용하여 각 PCR 단편들의 크기를 3차원 최소자승법(Third order least squares method)으로 분석하였고, Genotyper analysis soft- ware(version 2.0)을 이용하여 microsatellites loci별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.
- 이러한 개체식별력의 추정통계량은 혈연관계가 없는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타내지 않은 확률을 나타내고 있으며 이는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타낼 확률 추정치와 비교하였다. 5종의 좌위를 사용할 경우 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타낼 확률 주정치는 0.
이론/모형
- 대립 유전자의 크기가 MS marker에 따른 입력영역, 관측된 이형질성 (HoQbserved heterozytgosity) 및 대립 유전자빈도는 MS toolkit s/w [1이를 이용하였으며 분석된 MS 좌위별 집단에 대한 다형성 정보량 (Polymorphic Information Content ; PIC)는 [8, 이의 방법을 통해 산출하였다.
- 말 혈액 시료에서 genomic DNA의 분리와 정제는 MiUer 둥의 방법[기을 준용하여 수행하였다.
성능/효과
- 이러한 개체식별력의 추정통계량은 혈연관계가 없는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타내지 않은 확률을 나타내고 있으며 이는 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타낼 확률 추정치와 비교하였다. 5종의 좌위를 사용할 경우 서로 다른 개체가 동일한 유전자형을 나타낼 확률 주정치는 0.53 X 10-5이었으며 8종일 경우 0.40 X 10'8, 분석에 제시된 총 9종의 좌위를 동일성 검정을 위한 개체 식별 시스템에 활용할 경우 0.44 X IO, 의짝확률 값이 추정되었다. 이는 말의 집단 내 개체별 유전다형에 의한 유전 표지(microsatellite)를 활용한 짝 확률 값을 각각 0.
- 품종 특이성을 나타내는 분자표지의 대립유전자 발현 양상이 확인되었으며 이러한 품종 특이성 발현 분자 표지는 집단 내 개체에 대한 품종식별 유전자표지로 활용이 가능한 것으로 나타났다. 9종의 초위성 체 유전 표지를 활용할 경우 누적 개체식별력은 99.9%를 나타냈으며 두 마리의 서로 다른 개체가 서로 같은 유전자형을 가질 짝 확률은 0.60 X 10*으로 추정되었다. 따라서 9종의 선정된 유전표지는 제주마 품종 집단에서 적정 신뢰도를 제공할 수 있는 개체 식별 시스템을 설정할 수 있을 것으로 생각된다.
- 40 이상을 보이는 것으로 나타났다. ATH5의 경우를 보면 전체품종집단을 기준으로 보면 8종의 대립 유전자가 발현된 것으로 분석되었는데제주마 집단에서는 5종만이 출현됨을 확인하였으며 이중 134 대립유전자의 경우 발현빈도가 50%를 나타낸 반면 QUA 집단에서는 발현되지 않았으며 THO에서는 0.01, JRH에서는 0.11, MONG에서는 0.18로 나타났다. 다른 4품종 집단에서 발현이 확인된 136대립 유전자의 경우 제주마 집단에서는 전혀 발현되지 않는 것으로 분석되었다.
- 유전자 표지별이형접합도를 계산하였다. 개별적 유전자 좌위에 있어서 대립 유전자 수는 HMS6 좌위에서 7개로 가장 적었으며 ASB17에서는 가장 많은 16종의 대립유전자가 발견되었다. 전체 개체들의 유전적 다양성을 나타내는 유전자 좌위별 이형접합도는 0.
- 085의 출현 빈도를 보였다. 그러나 제주마 집단에서 가장 높은 출현 빈도를 보이고 있는 152 대립유전자의 경우 제주교잡마(제주마과더러브렛교잡) 종에서는 0.09, MONG에서는 Q.06, QUA에서는 0.05를 보였으며 대표적 외래품종 말인 THO에서는 나타나지 않는 것으로 분석되었다. 또한 집단 내 대립유전자 발현이 극단적 발현 양상을 보이는 몇몇 유전표지(MS)가 존재하였다.
- 18로 나타났다. 다른 4품종 집단에서 발현이 확인된 136대립 유전자의 경우 제주마 집단에서는 전혀 발현되지 않는 것으로 분석되었다. 이러한 결과를 통해 보면 품종발현 특이성이 존재하는 유전자 표지들을 활용할 경우 제주마나 기타 외래종 품종 집단에 대한 개체별 품종 식별의 가능성이 존재함을 알 수 있었다.
- 60 X 10*으로 추정되었다. 따라서 9종의 선정된 유전표지는 제주마 품종 집단에서 적정 신뢰도를 제공할 수 있는 개체 식별 시스템을 설정할 수 있을 것으로 생각된다.
- 전체 8종의 대립유전자 중 제주마 집단에서는 단 4종류만이 발현되었다. 또한 132좌 위의 경우 분석 대상 5품종 집단에서 가장 높은 대립 유전자 발현 양상을 보였으며 (JNH: 0.41, QUA: 0.46, JRH: 0.58, MONG: 0.58, THO: 0.34) 136대립 유전자 좌위는 JNH와 THO 품종집단에서는 발현이 확인되지 않은 반면에 QUA에서 매우 높은 0.23을 보였으며 다른 두 품종집단에서는 매우 낮은 발현빈도를 보였다.
- 분석에 사용된 13종 중 5종 이상이 품종별 대립유전자 발현양상이 품종에 따라 매우 상이하며 일부 대립 유전자들은 극단적인 발현 특성을 보였으며 이는 유전적 구조 및 조성이 매우 다르다는 것을 반증하는 결과라고 생각된다. 분석 대상좌위의 출현빈도는 분석에 공시된 품종별로 매우 상이한 출현 양상을 보인다는[13]이 보고한 결과와 대체적으로 유사한 경향 치를 보이고 있다.
- ATH5 좌위에 대한 품종별 대립유전자 발현 특성을 보면 전체 8종의 대립 유전자가 나타났다. 외래종말의 대표적 품종인 THO에서는 158 대립 유전자의 발현 빈도가 0.42로 매우 높은 출현 양상을 보였으며 몽고마종에서는 044, 미국 원산의 QUA종에서는 비교품종에서 가장 높은 대립 유전자 출현 양상인 0.55, 제주교잡마에서는 0.17로 분석되었다. 반면에 제주마 집단에서는 0.
- 공시재료로서는 5 품종에서 총 191 두가 사용되었으며 13종의 좌위에 대한 개체별 유전자형을 분석하였다. 이들 13종에서 출현된 총 대립유전자 수는 제주마의 경우 155종이 나타났다. 한국 제 주마 집단에서 나타난 평균 이형접합도는 0.
- 다른 4품종 집단에서 발현이 확인된 136대립 유전자의 경우 제주마 집단에서는 전혀 발현되지 않는 것으로 분석되었다. 이러한 결과를 통해 보면 품종발현 특이성이 존재하는 유전자 표지들을 활용할 경우 제주마나 기타 외래종 품종 집단에 대한 개체별 품종 식별의 가능성이 존재함을 알 수 있었다.
- 발현양상을 알 수 있다. 전체 8종의 대립유전자 중 제주마 집단에서는 단 4종류만이 발현되었다. 또한 132좌 위의 경우 분석 대상 5품종 집단에서 가장 높은 대립 유전자 발현 양상을 보였으며 (JNH: 0.
- 개별적 유전자 좌위에 있어서 대립 유전자 수는 HMS6 좌위에서 7개로 가장 적었으며 ASB17에서는 가장 많은 16종의 대립유전자가 발견되었다. 전체 개체들의 유전적 다양성을 나타내는 유전자 좌위별 이형접합도는 0.88-0.68로 나타났으며 매우 다양한 수준의 수치가 산출되어 친자 확인 또는 개체 확인을 위 해서는 다양성(이형접합도)이 높으며 적절한 대립 유전자의 발현 빈도를 보이는 좌위의 선택이 필요하다. 특히 제주마 집단에서 고도의 정확성이 높은 개체식별 시스템 설정을 위해서는 제주마 집단에서 이들 유전자 표지의 타 품종과의 차별적인 대 립 유전자 발현 특성을 확인해야 한다.
- Table 2에서 보면 분석된 제주마의 좌위들의 출현 대립 유전자 수는 최소 4 종에서 최고 10종까지 나타나고 있다. 전체 말 집단(5품종)에서 발현된 유전표지(MS)별 대립유전자수와 제주마 집단에서 발현된 대립유전자수는 다소 상이한 것으로 나타났으며 이는 품종별 유전적 특성이 이들 표지인자 발현 특성에 반영된 결과이다. 결국 제주마 집단의 유전적 특성을 반영한 개체식별 시스템 설정을 위해서는 출현된 대립유전자의 종류 및 분석이 가능한 적절한 유효 대립유전자 수(7-8개)를 가진 좌위를 선택할 필요가 있다.
- ATH5 좌위와 HMS7의 경우 다른 도입 4품종에서 비교적 다양성이 높은 것으로 추정되었지만 제주마 집단에서는 매우 낮은 다양성을 보였다. 즉 LEX33 좌위의 대립 유전자들이 발현 빈도가극단적인 양상을 보이고 있으며 출현된 대립 유전자의 경우도 매우 제한적인 것으로 나타났다. 이러한 양상은 CA425에서도 유사한 경향을 보이고 있으며 품종별로 유전자 표지 좌위들에 대한 대립 유전자들의 발현 특성이 상이한 것을 알 수 있었다.
- 1). 즉 분석 대상 유전표지별 집단 간 대립유전자 발현 양상을 비교해보면 특이한 집단별 품종 특이성을 발견할 수 있었다. ATH5 좌위에 대한 품종별 대립유전자 발현 특성을 보면 전체 8종의 대립 유전자가 나타났다.
- ATH4 좌위의 경우 제주마 집단에서는 5종의 대립 유전자가 고른 분포를 나타낸 반면 QUA종의 경우와 THO종집단에서 특정 좌위의 극단적 발현 빈도를 나타냈다. 품종 특이성을 나타내는 분자표지의 대립유전자 발현 양상이 확인되었으며 이러한 품종 특이성 발현 분자 표지는 집단 내 개체에 대한 품종식별 유전자표지로 활용이 가능한 것으로 나타났다. 9종의 초위성 체 유전 표지를 활용할 경우 누적 개체식별력은 99.
후속연구
- 감식기법이 채택되고 있다 [11]. 그러나 이 방법 역시 고가의 정교한 자동화된 분석 장비로부터 생산된 아날로그형 정보와 다시 이들 정보를 디지털 정보로 전환하여 최종 DNA profile을 형성하는 과정에서 해석상의 오류를 발생시키는 여러 요인이 잠재하고 있어 체계화되고 공인된 여러 실험실 간의 교차검증 시스템의 운용이 매우 중요하며 이해 당사자 간의 시시비비를 가릴 정도의 검정력 및 신뢰성을 얻기 위해서는 제주마 집단의 유전적 특성 및 개체식별을 가장 잘 표현할 수 있는 최적의 유전자 표지(MS)를 검증하고 이들을 다수 확보하여 이를 분석할 필요가 있다. 따라서 본 연구는제주마 집단과 외래품종 간 유전적 차별성을 분석하고 이에 근거한 제주마 집단에서 개체의 식별에 가장 적절한 유전자표지(&S)를 설정하고 혈통 확인을 위한 동일성 검증 및 친자감별을 위해 분석되는 유전자 표지에 따른 오류 확률을 통계적으로 해석하여 보다 효율적인 개체식별 체계 검증을 통한 유전자 감식시스템을 이용한 제주마 경마시스템의 적용모델을 제시하고자 실시하였다.
- 이러한 양상은 CA425에서도 유사한 경향을 보이고 있으며 품종별로 유전자 표지 좌위들에 대한 대립 유전자들의 발현 특성이 상이한 것을 알 수 있었다. 따라서 개체식별 체계에 활용될 수 있는 유전자표지는 품종 특이 발현 양상의 분석에 근거를 고려하여 선정하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
- 결국 더 많은 종류의 유전표지를 분석에 활용할 경우 개체식별력 즉 서로 다른 개체가동일 한 유전자형을 나타낼 확률값이 적어지지만 최적의 개체 식별 시스템의 설정을 위해서는 개체식별력이 높은 개별유전 표지를 최적화하여 설정하는 것이 바람직하다. 본 연구는 9종을 사용할 경우 제주마 집단을 전제로 할 때 비교적 합리적인 개체 식별 시스템이 설정될 것으로 예측된다.
- 따라서 개체식별을 위해서는 특정 품종에 대한 대립 유전자의 발현 빈도를 고려한 micro- sateUite 좌위의 선정이 매우 중요할 것으로 보인다. 이러한 품종 다양성을 나타내는 유전자 표지(MS)를 사용할 경우 개체식별을 위한 분자마커로써 중요한 수단을 제공함은 물론 집단 내 개체별 품종 식별을 가능하게 하는 보다 정확한 분자표지로써의 가능성을 제공할 수 있다는 점에서 매우 중요한계기를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
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