가시오가피 추출물이 마크로파지 활성과 우유의 발효 중 젖산균 성장에 미치는 영향 Effects of Acanthopanax senticosus Extract on Macrophage Activity and the Growth of Lactic Starter Culture during Fermentation원문보기
가시오가피의 마크로파지 활성 효과를 평가하고, 발효유에 첨가할 경우 젖산균 성장에 미치는 영향에 대하여 실시하였다. 가시오가피 추출물 농도가 증가할수록 마크로파지 활성은 증가하였고, 특히 $1,000\;{\mu}g/mL$ 첨가하였을 때 유의성 있게 증가하였다. 열수추출물은 70% 알콜추출물보다 NO 분비능이 더 높은 반면, $IL-1{\alpha}$와 $TNF-{\alpha}$는 알콜추출물이 더 높은 활성을 보였다. 가시오가피 열수추출물이 젖산균에 미치는 영향을 조사한 결과, 가시오가피 첨가량이 증가할수록 젖산균 성장이 억제되었고, pH는 완만히 감소됨에 따라 발효유에 가시오가피열수추출물을 첨가할 경우 Set type보다는 Stirred type 이나 Drink type으로 해야 발효유 제조에 적합할 것으로 보인다.
가시오가피의 마크로파지 활성 효과를 평가하고, 발효유에 첨가할 경우 젖산균 성장에 미치는 영향에 대하여 실시하였다. 가시오가피 추출물 농도가 증가할수록 마크로파지 활성은 증가하였고, 특히 $1,000\;{\mu}g/mL$ 첨가하였을 때 유의성 있게 증가하였다. 열수추출물은 70% 알콜추출물보다 NO 분비능이 더 높은 반면, $IL-1{\alpha}$와 $TNF-{\alpha}$는 알콜추출물이 더 높은 활성을 보였다. 가시오가피 열수추출물이 젖산균에 미치는 영향을 조사한 결과, 가시오가피 첨가량이 증가할수록 젖산균 성장이 억제되었고, pH는 완만히 감소됨에 따라 발효유에 가시오가피열수추출물을 첨가할 경우 Set type보다는 Stirred type 이나 Drink type으로 해야 발효유 제조에 적합할 것으로 보인다.
We examined the effect of Acanthopanax senticosus extract on macrophage activity and its effect on the growth of lactic starter culture when added to fermented milk. Greater amounts of Acanthopanax senticosus extract correlated with higher macrophage activity (p<0.05), in particular at $1,000\;...
We examined the effect of Acanthopanax senticosus extract on macrophage activity and its effect on the growth of lactic starter culture when added to fermented milk. Greater amounts of Acanthopanax senticosus extract correlated with higher macrophage activity (p<0.05), in particular at $1,000\;{\mu}g/mL$. Water extract of Acanthopanax senticosus resulted in higher levels of nitric oxide (NO) than 70% ethanol extract at $1,000\;{\mu}g/mL$. In contrast, 70% ethanol extract resulted in higher $interleukin-1{\alpha}\;(IL-1{\alpha})$ and Tumor necrosis $factor-{\alpha}\;(TNF-{\alpha})$ levels than water extract. The growth of lactic starter culture was inhibited by increasing amounts of Acanthopanax senticosus water extract, resulting in a lower decrease in pH. A stirred type or drink type fermentation process seemed more suitable than a set type for the proper production of Acanthopanax senticosus extract added to fermented milk.
We examined the effect of Acanthopanax senticosus extract on macrophage activity and its effect on the growth of lactic starter culture when added to fermented milk. Greater amounts of Acanthopanax senticosus extract correlated with higher macrophage activity (p<0.05), in particular at $1,000\;{\mu}g/mL$. Water extract of Acanthopanax senticosus resulted in higher levels of nitric oxide (NO) than 70% ethanol extract at $1,000\;{\mu}g/mL$. In contrast, 70% ethanol extract resulted in higher $interleukin-1{\alpha}\;(IL-1{\alpha})$ and Tumor necrosis $factor-{\alpha}\;(TNF-{\alpha})$ levels than water extract. The growth of lactic starter culture was inhibited by increasing amounts of Acanthopanax senticosus water extract, resulting in a lower decrease in pH. A stirred type or drink type fermentation process seemed more suitable than a set type for the proper production of Acanthopanax senticosus extract added to fermented milk.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 가시오가피에 대한 마크로파지 활성 효과를 평가하고, 발효유에 첨가할 경우 젖산균 성장에 미치는 영향에 대하여 실시하였다.
제안 방법
5%. 1.0%, 2.0% 수준으로 첨가하여 멸균한 다음 상업용 젖산균 5종을 희석하여 각각 배지에 CFU/mL 되게 접종하였다. 37℃에서 3시간 간격으로 배양하면서 O.
0% 수준으로 첨가하여 멸균한 다음 상업용 젖산균 5종을 희석하여 각각 배지에 CFU/mL 되게 접종하였다. 37℃에서 3시간 간격으로 배양하면서 O.D값(620 nm)과 pH를 측정하였다. 이때 O.
가시오가피 추출물이 젖산균 생육에 미치는 영향을 조사하기 위해서 가시오가피 추출물을 건물기준으로 0%, 0.5%, 1.0%, 2.0%의 수준으로 MRS 배양액에 첨가하여 5 종의 젖산균을 접종한 후 O.D값과 pH를 측정한 결과는 Fig. 4와 Table 2와 같다.
건조된 가시오가피를 중량비로 1 : 5로 가수하여 heating mantle에서 환류냉각관을 부착하여 3시간 동안 추출하여 여과포로 여과(Brix측정)한 후 여액 1 g을 해사 15 g이 있는 항량캔에 넣어 105℃에서 항량이 될 때까지 측정하였고 전체 중량만큼을 환산하여 곱해주었다.
배양 플라스크, 피펫, microplate(96-well) 등은 멸균된 제품들을 이용하였으며, 배양병 등 초자기구들eautoclave에서 121℃, 15 lb에서 15분간 가압 멸균한 후 사용하였다. 배지는 3차 증류수로 용해한 후 sterilized filter (0.22 |im pore size)로 여과하여 멸균한 다음 10% heat inactivated fetal bovine serum(Sigma, US A) 과 1% strepto-mycin-penicilline을 첨가하여 이용하였으며, 세포 세척 및계대 배양시 37℃을 유지하면서 사용하였다.
시료 11 g을 무균적으로 채취하여 99 mL 펩톤용액에 넣어 7초 동안 30 cm 간격으로 25회 세게 흔들어 준 후 십진법으로 희석하고 BCP(Bromocresol purple) 평판측정용 배지에 희석시료를 넣어 35℃에서 48시간 배양한 다음 발생한 황색의 집락을 젖산균의 집락으로 계측하였다.
3까지 배양하였다. 여기에 가시오가피 추출액을 10%(w/w) 첨가하여 호상발효유를 제조한 다음 5℃와 1(TC에서 18일간 저장하면서 젖산균 수를 측정하였다.
배양한 plate를 세척용 완충액으로 다시 5회세척하고 HRP-conjugated anti-mTNF를 100 |1L씩 넣어25℃에서 30분 배양한 다음 세척용 완충액으로 5회 세척하였다. 여기에 기질(33, 5, 5, -tetramethyl benzidine)을 100 µL 첨가하여 25℃에서 30분간 발색반응을 시킨 후 1.0N sulfuric acid를 100 μL씩 가해 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준 곡선에서 TNF-a 함량을 계산하였다.
원유에 탈지분유를 첨가한 원료유에 ABT-C 혼합스타터를 첨가하여 배양이 완료된 후 가시오가피 추출액을 첨가하고 발효유를 제조함으로써 배양 중의 소재에 의한 젖산균의 성장에 미치는 영향이 배제된 상태에서 저장 중 소재에 의한 젖산균의 성장에 미치는 영향을 5℃와 10%: 별로 소재 무첨가구인 대조구와 비교한 결과는 다음 Table 과 같다.
0N sulfuric acid를 100 μL씩 가해 반응을 정지시켰다. 이것을 ELISA reader(Molecular device, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 IL-la 함량을 계산하였다.
대상 데이터
이때 ELISA reader(Molecular Device, USA)로540nm에서의 흡광도를 측정하였다. NO의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였다.
구성 된 혼합균주, Groupe Rhone-poulence, USA), ABT- C{Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilusSl. 구성된 혼합균주, Groupe Rhone-poulence, USA)와 ABT-L 및 ABT-C 혼합균주에 사용된 단일균주인 Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus 등 5종의 동결 건조된균주를 사용하였다.
배양 플라스크, 피펫, microplate(96-well) 등은 멸균된 제품들을 이용하였으며, 배양병 등 초자기구들eautoclave에서 121℃, 15 lb에서 15분간 가압 멸균한 후 사용하였다. 배지는 3차 증류수로 용해한 후 sterilized filter (0.
본 실험에 사용한 중국산 가시오가피는 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
세포 배양 실험에 이용된 cell line인 RAW264.7(monocyte; macrophage, mouse)은 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다.
세포 배양시 사용된 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, with or without phenol red, Gibco)을 사용하였다. 배양 플라스크, 피펫, microplate(96-well) 등은 멸균된 제품들을 이용하였으며, 배양병 등 초자기구들eautoclave에서 121℃, 15 lb에서 15분간 가압 멸균한 후 사용하였다.
데이터처리
통계분석은 SAS program(1996)의 GLM(General Linear Model) Procedure를 통하여 분석하였고, 처리구간의 평균간 비교는 Duncan의 다중검정방법으로 5% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
RAW264.7(2xl05/well) 100 µL와 시료 20 |1L를 96-well plate에 넣어 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 동안 배양한 후 상징액을 취해 대식세포가 분비하는 Interleukin-la(IL-la)을 enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA)를 이용하여 측정하였다. 즉, anti-mIL-la 단일 클론 항체가 코팅된 microtiter plate(Mouse IL-la ELISA, PierceEndogen, USA)에 항체의 비특이적인 반응을 방지하기 위하여 blocking 시약(3% BSA용액, w/v)을 가한 다음 Tween 20이 0.
성능/효과
표의 결과를 보면 18일간 5P에서는 무첨가군이 8.6X108 CFU/mL 이상, 가시오가피추출물 첨가군이 7.8X108 CFU/ mL 이상이었고, "C에서는 무첨가군이 8.0xl08 CFU/mL 이상 가시오가피 추출물 첨가군이 7.3xl08 CFU/mL 이상으로 나타나 각 저장온도에서 유통기한 내에 축산물의 가공기준 및 성분규격(2005)에서 정한 젖산균 수인 1.0x108 CFU/mL 이상에 안정하게 유지할 수 있는 것으로 나타났다.
69 pg/mL로 나타났다. 70% 알콜 가시오가피 추출물은 가시오가피 추출액 농도 100 |ig/mL 이하에서 검출되지 않았으며, 1,000 gg/mL 에서만 48.66 pg/mL로 유의하게(p<0.05) 증가하였다. 이러한 결과는 IL-la는 아니지만 Ha 등(2003)이 가시오가피 줄기에서 추출한 시료 농도 5 μg/mL에서의 IL-1& 값이 7.
05) 증가하였다. 70% 알콜 가시오가피 추출액의 경우 역시 열수추출물과 비슷한 경향으로 1~10 μg/mL에서는 검출되지 않았고, 시료농도 100과 1,000 |ig/mL에서는 290.66 pg/ml와 798.02 pg/mL로서 열수추출물보다 TNF-a 분비능이 약간 높은 증가를 보였다. 이러한 결과는 Ha 등(2003)이 가시오가피 줄기에서 추출한 시료농도 5 μg/mL에서의 TNF 값이 1, 716 pg/mL라고 한 보고에 비해 다소 결과의 차이는 있었지만 가시오가피 추출물이 마크로파지를 직접 자극하여 TNF-a 를 생산하는 것으로 생각된다.
Lactobacillus acidophillns는 12시간 이후 지수성장기를 보였으나, 가시오가피 첨가구는 첨가량이 증가할수록 성장이 억제되는것으로 나타났다. Bifidobacterium longume 15시간 이후 지수성장기를 보였고, 0.5% 첨가구는 9시간 이후 완만한 증가세를 보였으나 1.0%와 2.0% 첨가구는 성장이 억제되었다. 혼합균주를 보면, ABT-Le 6시간 이후에 지수성장기를 보였고, 0.
Lactobacillus acidophillns는 12시간 이후 지수성장기를 보였으나, 가시오가피 첨가구는 첨가량이 증가할수록 성장이 억제되는것으로 나타났다. Bifidobacterium longume 15시간 이후 지수성장기를 보였고, 0.
Streptococcus thermophilns는 가시오가피를 첨가하지 않은 대조구에서 6시간 이후 지수성장기를 보였으나 가시오가피를 첨가한 처리구 모두 성장이 억제되었다. Lactobacillus acidophillns는 12시간 이후 지수성장기를 보였으나, 가시오가피 첨가구는 첨가량이 증가할수록 성장이 억제되는것으로 나타났다.
58 μM이었으며, 열수주줄에 의한 가시오가피 추출액을 1 pig/mL 농도로 첨가하였을 때는 검출되지 않았지만 첨가농도가 100 μg/mL 이상에서는 유의성 있게 증가하였다. 반면 70% 알콜추출물에서는 열수추출물과 달리 첨가 농도가 1 gg/mL 이상에서 검출되었고, 첨가농도가 증가할수록 더 많은 NO를 생산하였지만 열수추출물보다 분비 능이 약간 낮은 결과를 보였다.
이러한 결과는 가시오가피 첨가량이 증가할수록 젖산균성장이 억제됨에 따라 pH 역시 완만히 감소됨으로써 발효유에 가시오가피 열수추출물을 첨가할 경우 Set type보다는 Stirrd type이나 Drink type으로 해야 발효유 제조에 적합할 것으로 보인다. 이는 컵 충전기에 가시오가피 추출물과 배양할 원료유를 미리 넣은 다음 젖산균 스타터를 접종, 배양시키는 Set type의 경우 가시오가피 추출물이 젖산균의 성장을 억제하므로, 미리 원료유에 젖산균을 접종하여 배양탱크에 넣고 배양한 후 가시오가피 추출물을 별도로 넣고 혼합하는 방식인 Stirred type이나 Drink type으로 해야 젖산균 성장에 영향을 받지 않을 것으로 사료된다.
0% 첨가구는 성장이 억제되었다. 혼합균주를 보면, ABT-Le 6시간 이후에 지수성장기를 보였고, 0.5% 첨가구는 6시간 이후에 완만한 증가세를, 1.0%와 2.0% 첨가구는 거의 성장이 억제되었는데 ABT- c 역시 같은 경향을 보였다.
참고문헌 (17)
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