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문제 정의
- 본 연구는 항산화물질이 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함으로써 인지능 개선에 효과가 있다는 점에 착안하여, 021) 항산화작용이 있으며 본 연구팀에 의하여 기억력회복 효과가 입증된 바 있는22, 23)녹차에서 추출한 L-theanine에 대하여 수동회피시험 및 수중미로시험을 통하여 scopolamine에 의한 기억력 억제에 대한 보호효과를 관찰하였다. 그 결과 L-theaninee 그 자체로는 마우스의 기억능 변화에는 영향이 없었지만, scopolamine에 의한 기억 및 학습능력억제에 대한 회복능력을 농도의 존적으로 증가시켰다.
가설 설정
- ") 또 다른 연구에 의하면 donepezil과 tacrine과 같은 AChE inhibitor약물들이 기존의 약효 이외에 루이체(lewy bodiesX 동반한 치매에서 피질에 축적된 아밀로이드 베타 단백질을 줄여준다는 결과가 보고되었고, 28)neuroinflammation을 유발하는 lipopolysaccharide(LPS)를 투여한 마우스에 tacrine과 rivastigmine, donepezil을 투여하였을 때, 염증유발의 marker가 되는 Interleukin-2(IL-2)의 발현을 줄여주어 neuroinflammation 을 억제하는 효과가 있다는 것도 보고되었다. 29)L-The;血ne의 경우도 이와 같은 작용에 의해서도 기억력회복효과가 있을 수 있다고 판단된다. 실제 본 연구자들의 연구에서 L-theaninee 치매 원인 물질인 beta amyloid에 의한 기억력저하를 회복시켰으며, 신경세포 사가 감소함을 확인하였다(미발표자료).
제안 방법
- 단백질양의 측정방법은 다음과 같다. 1.46 mg/m/ bovine plasma gamma globulin stock standard* 희석하여 표준액을 준비하였다(표준액 희석배수; 0.05, 0.1, 0.2, 03, 0.4, 0.5 mg/m/). 단백질 표준액과 준비한 시료를 각각 20 ml 씩 96 well microplate 에 넣고 Bio-rad protein dye reagent를 180 m/씩 혼합하여 5분 동안 반응시킨 후 ELISA plate reader 에서 595nm로 홉광도를 측정하여 표준액에 대한 정량곡선에 대입하여 시료의 단백질 정량 값을 산출하였다.
- 마우스를 입수시켜 표식 통을 찾아 갈 때까지 체류하는 시간, 거리, 속도를 측정하여 기억의 지표 (marker)로 令1았다. L-theanine을 7일간 투여하여 training trial (물에 입수하여 표식통을 찾아가는 능력)를 3일간 3회씩 총 9회 시행하였다. 마우스의 기억력을 측정하기 위하여 마지막 training trial 24시간 후에 scopolamine을 투여하고 30 분 후 수중 미로 장치를 이용하여 마우스가 표식통에 도달한 체제시간과 거리, 속도를 측정했다.
- Mice were fed L-theanine (2 and 4 ㎎/㎏) in the drinking water for 7 days and given training 3 times a day for 3 days. The maze test was then performed after 24 hr of the last training with the injection of scopolamine to induce memory impairment, and the latency time and distance were recorded. Each value represents mean±S.
- 5 mg/m/). 단백질 표준액과 준비한 시료를 각각 20 ml 씩 96 well microplate 에 넣고 Bio-rad protein dye reagent를 180 m/씩 혼합하여 5분 동안 반응시킨 후 ELISA plate reader 에서 595nm로 홉광도를 측정하여 표준액에 대한 정량곡선에 대입하여 시료의 단백질 정량 값을 산출하였다. 단백질량이 맞춰진 시료를 5~10m/ 반응완충액(50mM Tris-HCL pH 8.
- 단백질 표준액과 준비한 시료를 각각 20 ml 씩 96 well microplate 에 넣고 Bio-rad protein dye reagent를 180 m/씩 혼합하여 5분 동안 반응시킨 후 ELISA plate reader 에서 595nm로 홉광도를 측정하여 표준액에 대한 정량곡선에 대입하여 시료의 단백질 정량 값을 산출하였다. 단백질량이 맞춰진 시료를 5~10m/ 반응완충액(50mM Tris-HCL pH 8.0 containing 0.01% DTNB, 0.02% acetylthiocholine, 0.1 mM isoOMPA)과 섞어 2001显을 동일하게 만들어 96 well microplate 에 넣고 10분간 37℃에서 incubation 후 ELISA plate reader 를이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 효소의 활성을 측정하였다. 효소 활성은 units of nmole/min/mg/protein으로 표현하였다.
- 마우스를 입수시켜 살아남기 위해 헤엄쳐 표식통을 찾아가게 고안되었다. 마우스를 입수시켜 표식 통을 찾아 갈 때까지 체류하는 시간, 거리, 속도를 측정하여 기억의 지표 (marker)로 令1았다. L-theanine을 7일간 투여하여 training trial (물에 입수하여 표식통을 찾아가는 능력)를 3일간 3회씩 총 9회 시행하였다.
- 마우스를 평균체중과 분산이 균질 하도록 군을 나누고, 각 군당 10마리씩 4군으로 하였으며, 1일 물 섭취량을 고려하여 용매 자체 또는 시험물질 (L-theanine 2, 4㎎/㎏)을 음용수에 녹여 7 일간 투여하였다. 마우스는 자극할만한 요인을 없애고 같은 조건하에서 사육하였다.
- L-theanine을 7일간 투여하여 training trial (물에 입수하여 표식통을 찾아가는 능력)를 3일간 3회씩 총 9회 시행하였다. 마우스의 기억력을 측정하기 위하여 마지막 training trial 24시간 후에 scopolamine을 투여하고 30 분 후 수중 미로 장치를 이용하여 마우스가 표식통에 도달한 체제시간과 거리, 속도를 측정했다.
- 실험동물은 충북대학교 실험동물연구지원센터에서 GLP 수준의 관리기준에 따라 수용하고, 관리, 투여, 실험을 실시하였다. 물과 실험동물용 사료는 자유로이 섭취하도록 하였고, 약물을 물에 녹여 투여하기 위해 1일 평균 물 섭취량을 측정하였다. 본 실험에 사용한 L-theanine 은 일본 태양화학(Eiyo kagaku, Japan) 제품을 (주)LG생활건강으로부터 제공받아 사용하였다.
- 최근 생약에서 추출되어 뇌내 AChE의 활성억제효과를 가지는 항산화 물질들이 주목 받고 있는데 남아시아에서 널리 분포되어 있는 labemaemontana d初aricafcz추출물이나 오미자로 알려진 Schizandra ch泌ensis의 열매에서 분리된 gomisin A, 또 tea tree oil 등 여러가지 생약 추출물들에서 AChE 억제활성이 보고되는 등, 1345)현재 임상적으로 사용되고 있는 AChE 활성 억제 약물들보다 부작용이 적으며 효능이 좋고, 원인적 치료까지 가능한 새로운 학습, 기억력 증진효과를 갖는 새로운 치매치료제를 찾는데 여러 연구팀들이 관심을 가지고 연구를 진행하고 있는 상태이다. 본 연구에서 사용한 L-theaninee 뛰어난 항산화효과와 신경보호 효과 알려진 녹차 구성성분 중의 하나인 amino acid로, glutamate receptor에 경쟁적으로 작용하는 천연 glutamate 유사 화합물로 중추신경계에 작용할 것으로 판단되어 16, 17)L-theanine 이 항무스카린성 약물로 작용하여 중추신경을 억제 및 기억력 상실을 유발하는 scopolamine에 대해 방어작용을 나타내는지를 행동 약리 및 bioassay를 통해 알아보았고 그 기전이 AChE 억제에 의한 것인지를 확인하였다.
- 24시간 후에 마우스를 위와 같은 상자 중 밝은 곳에 놓으면 전날의 전기쇼크로 인하여 상자의 검은 부분2로 들어가지 않게 된다. 이때 밝은 부분에 체류하는 시간(최대 180초, cut off time)을 측정하여 기억의 지표(marker)로 삼았다.
- 행동약리 실험 후 마우스의 뇌를 해마와 대뇌피질로 나누었다. PRO-PREP Protein Extraction Solution(iNtRON Bio Technology Co.
대상 데이터
- 물과 실험동물용 사료는 자유로이 섭취하도록 하였고, 약물을 물에 녹여 투여하기 위해 1일 평균 물 섭취량을 측정하였다. 본 실험에 사용한 L-theanine 은 일본 태양화학(Eiyo kagaku, Japan) 제품을 (주)LG생활건강으로부터 제공받아 사용하였다.
- 생후 9주 된 수컷 ICR 마우스를 중앙실험동물(주)로부터 구입하여, 1주간 순화시키면서 일반증상을 관찰하였고, 체중을 측정하여 건강한 것만을 선별하여 사용하였다. 실험동물은 충북대학교 실험동물연구지원센터에서 GLP 수준의 관리기준에 따라 수용하고, 관리, 투여, 실험을 실시하였다.
- 건강한 것만을 선별하여 사용하였다. 실험동물은 충북대학교 실험동물연구지원센터에서 GLP 수준의 관리기준에 따라 수용하고, 관리, 투여, 실험을 실시하였다. 물과 실험동물용 사료는 자유로이 섭취하도록 하였고, 약물을 물에 녹여 투여하기 위해 1일 평균 물 섭취량을 측정하였다.
데이터처리
- 연구 결과치는 one-way AVOVA로 분석하여 군간 유의성 여부를 판결하고 그 결과 군간 유의성은 Dunnett's test로 분석하였다. PvO.
이론/모형
- Acetylcholinesterase assay는 Ellman's method18^] 따라서 수행하였다. 행동약리 실험 후 마우스의 뇌를 해마와 대뇌피질로 나누었다.
성능/효과
- Scopolamine(l ㎎/㎏, i.p.)을 처리한 동물은 기억력 상실로 인하여 비교적 다른 경로를 거치지 않고 자신이 헤엄쳐 다닌 위치를 기억하여 표식통을 찾는 대조군에 비해 이동거리와 체제시간이 늘어났다. 반면 7일간 L-theanine을 투여 후 scopolamine (1 ㎎/㎏, i.
- 본 연구는 항산화물질이 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함으로써 인지능 개선에 효과가 있다는 점에 착안하여, 021) 항산화작용이 있으며 본 연구팀에 의하여 기억력회복 효과가 입증된 바 있는22, 23)녹차에서 추출한 L-theanine에 대하여 수동회피시험 및 수중미로시험을 통하여 scopolamine에 의한 기억력 억제에 대한 보호효과를 관찰하였다. 그 결과 L-theaninee 그 자체로는 마우스의 기억능 변화에는 영향이 없었지만, scopolamine에 의한 기억 및 학습능력억제에 대한 회복능력을 농도의 존적으로 증가시켰다.
- 대조군은 전날에 받은 전기쇼크를 기억해 어두운 상자로 들어가는 시간이 training 때보다 현저히 증가하였으나, scopolamine (1 ㎎/㎏, i.p.)을 처리한 동물은 기억력 상실로 인하여 어두운 상자로 이동하여 밝은 상자에서의 체류시간(8± 1.7 sec)이 크게 증가흐卜지 않았다. 반면 7 일간 L-theanine을 투여 후 scopolamine (1 ㎎/㎏, i.
- 실제 본 연구자들의 연구에서 L-theaninee 치매 원인 물질인 beta amyloid에 의한 기억력저하를 회복시켰으며, 신경세포 사가 감소함을 확인하였다(미발표자료). 따라서, L-theanine 이 scopolamine에 의한 AChE의 생성 억제를 통한 신경전달물질의 유지, 보호작용과 기억력회복의 효과적인 후보물질로 판단된다.
- 또한 scopolamine을 투여한 마우스의 대뇌피질과 해마 영역에서의 AChE의 활성을 측정한 결과 L-theanine이 대뇌피질과 해마 영역에서 AChE를 농도의존적으로 억제하였는데 이는 L- theanine이 실제로 혈관뇌장벽 (blood brain barrier)을 통과한 후뇌 내 AChE 활성억제를 통해 뇌내 아세틸콜린의 농도를 적절하게 유지함으로써 뇌의 시냅스에서 콜린성 신경계의 기능을 높여주어 학습과 기억력 감퇴를 억제하여 주었다는 것을 의미한다. AChE의 발현을 억제하는 것은 치매 치료에 있어서 현재 가장 큰 비중.
- 또한 항산화물질로 AChE 억제활성을 나타내는 다른 천연물에서 유래된 물질들과 비교를 해보면, 오미자에서 추출된 gomisin Ae 5m以kg(p.o.)에서 약 50%의 AChE 억제능을 보였고, Tabemaemontana divaricata 추출물 (TDE)은 500 ㎎/㎏를 랫드에 투여할 때 25% 정도의 억제효과를 보여 L-theanine이 다른 물질의 억제능보다 용량대비 우수한 것으로 판단된다.13") 구조적으로 L-theaninee glutamate의 gamma 위치에 ethyl- amide기만 치환되어 있는 화학구조를 가지고 있다(Fig.
- 7 sec)이 크게 증가흐卜지 않았다. 반면 7 일간 L-theanine을 투여 후 scopolamine (1 ㎎/㎏, i.p.X 처리한 동물에서 밝은 상자에서의 체제 시간은 L-theanine 2 ㎎/㎏ 투여 시 2배 정도(16±3.2 sec), 4 m以kg 투여 시는 3배 정도(20±2.7sec)로 농도 의존적으로 기억력 회복기능을 보였다(Fig. 2).
- )을 처리한 동물은 기억력 상실로 인하여 비교적 다른 경로를 거치지 않고 자신이 헤엄쳐 다닌 위치를 기억하여 표식통을 찾는 대조군에 비해 이동거리와 체제시간이 늘어났다. 반면 7일간 L-theanine을 투여 후 scopolamine (1 ㎎/㎏, i.p)를 처리한 동물에서 체제 거리는 scop이amine 군 (594±63 cm)에 비해 L-thesnine 2 ㎎/㎏ 투여 시 10% 정도 (334±92 cm), 4 m却kg 투여 시는 35% 정도(206±57 cm)로 감소하는 등 농도 의존적으로 현저한 기억력 회복기능을 보였으며, 체제 시간은 scopolamine 군(27±3.5sec)에 비해 L-theanine 2 mgkg 투여 시 15% 정도(12 ±3.2 sec), 4 ㎎/㎏ 투여 시는 35% 정도(8±2.5sec)로 감소하는 등 농도 의존적으로 현저한 기억력회복기능을 보여 상대적으로 표식통을 찾는 속도도 농도 의존적으로 빨라짐을 보였다(Fig. 3).
- 29)L-The;血ne의 경우도 이와 같은 작용에 의해서도 기억력회복효과가 있을 수 있다고 판단된다. 실제 본 연구자들의 연구에서 L-theaninee 치매 원인 물질인 beta amyloid에 의한 기억력저하를 회복시켰으며, 신경세포 사가 감소함을 확인하였다(미발표자료). 따라서, L-theanine 이 scopolamine에 의한 AChE의 생성 억제를 통한 신경전달물질의 유지, 보호작용과 기억력회복의 효과적인 후보물질로 판단된다.
- 인체에 특이부작용이 알려져 있지 않다. 실제 연구 결과에서도 L-theaninee 13주 반복투여 독성시험결과에서 특이 부작용이 발견되지 않았으며 NOAEL 치가 4000 ㎎/㎏으로써 매우 안전한 물질로 판단된다.24)이 수치는 본 연구에서 기억력회복 효과가 나타나는 복용량인 4 mg의 1000배로 안전성이 높아 기능성 식품 등에 사용하기에 적합한 이점이 있다고 사료된다.
- 활성을 측정한 결과, 대뇌피질에 비해 해마영역에서 acetylcholinesterase 활성이 높았으며, scopolamine(l ㎎/㎏, i.p.)를 처리한 동물에서 대조군과 비교해서 현저하게 acetylcholinesterasee} 유도되 었다, 7일간 L-theanine을 투여 후 scopolamine(l ㎎/㎏, i.p.)를 처리한 동물에서 acetylcholinesterase 활성은 scopolamine 투여시(대뇌피질 154±41 nmole/min/mg/protein, 해마 136±8.7 nmole/miiVmg/protein)보다 L-theanine 2 ㎎/㎏ 투여 시 30%정도(대뇌피질 90±9.9nmolemin/mgeprotein, 해마 111±17.7 nmole/min/m以protein)로 억제되었고, 4㎎/㎏ 투여 시는 대조군 수준(대뇌피질 32±3.9nmole/min/mg/protein, 해마 70±9 nmole/min/mg/protein)으로 억제되었으며 이는 농도 의존적인 양상을 나타내었다(Fig. 4).
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