[국내논문]2주 동안의 톳 추출물 투여가 마우스의 비장세포와 Cytokine ($IL-1{\\beta}$, IL-6, $TNF-{\\alpha}$)의 생성량에 미치는 영향 Effect of Hizikia Fusiforme Water Extracts on Mouse Immune Cell Activation원문보기
생체 내 (in vivo) 실험에서 톳 추출물을 2주 동안 격일로 0, 50, 500 mg/kg B.W.의 농도로 마우스에 경구투여한 후 비장세포 증식능 및 복강 대식세포에서 분비하는 cytokine ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ 생성량을 검색한 결과 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W.의 농도에서 Con A나 LPS로 자극 시 대조군에 비해 높은 비장세포 증식능을 보였고 특히 50 mg/kg b.w. 농도로 투여한 군에서 비장세포 증식능이 최대를 나타내는 것을 알 수 있었다. 복강 대식세포에 의한 cytokine 생성량을 측정한 결과 LPS 첨가시 $IL-1{\beta}$의 분비량은 2주 경구 투여 시에 50 mg/kg B.W.의 농도군에서 가장 높은 생성량을 보였다. 이는 LPS를 투여한 군과 투여하지 않은 군에서 모두 동일한 경향을 보였다. IL-6 분비량은 LPS 첨가시 50 mg/kg B.W.의 농도 투여군에서 가장 높은 생성을 나타냈다. $TNF-{\alpha}$의 경우는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로 톳 열수 추출물은 대식세포의 활성화에 작용하여 사이토카인 생성을 증가시키는데 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측된다. 따라서 톳 추출물은 마우스 면역계의 조절기전에 작용하여 비장세포와 대식세포의 활성화를 유도함으로써 면역세포 활성을 직접적으로 촉진시키거나 또는 이와 관련된 다른 면역반응에 영향을 미침으로서 면역 활성에 효과적으로 작용할 가능성이 있으리라 사료된다.
생체 내 (in vivo) 실험에서 톳 추출물을 2주 동안 격일로 0, 50, 500 mg/kg B.W.의 농도로 마우스에 경구투여한 후 비장세포 증식능 및 복강 대식세포에서 분비하는 cytokine ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ 생성량을 검색한 결과 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W.의 농도에서 Con A나 LPS로 자극 시 대조군에 비해 높은 비장세포 증식능을 보였고 특히 50 mg/kg b.w. 농도로 투여한 군에서 비장세포 증식능이 최대를 나타내는 것을 알 수 있었다. 복강 대식세포에 의한 cytokine 생성량을 측정한 결과 LPS 첨가시 $IL-1{\beta}$의 분비량은 2주 경구 투여 시에 50 mg/kg B.W.의 농도군에서 가장 높은 생성량을 보였다. 이는 LPS를 투여한 군과 투여하지 않은 군에서 모두 동일한 경향을 보였다. IL-6 분비량은 LPS 첨가시 50 mg/kg B.W.의 농도 투여군에서 가장 높은 생성을 나타냈다. $TNF-{\alpha}$의 경우는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로 톳 열수 추출물은 대식세포의 활성화에 작용하여 사이토카인 생성을 증가시키는데 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측된다. 따라서 톳 추출물은 마우스 면역계의 조절기전에 작용하여 비장세포와 대식세포의 활성화를 유도함으로써 면역세포 활성을 직접적으로 촉진시키거나 또는 이와 관련된 다른 면역반응에 영향을 미침으로서 면역 활성에 효과적으로 작용할 가능성이 있으리라 사료된다.
Hizikia fusiforme(sea weed fusiforme) has long been used for food source in this country. This study was performed to evalute the immunomodulative effects of Hizikia fusiforme (sea weed fusiforme) in mouse, using in vivo experiments. In vivo experiment, different concentration (0, 50, 500 mg/kg B.W....
Hizikia fusiforme(sea weed fusiforme) has long been used for food source in this country. This study was performed to evalute the immunomodulative effects of Hizikia fusiforme (sea weed fusiforme) in mouse, using in vivo experiments. In vivo experiment, different concentration (0, 50, 500 mg/kg B.W.) of Hizikia fusiforme water extracts were orally administrated into mouse every other day for two weeks. The proliferation of mouse splenocytes, the production of three cytokines ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ secreted by activated macrophage. Splenocyte proliferation was enhanced in mouse orally administrated with 50 mg/kg B.W. and 500 mg/kg B.W. concentration compared to that of control group. Especially, the highest proliferation of spleoncyte was seen from the mouse orally administrated at the concentration of 50 mg/kg B.W. Also, the mouse of Hizikia fusiforme water extracts supplementation group in the both concentrations showed enhanced levels of cytokine production by activated peritoneal macrophages compared to those in control group. The highest level of cytokine ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ production was observed at 50 mg/kg B.W. supplementation group with LPS stimulation in all cases.
Hizikia fusiforme(sea weed fusiforme) has long been used for food source in this country. This study was performed to evalute the immunomodulative effects of Hizikia fusiforme (sea weed fusiforme) in mouse, using in vivo experiments. In vivo experiment, different concentration (0, 50, 500 mg/kg B.W.) of Hizikia fusiforme water extracts were orally administrated into mouse every other day for two weeks. The proliferation of mouse splenocytes, the production of three cytokines ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ secreted by activated macrophage. Splenocyte proliferation was enhanced in mouse orally administrated with 50 mg/kg B.W. and 500 mg/kg B.W. concentration compared to that of control group. Especially, the highest proliferation of spleoncyte was seen from the mouse orally administrated at the concentration of 50 mg/kg B.W. Also, the mouse of Hizikia fusiforme water extracts supplementation group in the both concentrations showed enhanced levels of cytokine production by activated peritoneal macrophages compared to those in control group. The highest level of cytokine ($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha})$ production was observed at 50 mg/kg B.W. supplementation group with LPS stimulation in all cases.
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문제 정의
미치는 영향을 관찰하고자 하였다. 2주간 격일로 톳 추출물을 경구 투여한 마우스의 비장세포 증식능, 활성 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인 (IL-L3, IL-6, TNF-a)생성량의 변화를 측정하여 톳 추출물이 마우스 면역 능에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
Ex vivo 실험에서 톳을 물 추출하여 실험동물에 2주간 직접 경구 투여함으로서 이들 시료가 마우스 생체 내에서면역능에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다. 2주간 격일로 톳 추출물을 경구 투여한 마우스의 비장세포 증식능, 활성 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인 (IL-L3, IL-6, TNF-a)생성량의 변화를 측정하여 톳 추출물이 마우스 면역 능에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 천연자원 식용 해조류인 톳의 면역 증강효과의 가능성을 알아보고자 다음과 같은 연구를 수행하였다.
톳 추출물의 경구투여가 마우스 비장세포 증식능, 복강대식세포에서 분비하는 사이토카인 (IL-ljS, IL-6, TNF-a) 생성량에 어떠한 영향을 미치는지 관찰함으로써 생체 내에서 톳 추출물의 면역활성 효과의 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
각 군별로 마우스 비장세포 현탁액을 5.0 X 106 cell/ml 이 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well에 90 “1씩 분주하고 각 군당 mitogen으로 ConA (5 "g/ml), LPS (15 “g/ml) 를 10 “1씩 분주하고 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다. 각 plate는 37°C, 5% CO2 incubator (Sanyo) 에서 44시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다 배양후 MTT를 10 “1 가하고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 다산.
본 실험에서는 톳 추출물의 경구투여가 마우스 비장세포 증식 능에 미치는 영향을 검색하기 위한 지표로 MTT assay를 이용하여 비장세포 증식능을 측정하였고, 이는 세포증식능측정 도구로서 가장 적합한 3H-thymidine uptake의 결과와 비교적 유사한 것으로 보고되고 있다.2-® 그 결과는 Table 1, 2에 나타내었다.
1의 방법으로 제조하였다. 동결 건조된 시료를 증류수 또는 에탄올로 환류 냉각시키면서 80°C 수욕 상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 물 추출물과 에탄올 추출물을 얻었다. 이중에서 일반적으로 먹는 형태인 물 주줄물을 경구 투여 시료로 이용하였다.
비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640 900 “1와 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100 间 가한 후 37°C, 5% CO2 incubator (Sanyo) 에서 48시간 배양하였다. 배양 상층 액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-18, IL-6, TNF-a의 양을 ELISA 사이토카인 kit (R&D system, USA) 를 이용하여 측정하였다理
본 실험에서는 톳 추출물을 50 mg/kg B.W./day와 500 mg/kg B.W./day의 농도로 경구투여한 마우스로부터 복강대식세포를 분리해 낸 다음 활성화된 대식세포가 생성해낸 IL-16, IL-6, TNF-a의 분비량을 측정하였고 각 군별 양의 대조군으로는 LPS (15 mg/ml) 로 자극한 대식세포로부터 분비된 사이토카인을 측정힘.으로서 대식세포의 활성화에 대한 지표로 삼았다.
비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640 900 “1와 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100 间 가한 후 37°C, 5% CO2 incubator (Sanyo) 에서 48시간 배양하였다. 배양 상층 액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-18, IL-6, TNF-a의 양을 ELISA 사이토카인 kit (R&D system, USA) 를 이용하여 측정하였다理
실험 동물실 온도는 22 ± 2°C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
2) 에 5분간 현탁 시켜 적혈구를 제거하였다. 위의 세포는 다시 RPMI로 2회 원심 세척한 다음, 10%-FBS RPMI 1640으로 5.0 x 106 cell/ml의 농도로 희석하여 96-well plate에 90 “1씩 분주한 후 세포 증식능 측정에 사용하였다.
톳 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인 (IL-16, IL-6, TNF-a) 분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640 900 “1와 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100 间 가한 후 37°C, 5% CO2 incubator (Sanyo) 에서 48시간 배양하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse 를 (주)대한실험동물센터로부터 분양받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22 ± 2°C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
人!용하였고, fetal bovine serum (FBS), lipopolysaccharide (LPS), concanavalin A (ConA), thioglycollate, sodium bicar bonate, ammonium chloride, TRIZMA®base, TRIZMA® hydrochloride, trypan blue solution (0.4%), DMSO (dimethyl sulfide), 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
동결 건조된 시료를 증류수 또는 에탄올로 환류 냉각시키면서 80°C 수욕 상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 물 추출물과 에탄올 추출물을 얻었다. 이중에서 일반적으로 먹는 형태인 물 주줄물을 경구 투여 시료로 이용하였다.
데이터처리
2) Means with different letters (a, b, c) are significantly different from each other at a = 0.05 as determined by Duncan's multiple range test (a > b > c).
3) Values are not significantly different by Duncan,s multiple range test.
각 군간의 평균치의 차이는 분산분석 (Analysis of Variance, AN0VA)및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a =0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
모든 실험결과의 자료는 SAS (Statistic Analysis Sys tem) 통계 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 각 군간의 평균치의 차이는 분산분석 (Analysis of Variance, AN0VA)및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a =0.
이론/모형
마우스 비장세포의 분리는 Mishell 등獄의 방법에 의해 실행하였다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 용액으로 씻은 다음 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다.
성능/효과
2에 나타내었다. 2 주 투여의 결과 LPS로 처리하지 않은 경우 50 mg/kg B.W.의 농도에서 32.47 ± 1.23 pg/ml로 대조군 (29.48 ± 1.30 pg/ml) 에 비해 유의적으로 높은 생성을 보였고 반면 500 mg/kg B.W. 농도에서는 20.52 ± 0.71 pg/ml로 대조군에 비해 낮은 생성량을 나타냈다. LPS 처리에 의한 영향도 50 mg/kg B.
4에 나타내었다. 2주 투여군을 살펴보면 LPS로 처리하지 않은 경우 50 mg/kg B.W과 500 mg/kg B.W. 농도에서 대조군보다 유의적으로 낮은 생성을 보였고 LPS 처리에 의한 영향도 같은 경향이었다. 다른 연구의 결과에 따르면 Hizikia 仙啊wie 와 Meristotheca papulosa 의 에탄올 주줄 물로부터 분리한 분자량 100 kDa의 다당류가 cytotoxic T-cell (272%, 239%)과 면역글로불린 (440%, 200%), TNF의 분비 (68%, 160%)를 증가시켰다는 보고가 있다.
3에 나타내었다. 2주 투여군의 결과, LPS로 처리하지 않은 경우 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W. 농도에서 대조군보다 낮은 생성을 보였다. LPS 첨가시에는 50 mg/kg B.
71 pg/ml로 대조군에 비해 낮은 생성량을 나타냈다. LPS 처리에 의한 영향도 50 mg/kg B.W.의 농도에서 964.96 ± 10.25 pg/ ml로 대조군 (875.30 ± 11.32 pg/ml) 에 비해 유의적으로 높은 생성을 보였고 500 mg/kg B.W.의 농도에서는 719.89 ± 9.04 pg/ml로 대조군에 비해 낮은 생성량이 관찰되었다. 해조류의 하나인 다시마 섭취에 대한 연구에 따르면 정상과 당뇨 마우스 대식세포의 cytokine 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 섬유소 (cellulose)를 함유하는 대조식이와 다시마를 첨가하는 실험식이군의 복강 대식세포로부터 IL-16 와 TNF-a 생성능을 측정한 결과 다시마 섭취군에서 IL-16분비가 50% 정도 높게 나타나 다시마 식이가 마우스의 복강 대식세포를 활성화시키는 것으로 보고하였다.
이상의 결과 톳 추출물을 경구 투여한 마우스 복강 대식세포의 IL-16, IL-6, TNF-a 생성이 사이토카인 종류에 따라 다소 차이를 보이기는 하지만 LPS 자극에 의해 증가되었는데, 이는 LPS 자극으로 대식세포의 C3 수용체에 작용하여 체내를 보호하려는 기전构에 의한 것으로 생각된다. LPS로 자극하지 않은 경우는 대조군에 비해 낮은 생성 능을 보이거나 큰 차이를 나타내지 않았으나 대내외적 자극에 의한 면역체계 활성화를 알아보기 위해 LPS를 첨가하여 톳 추출물의 면역 활성을 본 결과에서는 50 mg/kg B.W.의 농도에서 높은 활성을 나타냈다. 이는 톳 추출물 섭취에 의해 면역 활성을 잠재적으로 가지고 있다가 항원 (외부물질) 침입시 톳 추출물이 면역세포의 활성화에 작용하여 면역기능에 영향을 미치는 것으로 사료되며, 보다 더 다양한 사이토카인에 대한 연구가 함께 이루어져야 할 것으로 사료 된다.
해조류의 하나인 다시마 섭취에 대한 연구에 따르면 정상과 당뇨 마우스 대식세포의 cytokine 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 섬유소 (cellulose)를 함유하는 대조식이와 다시마를 첨가하는 실험식이군의 복강 대식세포로부터 IL-16 와 TNF-a 생성능을 측정한 결과 다시마 섭취군에서 IL-16분비가 50% 정도 높게 나타나 다시마 식이가 마우스의 복강 대식세포를 활성화시키는 것으로 보고하였다.⑫ 따라서 본 실험의 톳 추출물을 경구 투여한 마우스의 대식세포에서 IL-16 분비량이 50 mg/kg B.W. 의 농도에서 대조군에 비해 유의적으로 증가되어 톳 추출물이 마우스의 복강 대식 세포를 활성화하여 IL-18 생성을 촉진시킴으로서 면역증강에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.
농도로 투여한 군에서 비장 세포 증식 능이 최대를 나타내는 것을 알 수 있었다. 복강 대식세포에 의한 cytokine 생성량을 측정한 결과 LPS 첨가시 IL-1B 의 분비량은 2주 경구 투여 시에 50 mg/kg B.W.의농도군에서 가장 높은 생성량을 보였다. 이는 LPS를 투여한 군과 투여하지 않은 군에서 모두 동일한 경향을 보였다 IL-6 분비량은 LPS 첨가시 50 mg/kg B.
생체 내 (、说 vivo) 실험에서 톳 추출물을 2주 동안 격일로 0, 50, 500 mg/kg B.W.의 농도로 마우스에 경구투여한 후 비장세포 증식능 및 복강 대식세포에서 분비하는 cytokine (IL-侦, IL-6, TNF-a) 생성량을 검색한 결과 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W.의 농도에서 Con A나 LPS로 자극 시 대조군에 비해 높은 비장세포 증식능을 보였고 특히 50 mg/kg b.w. 농도로 투여한 군에서 비장 세포 증식 능이 최대를 나타내는 것을 알 수 있었다. 복강 대식세포에 의한 cytokine 생성량을 측정한 결과 LPS 첨가시 IL-1B 의 분비량은 2주 경구 투여 시에 50 mg/kg B.
6%의 종양 성장 저지율을 보였다고 보고하였다. 이러한 결과는 50 mg/kg B.W. 농도군의 톳 추출물이 마우스의 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6의 생성을 촉진시킴으로서 면역기능 증강에 효과적으로 작용할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
期 본 연구 결과에서 보여준 TNF-a 생성의 결과와는 차이를 보이고 있다. 이상의 결과 톳 추출물을 경구 투여한 마우스 복강 대식세포의 IL-16, IL-6, TNF-a 생성이 사이토카인 종류에 따라 다소 차이를 보이기는 하지만 LPS 자극에 의해 증가되었는데, 이는 LPS 자극으로 대식세포의 C3 수용체에 작용하여 체내를 보호하려는 기전构에 의한 것으로 생각된다. LPS로 자극하지 않은 경우는 대조군에 비해 낮은 생성 능을 보이거나 큰 차이를 나타내지 않았으나 대내외적 자극에 의한 면역체계 활성화를 알아보기 위해 LPS를 첨가하여 톳 추출물의 면역 활성을 본 결과에서는 50 mg/kg B.
TNFH? 의 경우는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로 톳 열수 추출물은 대식세포의 활성화에 작용하여 사이토카인 생성을 증가시키는데 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측된다. 따라서 톳 추출물은 마우스 면역계의 조절기전에 작용하여 비장 세포와 대식세포의 활성화를 유도함으로써 면역세포 활성을 직접적으로 촉진시키거나 또는 이와 관련된 다른 면역반응에 영향을 미침으로서 면역 활성에 효과적으로 작용할 가능성이 있으리라 사료된다.
투여군에서 가장 높은 증식능을 보였다. 체액성 면역과 관련이 있는 B세포를 선택적으로 증식시키는 mitogen 인 LPS 첨가시 50 mg/kg B.W./day와 500 mg/kg B.W./ day 투여군에서 대조군 보다 높은 증식능을 보였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
2-® 그 결과는 Table 1, 2에 나타내었다. 톳 추출물을 2주 투여한 경우 500 mg/kg B.W과 50 mg/kg B.W. 투여군 모두 1.51 ± 0.06-2.65 ± 0.21 로 대조군 보다 유의적으로 높은 증식 능을 보혔으며 특히 50 mg/kg B.W. 투여군에서 가장 높은 증식능을 보였다. 동일한 시료를 통한 비교가 아닌 제한점이 있지만 다른 비장세포 증식능 연구에 따르면 생강 물 추출물을 4주 투여한 경우 50 mg/kg B.
후속연구
이상의 결과로 톳 열수 추출물은 대식세포의 활성화에 작용하여 사이토카인 생성을 증가시키는데 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측된다. 따라서 톳 추출물은 마우스 면역계의 조절기전에 작용하여 비장 세포와 대식세포의 활성화를 유도함으로써 면역세포 활성을 직접적으로 촉진시키거나 또는 이와 관련된 다른 면역반응에 영향을 미침으로서 면역 활성에 효과적으로 작용할 가능성이 있으리라 사료된다.
의 농도에서 높은 활성을 나타냈다. 이는 톳 추출물 섭취에 의해 면역 활성을 잠재적으로 가지고 있다가 항원 (외부물질) 침입시 톳 추출물이 면역세포의 활성화에 작용하여 면역기능에 영향을 미치는 것으로 사료되며, 보다 더 다양한 사이토카인에 대한 연구가 함께 이루어져야 할 것으로 사료 된다.
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