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문제 정의
- 따라서, 염증성 장질환의 개선은 일차적으로 장내 미생물 총의 개선에 의해 이루어 질 수 있다. 본 연구는 장관 내 미생물총 및 염증성 질환의 개선에 대한 오미자 추출물의 유효성을 분석, 검증하기 위하여 in vitro 배양 실험을 시행하였다. 그러나, 동물의 장관 내 세균들은 상호 유기적으로 공생의 관계를 유지하고 있고, 일부의 균종은 단독배양이 어렵고, 일부 종은 단독 배양 시 특정 선택배지를 사용하여야 하는 등의 in vitro 배양 실험의 단점을 인체 분변의 미생물 총의 변화실험을 병행하여 보완하였다.
- Schizandra chinensis 열매는 다양한 스트레스성 질환의 치료에 사용되어온 전통 약재이다. 본 연구는 장관 내 미생물총 및 염증성 질환의 개선에 대한 오미자(Schizandrae fructus) 효소 가수분해물(SC-EX)의 유효성을 분석, 검증하기 위하여 in vitro 실험을 시행하였다. 효소 추출물의 총 lignan의 함량은 0.
- 으로 전환하는 효소인 cyclooxygenase(COX, EC 1,14,99,1)활성에 대한 SC-EX의 5% 첨가 시각가 95%의 효소 활성이 저해되었다. 이 결과는 앞의 5- LOX의 결과와 일치하는 것으로 오미자 추출물이 arachidonic acid 대사 경로의 길항 작용하는 것을 반증하는 것이다. 이는 저분자의 유기산이 COX와 LOX의 활성 모두를 저해하였다는 Whitehouse의 보고와 같은 결과를 나타내었다.
제안 방법
- β-Glucuronidase의 활성 측정은 Fluor beta-glucuronidase reporter assay kit를 시용하여 측정하였다.
- 13) 앞에서 만든 분변 희석액을 4℃에서 30초간 초음파 처리후 원심분리하여(10,000×g, 10 min) 상등액 1 ml를 취하여 여러 농도의 SC-EX와 37℃ 10분간 전반응 시킨후 kit를 이용하여 잔존 효소 활성을 측정하였다.
- Cyclooxygenase-2의 활성은 1분 동안 1 µM의 NNN'N'-tetramethyl-p-Phenylenediamine dichloride를 산화시키는데 필요한 효소양으로 정하고 흡광도 변화에서 unit 산출은 다음과 같은 공식을 사용하였다.
- 0 g, NaHCO3 10 g, NaCl2 g in 1000 ml distilled water)40 ml L-Cystain HCl.H2O 0.5 g, glucose 10 g, D.W 920 ml)이 함유된 액체배지에 SC-EX(0~5%)를 접종하고 표준 균주를 각각 4%씩 접종한 후 37에서 48시간 동안 혐기 배양하면서 12시간 간격으로 생균수와 pH를 측정하면서 균의 성장 정도와 산의 생성 정도를 판정하여 장내 세균에 대한 오미자 추출물의 활성도를 측정하였다.
- 6 × 250 mm, WAT044355) 및 RI Detector(Shodex RI 71)를 이용하여 HPLC(Jasco Co, Japan)로 측정하였다. 고형분의 함량은 감압농축기를 이용하여 감압 농축 후 동결 건조하여 무게를 측정하였다. 또한 유기산의 분석은 동결 건조된 시료 1g을 정확히 취하여 Bio-Rad Aminex HPX-87H(Ion-Exclusion, 7.
- 본 연구는 장관 내 미생물총 및 염증성 질환의 개선에 대한 오미자 추출물의 유효성을 분석, 검증하기 위하여 in vitro 배양 실험을 시행하였다. 그러나, 동물의 장관 내 세균들은 상호 유기적으로 공생의 관계를 유지하고 있고, 일부의 균종은 단독배양이 어렵고, 일부 종은 단독 배양 시 특정 선택배지를 사용하여야 하는 등의 in vitro 배양 실험의 단점을 인체 분변의 미생물 총의 변화실험을 병행하여 보완하였다. 또한 인체 백혈구를 이용하여 염증 매개 물질 LTB4 및 기염 물질인 PGs의 생성 효소 5-lipoxygenase와 cyclooxygenase 및 조직 파괴 효소인 collagenase의 활성 저해 효과를 통하여 효소학적으로 규명하였다.
- 또한 유기산의 분석은 동결 건조된 시료 1g을 정확히 취하여 Bio-Rad Aminex HPX-87H(Ion-Exclusion, 7.8 × 300 mm, # 125-0140) column 및 UV Detector를 이용하여 HPLC (Specta SYSTEM(TSP)) 로 분석하였다.
- 그러나, 동물의 장관 내 세균들은 상호 유기적으로 공생의 관계를 유지하고 있고, 일부의 균종은 단독배양이 어렵고, 일부 종은 단독 배양 시 특정 선택배지를 사용하여야 하는 등의 in vitro 배양 실험의 단점을 인체 분변의 미생물 총의 변화실험을 병행하여 보완하였다. 또한 인체 백혈구를 이용하여 염증 매개 물질 LTB4 및 기염 물질인 PGs의 생성 효소 5-lipoxygenase와 cyclooxygenase 및 조직 파괴 효소인 collagenase의 활성 저해 효과를 통하여 효소학적으로 규명하였다.
- Staphylococcus, Lactobacillus sp. 및 E.coli등 표준군주들을 대조구와 SC-EX(0~5%)이 첨가된 PYF 액체 배지에 각각 4%씩 접종하고 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양하면서 12시간 간격으로 생균수를 측정한 결과 Fig. 2와 3에 나타내었다.
- 5~5%)의 SC-EX를 첨가하고 37℃, 5분간 방치한 후 여기에 10 µl의 20 mM NNN'N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dichloride 및 10 µl의 arachidonic acid를 넣고 610 nm에서 흡광도의 변화 속도를 측정하였다. 비 특이적인 흡광도 변화는 위의 반응 혼합물 중에서 arachidonate를 제외한 효소 반응으로 측정 하여 이것을 보정해 주었다.
- 슈잔드린의 함량은 Waters High Performance Carbohydrate Column(4 µm Nova-pak, 44.6 × 250 mm, WAT044355) 및 RI Detector(Shodex RI 71)를 이용하여 HPLC(Jasco Co, Japan)로 측정하였다.
- 장내 미생물의 혼합배양에 미치는 영향 − SC-EX의 장내 미생물의 혼합 배양에 미치는 영향을 측정하기 위하여 PYF 액체배지를 혐기성 희석액으로 사용하여, 분변을 1/100배로 희석한 후, 이 혼탁액을 종균으로 사용하여 SC-EX(0~5%)가 첨가된 배지에 각각4% 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 주요 미생물의 선택배지에 도말하여 생균수를 측정하였다.
- 주요 장내 미생물의 단독배양에 미치는 영향 − SC-EX의 주요 장내 미생물의 생육에 미치는 영향을 측정하기 위하여 Bifidobacterium 4종(B. animalis ATCC 11209, B. bifidum ATCC 29521, B. infantis ATCC 11207, B. longum ATCC 11963), Clostridium 4종(C. butyricum ATCC 19398, C. paraputricum ATCC 25780, C. perfringens ATCC 13124, C. ramosum ATCC 25582), Lactobacillus 3종 (L. acidophilus ATCC 32820, L. brevis ATCC 3102, L. plantarum ATCC 14917) 및 Bacteroides fragilis ATCC 25285, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Escherichia coli ATCC 11775, Staphylococcus aureus ATCC 12800, Streptococcus faecalis ATCC 18433 등을 표준 균주로 사용하여 Yeast extract 10 g, Proteose peptone 5 g, Trypticase peptone 5 g, filds solution(MIx 150 ml of saline, 6 ml cHCl, 50 ml serum and pepsin, overnight at 55℃, Fix pH 7.6 with 20% NaOH solution and filtrate it) 40 ml, salt solution(. Dissolve CaCl2·2H2O 0.204 g, MgSO4·7H2O 0.48 g, K2HPO4 1.0 g, KH2PO4 1.0 g, NaHCO3 10 g, NaCl2 g in 1000 ml distilled water)40 ml L-Cystain HCl.
- 오미자의 효소가수분해 및 성분분석 − 전북 장수에서 구입한 신선한 Schizandra fructus(SC-EX) 100 g을 분쇄하여 당 연구실에서 분리 보관중인 Aspergillus oryze유래의 pectinase를 첨가하여 40℃ 12시간 반응 하여 상등액을 분리하고, 동결 건조 분말화하여 시료로 사용하였다. 추출의 수율은 고형분 및 슈잔드린의 함량으로 측정하였다.
- 효소의 활성은 생성된 aminobenzoic acid의 양으로 측정하였으며 시간당 1 µg의 aminobenzoic acid를 생산하는 효소의 양으로 표시하였다.
대상 데이터
- coli는 Endo agar, Lactobacillus sp.는 MRS agar를 사용하였으며, Clostridium sp는 Clostridial Differential agar를 사용하였다. 또한 Staphylococcus sp.
- 오미자의 효소가수분해 및 성분분석 − 전북 장수에서 구입한 신선한 Schizandra fructus(SC-EX) 100 g을 분쇄하여 당 연구실에서 분리 보관중인 Aspergillus oryze유래의 pectinase를 첨가하여 40℃ 12시간 반응 하여 상등액을 분리하고, 동결 건조 분말화하여 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 5-lipoxygenase와 Cyclooxygenase-2 저해효과 − 5-lipoxygenase와 Cyclooxygenase-2 저해효과의 측정에 사용된 사람의 백혈구는Garcia 등15)의 방법에 준하여 추출하였다.
- 8% NH4Cl 용액 1 ml를 첨가하여 용해시키고, 동일 조건에서 다시 원심 분리하여 백혈구를 모으고 phosphate-buffered saline(PBS)에 재현탁하여 보관하면서, 사용 직전 세포 농도를 5×106 cell/ml로 조절하여 사용하였다. SC-EX의 백혈구 균질화 세포의 5-lipoxygenase (EC 1,13,11,34)활성에 미치는 저해 효과를 Hernandez 등의 방법에 준하여 측정하였다. 사람의 전혈에서 추출한 백혈구 세포(2×107 cell/ml)는 냉장 반응조 내에서 온도의 상승을 방지하면서 초음파 분쇄(3 time×5 sec)시켜 균체를 파쇄 하였다.
- pH는 pH측정기를 사용하여 측정하였고, 산도는 소비된 0.1 N NaOH 적정량으로 계측하였으며, 당의 함량은 페놀황산법을 이용하여 측정하였다. 조단백질 및 조지방의 함량은 기품공전 일반 시험법에 준하여 측정하였으며, 색도는 색도계를 이용하여 L,a,b값을 측정하였다.
- 전 반응 후 20 µM의 arachidonic acid를 첨가하고 5분간 반응 후, 생성되는 과산화수소의 양을 500 nm에서 비색 정량 후, 표준곡선으로부터 구하였다. 또한Cyclooxygenase-2(EC 1,14,99,1)의 활성은 Collier16)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 100 µl의 백혈구파쇄액, 10 µl의 20 µM hematin, 100 µl의 시료 및 0.
- Nitroreductase는 β-Glucuronidase와 같이 장내 세균에 의해 생성 되는 효소로 장관내 각종 질환에 핵심적 역할을 하는 알려져있다. 이 효소는 혐기적 상태에서 활성을 나타내는 효소로 분변 채취 후 4시간 이내에 Rowland의 방법에 준하여 측정하였다.14) nitroreductase반응액(1.
- 1 N NaOH 적정량으로 계측하였으며, 당의 함량은 페놀황산법을 이용하여 측정하였다. 조단백질 및 조지방의 함량은 기품공전 일반 시험법에 준하여 측정하였으며, 색도는 색도계를 이용하여 L,a,b값을 측정하였다. 슈잔드린의 함량은 Waters High Performance Carbohydrate Column(4 µm Nova-pak, 44.
성능/효과
- 이들이 생산하는 다양한 대사산물이 인간과 동물의 건강과 질병에 직접적인 영향을 미친다.1) 장내 세균 총을 구성하는 세균들은 유익 및 유해세균으로 구분된다. Lactobacilli 등의 유익세균은 외부로부터 유입되는 병원성 미생물의 침입을 막는 장벽으로 작용하게 되고 이를 colonization resistant라 한다2).
- 5와 같다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 5-lipoxygenase pathway의 효소 복합체중 5-lipoxygenase에 직접적으로 저해하여 3% 첨가 시 63% 효소활성이 저해되었으며, 5% 첨가 시 76%의 효소활성이 저해되었다. 이 결과로부터 SC-EX이 arachidonic acid 대사를 길항 저해함으로써 염증성 매개 물질인 LTB4의 생합성을 저해하는 것으로 판단된다.
- 그림에서 보는 바와 같이 Clostridium sp. Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus, pedicoccus cerevisiae, Bacteroid fragilis, Eubacterium limosum, Enterococcus faecalis 및 E. coli 모두 SC-EX의 첨가 농도에 따라 균의 생육이 확연히 감소하는 것을 확인하였다. 또한 3% 및 5%의 첨가시 균의 생육이 급격히 감소하여 배양 48시간 후 거의 사멸하는 것을 확인하였다.
- 또한, Sator 등5)은 궤양성 대장염과 크론병을 포함한 염증성 장질환의 발생에 있어서 장내 세균이 중심적 역할을 한다고 보고하였다. 그 근거로는 첫째, 장내세균이 많은 위치에서 염증성 장질환이 발생하고, 둘째, 병변의 부위가 지속적으로 대변에 노출시 질환의 활성이 증가하고, 셋째, 실험동물의 이용 시 장내세균이 없으면 염증반응이 시작되지 않는다는 점이다. 장관 내에서 염증을 유발하는 유해균의 증식은 유익균의 축소에 의해 가장 빈번하게 나타난다.
- 따라서, SC-EX는 E.coli를 비롯한 G(-) 유해세균에 대하여 항균활성을 나타내는 과량의 malic acid, lactic acid, tartaric acid및 sucssinic acid를 함유하고 있으며, 젖산균의 성장에 직접적 영향을 미치는 citric acid를 함유하고 있음으로써 장관 미생물에 대하여 선택적 생육저해 및 생육 증식 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
- coli 모두 SC-EX의 첨가 농도에 따라 균의 생육이 확연히 감소하는 것을 확인하였다. 또한 3% 및 5%의 첨가시 균의 생육이 급격히 감소하여 배양 48시간 후 거의 사멸하는 것을 확인하였다. 그 중 Clostridium sp.
- 또한 당함량은 4% 였으며, 유리당의 조성은 Fructose, Glucose, Sucrose 및 Maltose가 주성분으로 각각 5.83, 4.30, 0.35 및 0.90 ppm이 함유되어 있었다. 이 결과로부터 오미자의 단맛을 나타내는 주성분은 fructose임을 확인 할 수 있었다(data not shown).
- 또한, PGs 합성의 율속 단계를 촉매 하는 효소로 arachidonic acid를 PGs H1으로 전환하는 효소인 cyclooxygenase(COX, EC 1,14,99,1)활성에 대한 SC-EX의 5% 첨가 시각가 95%의 효소 활성이 저해되었다. 이 결과는 앞의 5- LOX의 결과와 일치하는 것으로 오미자 추출물이 arachidonic acid 대사 경로의 길항 작용하는 것을 반증하는 것이다.
- 10%에 비해 월등히 우수한 추출 수율을 나타내어 보다 효율적인 추출방법 임을 확인하였다. 또한, SC-EX의 유기산을 분석한 결과, Fig. 1과 같이 주된 유기산은 citric acid, lactic acid, malic acid 및 shikimic acid로그 함량은 각각 36.35, 14.17, 9.84, 4.50 (g/kg)이였으며, 소량의 tartaric acid (1.83 g/kg)이 함유되어있는 반면, acetic acid및 succinic acid와 maleic acid과 같이 직접적으로 맛에 영향을 미치는 유기산의 함량이 상대적으로 낮은 특성을 나타내었다.
- 또한, 장관내 염증 및 암의 발생에 관여하는 β-Glucuronidase 및 Nitroreductase 5%의 SC-EX을 첨가 시 각각 70% 및 85%의 활성이 저해 되었다.
- 염증유발효소인 사람의 PMNL 5-lipoxygenase 및 cyclooxygenase-2 활성은 3% 첨가 시 63% 효소활성이 저해되었으며, 5% 첨가 시 76%의 효소활성이 저해되었다. 이상의 결과로부터 Schizandra chinensis 효소추출물은 장내세균 총의 선택적 개선 효과 및 염증 발병 및 진전의 저해효과를 확인하였다.
- 의 경우 3%첨가 시 균의 생육이 급격히 증가하였다. 이 결과는 단독 배양시 1%농도에서 가장 우수한 생육을 보인 결과에 비해 고농도의 추출물에서 균의 생육이 증가됨을 확인 할 수 있었으며, 이는 균주 상호간의 작용에 의한 것으로 판단된다. 그러나 Bifidobacterium sp.
- 반면 5%의 고농도 첨가시 오히려 균의 성장이 저해되는 결과를 보였다. 이 결과로부터 SC-EX는 균종에 따라 선택적 증식 및 저해 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 5에서 보는 바와 같이 5-lipoxygenase pathway의 효소 복합체중 5-lipoxygenase에 직접적으로 저해하여 3% 첨가 시 63% 효소활성이 저해되었으며, 5% 첨가 시 76%의 효소활성이 저해되었다. 이 결과로부터 SC-EX이 arachidonic acid 대사를 길항 저해함으로써 염증성 매개 물질인 LTB4의 생합성을 저해하는 것으로 판단된다.
- 염증유발효소인 사람의 PMNL 5-lipoxygenase 및 cyclooxygenase-2 활성은 3% 첨가 시 63% 효소활성이 저해되었으며, 5% 첨가 시 76%의 효소활성이 저해되었다. 이상의 결과로부터 Schizandra chinensis 효소추출물은 장내세균 총의 선택적 개선 효과 및 염증 발병 및 진전의 저해효과를 확인하였다. 이를 통하여 장 기능 개선 효과를 갖는 다양한 기능성 소재의 개발에 이용 할 수 있을 것이다.
- 의 lactic acid 생성 미생물의 성장은 저농도의 SC-EX의 첨가시 촉진시키는 것으로 나타났다. 첨가농도에 비례하여 lactic acid 생성 미생물의 성장이 증가하여, 균종에 따라 1%~3%의 첨가시 생육이 급격히 증가함을 보였다. 반면 5%의 고농도 첨가시 오히려 균의 성장이 저해되는 결과를 보였다.
후속연구
- 29) Gunning 등30) 및 Ghosh-Myers 등31)은5-lipoxygenase의 활성 저해 물질이 폐암 및 전립선암 세포의 성장을 저해하였다고 보고하는 등, 다양한 보고를 기준으로 본 연구에 이용된 SC-EX는 염증의 진전은 물론 암의 진전에도 유용한 효과를 얻을 수 있을 것으로 예상된다.
- 이상의 결과로부터 Schizandra chinensis 효소추출물은 장내세균 총의 선택적 개선 효과 및 염증 발병 및 진전의 저해효과를 확인하였다. 이를 통하여 장 기능 개선 효과를 갖는 다양한 기능성 소재의 개발에 이용 할 수 있을 것이다.
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