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문제 정의
- 항산화영양소의 기능이 강조되고 있다. 본 연구는 산화스트레스에 대한 노출의 영향을 알아 보기위해 산화스트레스를 유발하는 모델로서 단기간 동안 운동을 부과하도록 하고, 운동으로 유도된 산화스트레스를 조절하는 마늘의 능력을 측정함으로써 피토케미칼을 포함하는 마늘의 항산화력을 검토하고자 한다.
제안 방법
- Sprague-Dawley 종 수컷을 사용하여 고형사료를 공급하면서 5일간 환경에 적응 시킨 후, 그룹당 6마리씩 3그룹으로 구분하여 4주동안 실험식이를 급여하였다. 각 실험군은 대조군, 운동군 (운동부하), 마늘첨가군 (운동부하 + 2% 마늘) 으로 구분하였다.
- 구분하여 4주동안 실험식이를 급여하였다. 각 실험군은 대조군, 운동군 (운동부하), 마늘첨가군 (운동부하 + 2% 마늘) 으로 구분하였다. 식이와 식수는 자유공급하였고, 체중은 매주 1회 일정한 시각에 측정하였다.
- 각 실험군은 대조군, 운동군 (운동부하), 마늘첨가군 (운동부하 + 2% 마늘) 으로 구분하였다. 식이와 식수는 자유공급하였고, 체중은 매주 1회 일정한 시각에 측정하였다.
- 운동군의 동물은 하루에 40분씩, 매주 5일씩 수조에서 수영을 하도록 하였다. 수영을 하는 동안 물의 온도는 27~30℃ 로 유지되었다.
- 실험식이는 AIN-76에 기초하여, 옥수수유를 급원으로 지질함량을 15%로 조정하였고, 1%의 콜레스테롤을 첨가하였다 (Table 1). 각 실험식이의 조성은 동일하며, 마늘첨가 군의 경우는 2%의 마늘을 첨가하였다.
- 간조직에 0.25M sucrose와 0.5nM EDTA를 포함하는 50 mM 인산 완충용액 (pH 7.4) 을 가하여, 저온상태에서 Potter-Elvejhem homogenizer를 人]용하여 10% (w/v) 균질 액을 만들었다. 균질액을 10, 000 X g, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 일부는 지질과산화물 측정에 사용하였고, 나머지 상층액은 다시 10, 000 X g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다.
- 균질액을 10, 000 X g, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 일부는 지질과산화물 측정에 사용하였고, 나머지 상층액은 다시 10, 000 X g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 분리된 침전물을 취하여 재현탁하여 catalase 의 활성 측정에 사용하였다. 상층액은 100,000 X g에서 1 시간 동안 재원심분리하였고 분리된 상층액을 SOD와 GSH-px 활성 측정을 위한 효소원으로 사용하였다.
- TBARS 형성은 1, 1, 3, 3-tetraethoxypropane을 표준물질로 하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였고, nM MDA/g liver 또는 nM MDA/ml plasma로 표시하였다.
- Superoxide dismutase (SOD) 는 nitroblue tetrazolium (NBT)이 환원되는 정도를 측정하여 효소활성의 지표로 사용하였고, SOD의 활성은 NBT 환원을 50% 억제하는데 필요한 효소 수준을 1 unit로 산정하여 표시하였다Catalase 의 활성은 Aebi 방법에 준하여 240 nm에서 5분 동안 감소하는 흡광도를 측정하였다.噸 Catalase 활성은 unit/protein 으로 제시하였고, 1 unite 1분간 소실되는 HQ의 양에 해당한다.
- 효소활성 측정에 사용된 각 분획의 단백질 함량은 단백질 분석 kit를 이용하여 bovine serum albumin을 표준으로 하여 측정하였다.
- 顼 Lysis과정을 거친 후에 25 V/3003 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시흐]■였다. Ethidium bromide로 nucleotide를 염색하5Z, comet image analyzing system을 통해 이미지분석을 실시하였다. 임파구DNA의 손상정도는 DNA tailmoment (tail length x % of DNA in the tail) 를 측정하여 표시하였다.
- Ethidium bromide로 nucleotide를 염색하5Z, comet image analyzing system을 통해 이미지분석을 실시하였다. 임파구DNA의 손상정도는 DNA tailmoment (tail length x % of DNA in the tail) 를 측정하여 표시하였다.
- 산화스트레스와 항산화력을 나타내는 지표의 하나로 전혈을 사용하여 백혈구의 DNA tail moment를 측정하여 DNA 손상 정도를 조사하였다. DNA tail moment는 대조군에 비 해운 동군과 마늘첨가군에서 높아지는 현상을 보였다 (Fig.
- 본 연구는 운동을 ROS를 유발하는 모델로 하여 운동에서 오는 산화스트레스의 크기를 측정하고, 이에 대한 항산화 보강수단으로서 마늘의 항산화작용을 검토하고자 흰쥐에게 1주일에 5일간의 수영과 2%의 마늘보충식이를 4주간 실시하였다.
- 4주의 사육기간 종료 후, 실험동물을 12시간 절식시키고, diethyl ether로 마취하여 혈액과 조직을 채취하였다. 혈액은 1,000 X g에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리하였고 간 조직은 생리식염수로 세정한 후 -70笆에서 보관하였다.
- 체내 지질과산화물 형성 정도를 측정하기 위하여 혈장과 조직의 TBARS를 실험하였다. 대조군에서 혈장 TBARS는 2.
대상 데이터
- 분리된 침전물을 취하여 재현탁하여 catalase 의 활성 측정에 사용하였다. 상층액은 100,000 X g에서 1 시간 동안 재원심분리하였고 분리된 상층액을 SOD와 GSH-px 활성 측정을 위한 효소원으로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 SAS package를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였고, 각 실험군의 평균치 간의 유의성은 a = 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 검증하였다.
- Values are mean ± SD. Values in a row with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test. Con (Control): Ex (swimming) : Ex-G (swimming + 2% garlic).
- Values are mean ± SD. Values in a row with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test. Con (Control): Ex (swimming) : Ex-G (swimming + 2% garlic).
- Con (Control) ;Ex (swimming) : Ex-G (swimming + 2% garlic). Bars with uncommon letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.
이론/모형
- 혈장의 콜레스테롤과 HDL-C는 콜레스테롤 산화 효소법을 이용한 분석 kit (영동제약)을 사용하여 비색정량하였다. LDL-C는 Fridewald 법에 따라 산출하였다.
- LDL-C는 Fridewald 법에 따라 산출하였다.")
- 지질과산화물은 Ohkawa 등의 방법에 기초하여 thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 를 측정하여 평가하였다. 切 TBARS 형성은 1, 1, 3, 3-tetraethoxypropane을 표준물질로 하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였고, nM MDA/g liver 또는 nM MDA/ml plasma로 표시하였다.
- DNA 손상은 single cell gel electrophoresis assay (comet assay)를 사용하여 측정하였다.顼 Lysis과정을 거친 후에 25 V/3003 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시흐]■였다.
성능/효과
- 실험식이 급여 4주 동안의 체중증가율은 대조군에서 48.85 + 6.33 g/주로 가장 높은 증가율을 보였고, 운동군과 마늘첨가 군은 대조군에 비해 모두 유의하게 낮은 수준이었다. (Table 2) 사료 효율은 대조군과 마늘첨가에서 높은 수치를 보였고 운동군은 낮은 사료효율을 보였다.
- 33 g/주로 가장 높은 증가율을 보였고, 운동군과 마늘첨가 군은 대조군에 비해 모두 유의하게 낮은 수준이었다. (Table 2) 사료 효율은 대조군과 마늘첨가에서 높은 수치를 보였고 운동군은 낮은 사료효율을 보였다. 100 g 체중 단위당의 부고환지방은 대조군에서 1.
- 있다. 혈장 중성지방은 운동부하로 다소 낮아지는 경향을 보이나 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다. 혈장 콜레스테롤 또한 각 그룹 사이에 차이가 없는 것으로 나타났다.
- TBARS를 실험하였다. 대조군에서 혈장 TBARS는 2.30 ± 0.67 nM/ml으로 유의하게 낮은 반면, 운동군은 3.09 + 0.53 nM/ml으로 크게 증가하였으며 마늘첨가군은대조군에 근접하는 2.50 ± 0.51 nM/ml의 수치를 보였다 (Fig. 1). 간조직에서의 TBARS 형성은 유의한 변화는 아니나 혈장의 TBARS 와 유사한 양상을 보여 대조군의 TBARS 수치가 낮았고, 운동군에서 증가되었으나 마늘첨가로 인해 TBARS 형성은 대조군과 비슷한 값으로 저하되었다 (Fig.
- 1). 간조직에서의 TBARS 형성은 유의한 변화는 아니나 혈장의 TBARS 와 유사한 양상을 보여 대조군의 TBARS 수치가 낮았고, 운동군에서 증가되었으나 마늘첨가로 인해 TBARS 형성은 대조군과 비슷한 값으로 저하되었다 (Fig. 2). 이는 운동에 의해 과산화지질이 증가함을 나타내며, 마늘의 첨가는 이러한 지질과산화를 완화시키는 것으로 나타났다.
- SOD의 활성은 그룹 사이에 차이를 보였는데 마늘첨가군 (1.55 ± 0.49 unit/mg protein) 이 대조군과 운동군에 비해 유의하게 높은 값을 보였다 (Table 4). Catalase는 대조군과 마늘첨가군에 비해 운동군에서 뚜렷하게 낮게 나타났고, 운동군에서 낮게 나타난 catalase의 활성이 마늘첨가 군에서 유의하게 높아진 것으로 나타났다.
- 49 unit/mg protein) 이 대조군과 운동군에 비해 유의하게 높은 값을 보였다 (Table 4). Catalase는 대조군과 마늘첨가군에 비해 운동군에서 뚜렷하게 낮게 나타났고, 운동군에서 낮게 나타난 catalase의 활성이 마늘첨가 군에서 유의하게 높아진 것으로 나타났다. 이러한 면에서 볼 때 마늘의 보충은 항산화효소활성을 조절함으로써 생체에서증가되는 산화스트레스에 대처할 수 있는 작용이 있음을 시사한다.
- 3). 운동군과 마늘첨가군을 비교할 때, 서로 유사한 수치를 보임으로써 마늘의 보충이 DNA tail moment 에 영향을 주지 않은 것으로 나타났다.
- 저압에서의 추출 및 농축 과정을 통해 조제)를 보충한 흰쥐에서 총콜레스테롤과 중성지방이 보충하지 않은 그룹에 비해 각기 15%와 30% 낮았음을 관찰하였다.2。)본 실험의 조건과 동일하되 지방급원을 달리하여 15% 우지를 포함한 식이에 2%의 냉동건조 마늘가루를 첨가한 식이는 흰쥐에서 총콜레스테롤을 저하하는 효과를 보였다.2》그러나 본 연구에서 15%의 옥수수유를 포함한 식이에서는 마늘의 이러한 효과가 나타나지 않았다.
- LDLC과 HDL-C의 수준에도 마늘의 첨가는 효과를 나타내지 않았다. 반면에 1% 콜레스테롤과 함께 올리브유를 급원으로 한 식이에서는 혈중 콜레스테롤이 크게 증가하였으며, 마늘의 보충은상승된 콜레스테롤과 LDL-C를 50% 저하시키는 효과를 나타냈고 HDLC는 18% 증가시키는 결과를 보였다.이와 같이 콜레스테롤의 농도가 상승되었는가 그리고.
- 缁 라디칼은 운동 동안에 골격근육 등의 조직에서 생성이 증가되고, 생체는 과산화 작용으로부터 조직의 손상을 최소화하기 위하여 항산화 방어기작을 작동시킨다.观 이러한 관점에서 볼 때 생성된 라디칼은 항산화 효소 활성을 상향조절하는 강한 요인이 될 수 있으리라 가정할 수 있는데, 동물에 일정 기간 유산소운동을 수행하도록 한 결과 SOD, GSH-px, catalase의 활성이 증가됨 点써 운동의 산화스트레스에 대한 적응능력이 생기는 것으로 평가하였다."' 그러나 이와는 달리 일부 연구는 8주간의 유산소운동에서 오히려 항산화효소계가 저하되는 결과를 보여 항산화 방어체계가 충분히 향상되지 못함을 시사하였다.
- 즉, 항산화제의 부족이 운동으로 유발되는 산화스트레스의 증대를억제시키지 못한 것으로 보이며, 마늘첨가군에서 마늘은 항산화제로서 작용하여 운동으로 유발된 산화스트레스를 대조군 수준으로 저하시킨 것으로 볼 수 있다. TBARS 수치를 항산화 효소의 활성과 비교할 때, 마늘첨가군은 운동군에 비해 SOD와 Catalase의 활성이 유의하게 증가됨으로써 마늘에 의한 상승효과를 얻은 것으로 판단되나 운동군은 산화스트레스에 적응될 만큼 효소활성을 매개로 하는 방어기작이 충분하지 않은 것으로 나타났다. 결과적으로 본/실험조건을 전제로 할 때 운동은 생성된 ROS에 의한 지질손상과 항산화 방어기전 사이의 균형에 혼란을 야기하는 것으로 나타났고, 따라서 운동 수행시 부가적인 항산화물질이 요구됨을 제시하였다.
- TBARS 수치를 항산화 효소의 활성과 비교할 때, 마늘첨가군은 운동군에 비해 SOD와 Catalase의 활성이 유의하게 증가됨으로써 마늘에 의한 상승효과를 얻은 것으로 판단되나 운동군은 산화스트레스에 적응될 만큼 효소활성을 매개로 하는 방어기작이 충분하지 않은 것으로 나타났다. 결과적으로 본/실험조건을 전제로 할 때 운동은 생성된 ROS에 의한 지질손상과 항산화 방어기전 사이의 균형에 혼란을 야기하는 것으로 나타났고, 따라서 운동 수행시 부가적인 항산화물질이 요구됨을 제시하였다.
- AGE는 TBARS 형성을 31-89% 저하하고, 園 ROS를 소거하며 LDL의 산화를 막아 산화LDL에 의한 혈관내피세포의 손상을 억제하는 것으로 나타났다.顼 마늘유 (garlic oil) 의보 중은 catalase, SOD, glutathione peroxidase과 GSH (이utathione)를 증가시켜 지질과산화를 저하하는 것으로 나타났다.
- 손상을 억제하는 것으로 나타났다.顼 마늘유 (garlic oil) 의보 중은 catalase, SOD, glutathione peroxidase과 GSH (이utathione)를 증가시켜 지질과산화를 저하하는 것으로 나타났다. 龄 AGE의 존재는 소의 동맥내피세포를 산화제에 노출시킬 때 SOD, catalase, GSH-px의 수준을 증가시켰고, AGE의 함량과 시간이 경과함에 따라 superoxide radical과 hydrogen peroxide의 생성이 억제되었다.
- 인체를 대상으로 한차례의 지칠 때까지의 극심한 운동 (tread mill)을 수행한 24시간 후에 백혈구를 취해 comet assay로 DNA 손상을 측정한 결과, DNA tail moment는 운동 전에 비해 크게 증가하였다. 반면에 운동 전후에 비타민 E (3 X 800 mg) 을 보충하거나 운동전 14일 동안 매일 비타민 E (1200 mg)를 공급받은 대상자는 운동 24시간 후에 DNA tail moment의 작은 증가를 보임으로써 극도의 운동에 수반되는 DNA손상을 비타민 E가 효과적으로 막을 수 있었다.
- 전에 비해 크게 증가하였다. 반면에 운동 전후에 비타민 E (3 X 800 mg) 을 보충하거나 운동전 14일 동안 매일 비타민 E (1200 mg)를 공급받은 대상자는 운동 24시간 후에 DNA tail moment의 작은 증가를 보임으로써 극도의 운동에 수반되는 DNA손상을 비타민 E가 효과적으로 막을 수 있었다. Hartman 등에 의하면 tread mill의 속도를 증가시키면서 극도의 강도까지 달리게 한 후에 DNA tail moment는 증가하였고, 운동 후 72시간이 경과하면서 운동 전의 수준으로 저하되었다.
- 그러나 운동방법을 달리하여 같은 대상자를 일정한 속도로 45분간 달리도록 한 후에는 DNA tail moment 가 변화하지 않는 것으로 보아 DNA손상은 유산소대사의 한계를 넘는 운동강도에서 일어나는 것으로 보고하였다.洶 본연구의 운동을 실시한 운동군에서 유의한 수준의 증가는 아니나 DNA tail moment가 증가하는 양상을 보였다. 이는 운동 강도가 극도로 강하지 않았기 때문으로 생각되며, 따라서 마늘의 효과를 보기에는 DNA 손상정도가 충분하지 않았던 것으로 판단된다.
- 5일간의 규칙적인 운동은 체중과 체지방저하효과를 보였으며, 2%의 마늘 보충은 체중조절에 영향을 나타내지 않았다. 마늘은 혈장 총콜레스테롤이나 중성지질의 저하효과를 나타내지 않았는데 이는 실험에 사용한 식물성스테롤 함량이 높은 옥수수유가 콜레스테롤의 배설을 증가시켜 혈중 지질농도를 낮은 상태로 유지하고 있었기 때문으로 추정된다.
- 마늘은 혈장 총콜레스테롤이나 중성지질의 저하효과를 나타내지 않았는데 이는 실험에 사용한 식물성스테롤 함량이 높은 옥수수유가 콜레스테롤의 배설을 증가시켜 혈중 지질농도를 낮은 상태로 유지하고 있었기 때문으로 추정된다. 운동 결과 TBARS가 유의하게 증가하였고 DNA tail moment가 높아지는 양상을 보였는데, 이는 산화제의 생성이 항산화 기능의 한계를 초월했음을 의미하며 항산화물질이 부족한 상태임을 반영한다. 반면에 운동군에 2%의 마늘첨가는 TBARS 을 대조군의 값과 비슷하게 낮은 수준으로 저하시키는 효과를 보임으로써 산화스트레스를 뚜렷이 희석시키는 작용이 있었다.
- 운동 결과 TBARS가 유의하게 증가하였고 DNA tail moment가 높아지는 양상을 보였는데, 이는 산화제의 생성이 항산화 기능의 한계를 초월했음을 의미하며 항산화물질이 부족한 상태임을 반영한다. 반면에 운동군에 2%의 마늘첨가는 TBARS 을 대조군의 값과 비슷하게 낮은 수준으로 저하시키는 효과를 보임으로써 산화스트레스를 뚜렷이 희석시키는 작용이 있었다. 운동부하에 따른 항산화효소체계는 TEARS 생성과 일치하는 양상을 보였다.
- 운동부하에 따른 항산화효소체계는 TEARS 생성과 일치하는 양상을 보였다. 운동군에서 항산화효소활성은 산화스트레스에 대응할 정도로 증대되지 못하였으나 마늘의 첨가는 SOD와 catalase의 활성을 유의하게 증가시켜 운동에서유래되는 TBARS 형성을 하향조절하는 기작을 보였다. 이상에서 보듯이 본 실험조건을 전제로 할 때, 운동은 자유라디칼생성을 증대시킴으로써 항산화방어체계에 대한 균형을 파괴하여 지질의 과산화를 촉진하는 것으로 나타났다.
- 운동군에서 항산화효소활성은 산화스트레스에 대응할 정도로 증대되지 못하였으나 마늘의 첨가는 SOD와 catalase의 활성을 유의하게 증가시켜 운동에서유래되는 TBARS 형성을 하향조절하는 기작을 보였다. 이상에서 보듯이 본 실험조건을 전제로 할 때, 운동은 자유라디칼생성을 증대시킴으로써 항산화방어체계에 대한 균형을 파괴하여 지질의 과산화를 촉진하는 것으로 나타났다. 이러한 산화스트레스 상황에서 마늘의 적절한 사용은 부족한 항산화 기능을 강화시키는 물질로서의 역할이 있음이 분명하나, 마늘이 DNA손상에 주는 영향력은 더 검토가 이루어져야 할 것으로 본다.
- 본 연구의 대조군, 운동군, 마늘첨가군의 TBARS 수치를 비교해 볼 때, 운동군에서 혈장 TBARS이 가장 큰 것은 운동 수행과 함께 항산화제 부족이 요인인 것으로 보인다. 즉, 항산화제의 부족이 운동으로 유발되는 산화스트레스의 증대를억제시키지 못한 것으로 보이며, 마늘첨가군에서 마늘은 항산화제로서 작용하여 운동으로 유발된 산화스트레스를 대조군 수준으로 저하시킨 것으로 볼 수 있다.
후속연구
- 이는 운동 강도가 극도로 강하지 않았기 때문으로 생각되며, 따라서 마늘의 효과를 보기에는 DNA 손상정도가 충분하지 않았던 것으로 판단된다. 운동강도에 따라 운동에 의해 DNA 손상이 우려되나 마늘의 첨가가 DNA 손상을 낮출 수 있는지는 더 연구되어야 할 부분이라 여겨진다.
- 이상에서 보듯이 본 실험조건을 전제로 할 때, 운동은 자유라디칼생성을 증대시킴으로써 항산화방어체계에 대한 균형을 파괴하여 지질의 과산화를 촉진하는 것으로 나타났다. 이러한 산화스트레스 상황에서 마늘의 적절한 사용은 부족한 항산화 기능을 강화시키는 물질로서의 역할이 있음이 분명하나, 마늘이 DNA손상에 주는 영향력은 더 검토가 이루어져야 할 것으로 본다.
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