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문제 정의
- 이에 본 실험에서는 전보8)에서 DDB 복합제제인 DMP-04의 투여로서 사염화탄소에 의한 간 독성 경감 작용이 있음을 관찰하고서 실험동물을 이용하여 임상에서 약물의 투여의 기초자료를 제공하기 위하여 OTC로서 널리 해열진통제로 사용되고 있는 AAP의 해독계에 DWP-04가 미치는 영향을 관찰하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
- 19,20) 혈청 aminotran- sferase는 간세포의 변성이나 괴사를 반영하는 효소로서 잠재성 간장애의 분류 및 급성 간염 발병의 조기진단에 필수적인 요소로서 간 조직 손상이 다량 혈중으로 유출되어 그 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다.21) 본 실험에서 DWP-04의 투여로 AAP에 의해 유도된 본효소의 활성이 억제되는 것은 이들이 AAP에 의한 간 조직의 손상이나 간 세포막을 안정시켜서 나타나는 결과로 사료되어진다.
제안 방법
- Acetamino-phen(AAP)의 투여는 400mg/kg을 하루에 한 번씩 1주간 경구투여하고 나머지 2주 동안은 DWP-04는 2% Tween 80에 현탁(50, 100, 200mg/kg)시켜 동시에 투여하였다. 즉 AAP의 투여는 3주간 하였다.
- Aspartate/alanine aminotransferase (AST/ALT)의 분석은 Clinical Spectrophotometer(Shimadzu, CL-770, Japan)을 사용하였다. 체혈을 마친 실험동물에서 간을 적출하여 간 조직을 관류하여 간조직에서 혈액을 제거한 간 조직에서 thiobar bituric acid reactive substances(TBARS)의 함량즉정은 Buege와 Aust의 방법,9) Glutathione(GSH)의 함량측정은 Griffith의 방법10)에 준하였다.
- 즉 AAP의 투여는 3주간 하였다. 대조군은 동일량의 1% tween 80 을 투여하였다. 실험동물은 실험전 24시간 물만 주고 절식시켰다.
- Acetamino-phen(AAP)의 투여는 400mg/kg을 하루에 한 번씩 1주간 경구투여하고 나머지 2주 동안은 DWP-04는 2% Tween 80에 현탁(50, 100, 200mg/kg)시켜 동시에 투여하였다. 즉 AAP의 투여는 3주간 하였다. 대조군은 동일량의 1% tween 80 을 투여하였다.
- 지질과 산화물의 함량에 미치는 영향- AAP 및 DDB혼합제제인 DWP-04를 동시에 실험동물에 경구투여하고서 AAP 처리로 의해 실험동물에 대한 간 조직 중의 지질과산화 함량변화를 실험한 결과가 Fig. 2와 같다. 정상 쥐에 AAP를 투여함으로써 과산화물이 현저히 증가되던 것이 DVP-04의 투여에 의해 현저히 감소하였다.
- 혈액 및 간 조직에서의 변동- 혈청생화학적 검사는 실험동물을 CO2 gas로 마취하여 개복하고 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액을 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하였으며, 이를 -20℃에 즉시 보관하여 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 시료 제조 -DWP-04는 DDB, Glutathione, Selenium 을 31.1 : 62.1 : 6.8% 비율로 혼합하여 사용하였으며 각각의 시료는 대우약품에서 공급받아 사용하였다.
- 시약 및 기기 一 Bovine serum albumin, NADPH, GSH (reduced & oxydized form of glutathione), TCA(trichloro acetic acid), 1 -chloro-2, 4-dinitrobenzene, DTNB(5, 5'- dithiobis-2-nitrobenzoic acid), GR(glutathione reductase) 등은 Sigma 사, malondialdehyde, sodium thiosulfide는 Aldrich사로부터 구입하였으며, 그 외 시약은 특급 및 일급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 UV spectro photometer (Shimadzhu UV-120), refrigerated centrifuge (Hnil supro 22K), ultracentrifuge(Hitachi 70P-72) 등을 사용하였다.
- 실험동물 및 실험설계- 실험 동물은 대한 BioLink(충북음성)로 부터 분양받아 본 대학 동물사에서 일정한 조건(온도 : 22 ± 1℃, 습도 : 55 ±3%, 명암: 12시 간 light/dark cycle)으로 1주 동안 고형사료로 적응시킨 체중 200± 10 g 의 Sprague-Dawley계 웅성 흰 쥐를 사용하였다. Acetamino-phen(AAP)의 투여는 400mg/kg을 하루에 한 번씩 1주간 경구투여하고 나머지 2주 동안은 DWP-04는 2% Tween 80에 현탁(50, 100, 200mg/kg)시켜 동시에 투여하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 UV spectro photometer (Shimadzhu UV-120), refrigerated centrifuge (Hnil supro 22K), ultracentrifuge(Hitachi 70P-72) 등을 사용하였다.
데이터처리
- "에 준하여 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 측정하였다. 실험 결과 평균치 土 표준편차로 표시하였으며 유의성 검증은 Duncan's multiple rage test를 이용하였다. P 값이 5% 미만(p< 0.
이론/모형
- 단백질 정량 및 통계처리- 단백질의 함량은 Low 등의 방법 "에 준하여 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 측정하였다. 실험 결과 평균치 土 표준편차로 표시하였으며 유의성 검증은 Duncan's multiple rage test를 이용하였다.
- 16) glutathione reductase(GR)의 활성측정은 Mize와 Langdon의 방법17)에 준하여 측정하였다.
- Spectrophotometer(Shimadzu, CL-770, Japan)을 사용하였다. 체혈을 마친 실험동물에서 간을 적출하여 간 조직을 관류하여 간조직에서 혈액을 제거한 간 조직에서 thiobar bituric acid reactive substances(TBARS)의 함량즉정은 Buege와 Aust의 방법,9) Glutathione(GSH)의 함량측정은 Griffith의 방법10)에 준하였다.
성능/효과
- AAP는 다른 해열진통제에 비하여 위장 출혈을 일으키지 않는 이점이 있으나 과량투여시 사람과 동물에서 치명적인 간장과 신장의 괴사를 유발하는 것으로 보고되고 있다.1,2) 이러한 독성의 생성은 간 microsomal 분획의 cytochrome p450과 관련되어 일어나는 산화과정에서 조직의 macromoleculer과 공유결합하는 화학적으로 반응성이 큰 aryl기를 지닌 중간대사물을 형성하여 이화합물에 의하여 hepatic glutathione의 농도가 적어도 50% 정도 결핍되었을 때 간 조직의 괴사를 유발하므로서 독성을 발현하는 것으로 시사되고 있다. 그리고, AAP의 반응성 물질이 glutathione과 포합반응하여 무독화되는 것으로 알려져 있다.
- 24-26)지질과 산화는 세포막의 투과성을 항진시키고 전반적인 세포독성을 초래하여 세포기능을 저하시켜 괴사에 관여하여 노화현상이나 이에 따른 여러 가지 질환의 병리 현상을 유발하여 발암의 과정에도 관여할 것이라고 Ahokas 등은 보고하였다.27) 본 실험의 결과 DWP-04의 투여가 AAP 에 의해 생성되는 지질과 산화물을 감소시킴으로서 지질과산화반응에 의한 간 손상을 억제시키는 것으로 사료된다.
- Cytochrome p450 은 mixed function oxidase로서 독성물질의 결합하는 형태 및 존재조직에 따라서 서로 다른 spectrum을 나타내는데 aminopyrine을 기질로 하여 fbrmaldehyde를 생성하는 type I과 aniline을 기질로 하여 p-aminophenol을 생성하는 type Ⅱ로 분류하고 있으며 이는 microsomal계의 활성산소 생성에 관여하고 있다.28-30) 이에 본 실험에서 cytochrome 2E의 활성과 관계가 있는 간 microsomal aniline hydroxylase 및 aminopyrine N-demethylase의 활성이 AAP의 투여로 현저히 증가되던 것이 DWP-04의 동시 투여로 현저히 억제되었으며 특히 l00mg^kg의 2주 투여에서 뚜렷한 결과를 관찰할 수 있었다. 이로 볼 때 DWP-04의 투여는 AAP의 투여로서 지질과 산화의 반응을 증가시켜 간 독성이 야기되는 것을 cytochrome 2E1의 활성을 억제하므로 AAP의 투여로 인해 cytos이 및 microsomal 효소계의 활성이 증가되어 superoxide anion, hydroxyl radical 및 HQ? 와 같은 oxygen free radical이 생성이 증가되는 것을 DWP-04의 투여로서 이러한 과정을 저지시켜 지질과산화 반응을 억제시키는 것으로 생각된다.
- AAP는 체내에서 일차적으로 산화 대사된 후 제2단계인 conjugation단계를 거쳐서 무독화되는 최종 과정에서 필연적으로 glutathione이 요구되는데 이를 이용하여 체내 독성물질을 전이 분해시키는 GST의 역할을 생각할 수 있다.35, 36)이상의 결과로 볼 때 DMP-04의 투여가 GST 및 QR의 활성을 증가시켜 oxygen free radical의 생성을 억제시키므로서 AAP에 의하여 나타나는 지질과 산화를 억제함으로 간 손상을 완화시켜 간을 보호하는 것으로 사료된다.
- 1에서 DDB 혼합제 (DWP-04)가A* U에 의하여 유도된 지질과 산화의 억제 효과가 어떠한 기전에 의하여 나타나는가를 검토할 목적으로 간장에서 일어나는 활성산소의 생성계인 phase I 반응 중 microsomal 효소계(cytochrome p450, cytochrome bS, aminopyrine N- demethylase, anilline hydroxylase)에 미치는 DMT-04의 효과를 관찰한 성적이 Table I이다. AAP를 1주일간 투여하고 DWP-04를 으주간 AAP와 동시에 투여하고서 microsomal 효소계에서 phase I 단계에 관여하는 cytochrome p450 및 cytochrome 55의 효소 활성이 AAP의 투여로 현저히 증가되던 것이 DWP-04의 투여로 억제되었다. Cytochrome p450 은 mixed function oxidase로서 독성물질의 결합하는 형태 및 존재조직에 따라서 서로 다른 spectrum을 나타내는데 aminopyrine을 기질로 하여 fbrmaldehyde를 생성하는 type I과 aniline을 기질로 하여 p-aminophenol을 생성하는 type Ⅱ로 분류하고 있으며 이는 microsomal계의 활성산소 생성에 관여하고 있다.
- 감소되었다. AAP의 단독 투여로 활성산소의 생성계인 phase I 계의 효소가 현저히 증가하던 것이 DWP-04의 처리로 억제되었으며 해독계인 phase Ⅱ 계의 효소는 AAP 의 투여로 대조군에 비하여 억제되던 것이 DWP-04의 전처리로 정상군에는 미치지 않으나 유의성 있게 증가되었다. 간조직중 glutathine의 함량은 AAP| 투여로 현저히 억제되었으며 DWP-04의 투여로 증가하였는데 이러한 결과는 DWP-04의 투여로 glutathione reductase(GR) 및 y-이utamy- Icysteine synthetasefy-GCS)의 활성을 조절하므로서 나타나는 결과로 생각된다.
- 관찰한 성적이 Table II이다. AAP의 단독투여군은 정상군에 비하여 GSH 농도가 유의적으로 감소하였으며 이에 DWP-04를 동시에 투여함으로써 AAP를 단독투여군보다 유의성 있게 개선되었다. 친전자성물질들과 활성 산소 및 과 산화물의 최종적 무독화 과정에서 필연적으로 gluta thione이 요구되는데 이물질의 함량에 따라 독성 발현의 유무를 판단할 수 있다.
- 간 기능 보호작용이 있는 것으로 알려진 DDB, selenium 과 glutathione의 혼합제제인 DWP-04와 acetaminophen(AAP)를 실험동물에 동시에 투여하고서 혈액에서의 생화학적 변동과 간 조직에서의 활성산소 생성계 및 해독계의 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과 AAP의 단독 투여는 대조군에 비하여 혈중간기능 지표 효소 및 간 조직에서의 지질과 산화의 함량이 현저히 증가하였으나, DVP-04의 동시투여로서 현저히 감소되었다. AAP의 단독 투여로 활성산소의 생성계인 phase I 계의 효소가 현저히 증가하던 것이 DWP-04의 처리로 억제되었으며 해독계인 phase Ⅱ 계의 효소는 AAP 의 투여로 대조군에 비하여 억제되던 것이 DWP-04의 전처리로 정상군에는 미치지 않으나 유의성 있게 증가되었다.
- GSH의 세포 내 함량 유지에는 GSH 활성 효소인 y-GCS와 해독 반응 후 생성되는산화형 GSH의 재환원 효소인 GR4®2)이 관여한다. 간 독성유발에 의한 glutathione의 함량 감소를 경감시키는 기전을 알아볼 목적으로 y-GCS의 활성과 GR의 활성을 관찰한 결과 AAP의 단독 투여에 의하여 현저히 억제되던 GR 및 y- GCS의 활성이 DWP-04를 동시에 투여함으로써 AAP 단독투여군보다 현저히 증가되었다. 이로 보아 AAP에 의한 간독성을 DVP-04의 동시 투여로서 GR 및 y-GCS의 활성에 영향을 주어간조직중 GSH 농도를 증가시키므로 서 phase U과정의 해독계에 영향을 주어 AAP 투여로 인한 지질 과산화 반응을 억제시키는 것으로 사료된다.
- AAP의 단독 투여로 활성산소의 생성계인 phase I 계의 효소가 현저히 증가하던 것이 DWP-04의 처리로 억제되었으며 해독계인 phase Ⅱ 계의 효소는 AAP 의 투여로 대조군에 비하여 억제되던 것이 DWP-04의 전처리로 정상군에는 미치지 않으나 유의성 있게 증가되었다. 간조직중 glutathine의 함량은 AAP| 투여로 현저히 억제되었으며 DWP-04의 투여로 증가하였는데 이러한 결과는 DWP-04의 투여로 glutathione reductase(GR) 및 y-이utamy- Icysteine synthetasefy-GCS)의 활성을 조절하므로서 나타나는 결과로 생각된다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 DWF- 04의 동시 투여는 활성산소의 생성 및 해독계를 조절하므로서 AAP로 인한 간 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 간 독성유발에 의한 glutathione의 함량 감소를 경감시키는 기전을 알아볼 목적으로 y-GCS의 활성과 GR의 활성을 관찰한 결과 AAP의 단독 투여에 의하여 현저히 억제되던 GR 및 y- GCS의 활성이 DWP-04를 동시에 투여함으로써 AAP 단독투여군보다 현저히 증가되었다. 이로 보아 AAP에 의한 간독성을 DVP-04의 동시 투여로서 GR 및 y-GCS의 활성에 영향을 주어간조직중 GSH 농도를 증가시키므로 서 phase U과정의 해독계에 영향을 주어 AAP 투여로 인한 지질 과산화 반응을 억제시키는 것으로 사료된다.
- 간조직중 glutathine의 함량은 AAP| 투여로 현저히 억제되었으며 DWP-04의 투여로 증가하였는데 이러한 결과는 DWP-04의 투여로 glutathione reductase(GR) 및 y-이utamy- Icysteine synthetasefy-GCS)의 활성을 조절하므로서 나타나는 결과로 생각된다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 DWF- 04의 동시 투여는 활성산소의 생성 및 해독계를 조절하므로서 AAP로 인한 간 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 3 IU로 현저히 증가 되었다. 이에 DWP-04를 동시에 투여에서 50mg/kg의 투여에서는 다소 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었으며, 100, 200 mg/kg 투여에서는 용량의존적으로 유의성 있게 감소하였다. 한편 aspartate amino transaminase(AST)의 활성도 ALP의 결과와 유사하였다.
- 2와 같다. 정상 쥐에 AAP를 투여함으로써 과산화물이 현저히 증가되던 것이 DVP-04의 투여에 의해 현저히 감소하였다. 일반적으로 생체조직 세포막의 손상은 세포막 구성 성분인 polyunsaturated fatty acid의 과산화가 그 한 가지 요인으로 지적되고 있는데, 지질 과산화는 생체외적인 요인뿐만 아니라 내적인 요인에 의하여 생성된 oxygen free radical들 때문에 야기되며, 세포의 성분이나 기질, 특히 불포화지방산이 다량 존재하는 세포막에 연쇄적인 과산화적 손상을 입힌다.
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