[논문]콜라겐 트리펩타이드를 고함량으로 함유하는 콜라겐 가수분해물의 피부 보습 효과

김애향; 김이수; 박철; 신용철; 하민우

doi:10.9721/kjfst.2018.50.4.420

콜라겐 트리펩타이드를 고함량으로 함유하는 콜라겐 가수분해물의 피부 보습 효과
Cutaneous hydration effect of collagen hydrolysate containing collagen tripeptides 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.50 no.4, 2018년, pp.420 - 429

김애향 (아미코젠(주) 바이오텍 R&D 센터) , 김이수 (아미코젠(주) 바이오텍 R&D 센터) , 박철 (아미코젠(주) 바이오텍 R&D 센터) , 신용철 (아미코젠(주) 바이오텍 R&D 센터) , 하민우 (아미코젠(주) 바이오텍 R&D 센터)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 식용 어류로부터 얻은 콜라겐을 효소 처리하여 글라이신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp, GPH)과 같은 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 얻었고, 이 저분자 콜라겐 가수분해물(이하 콜라겐 트리펩타이드)의 피부 보습효과를 생체 외 실험(in vitro)과 생체 내 실험(in vivo)을 설계하여 증명하고자 하였다. 사람의 피부 섬유아세포 HDF 세포를 자외선 조사를 통해 인위적으로 손상된 세포를 만든 후, 콜라겐 트리펩타이드가 이를 회복시키는 정도를 몇 가지 보습인자의 활성과 발현량으로 확인하였다. Ceramide kinase의 효소활성은 콜라겐 트리펩타이드의 농도에 의존적으로 증가하였고, hyaluronic acid의 농도 역시 유의적으로 증가하였다. 더불어 히알루론산을 합성하는 유전자인 HAS2의 mRNA와 단백질 발현량이 시료의 처리양에 비례하여 증가하였고, 히알루론산을 분해하는 효소인 HYAL1의 수준은 콜라겐 트리펩다이드의 농도에 의존적으로 감소하였다. 상기의 효과는 1형 콜라겐을 합성하는 Collagen 1A 유전자의 단백질 발현량과 피부염증과 종양발생 시 증가한다고 알려진 CD44의 발현량의 확인으로 증명되었다. 유기용매의 도포로 피부건조를 유도한 동물모델을 사용하여 콜라겐 트리펩타이드의 피부에의 유효성을 평가하기 위해 경피수분손실량(TEWL)와 수분함유량을 직접적으로 측정한 바, 콜라겐 트리펩타이드 34 mg/kg bw의 고용량 처리군에서 가장 긍정적인 변화가 확인되었으나 17 mg/kg bw의 콜라겐 트리펩타이드 처리군에서도 수분함량에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 이는 피부 건조로 유도된 가려움증에 대하여 동물이 자신의 몸을 긁는 행위를 계수한 결과와 같은 양상을 보였다. 또한 피부가 건조할 시 유도될 수 있는 염증인자인 $TNF-{\alpha}$와 IL-6의 단백질 발현량을 동물 피부 조직을 적출하여 확인하였고, 염색법을 통하여 피부 진피 내 탄력섬유의 변화를 가시적으로 제시하였다. 이 피부 조직에서의 Collagen 1A와 AQP3의 단백질 발현량 및 세라마이드 키나이제, HAS2, 그리고 HYAL1 효소활성 결과는 상기의 누적된 콜라겐 트리펩타이드의 보습 효과를 더불어 증명하여 주었다. 이상의 결과로부터 본 연구의 저자는 콜라겐 트리펩타이드가 피부 보습에 효능을 갖는 소재로서 활용가치가 높음을 알 수 있었으며, 현재 시장에서 유통되고 있는 분자량 1000 Da 이상의 콜라겐 가수분해물보다도 저분자화 되며 트리펩타이드를 다량 함유하는 상기의 소재가 증명된 유효성과 증가된 체내 흡수도에 근거하여 보다 확장된 가능성을 보여줄 수 있을 것이라 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Skin ageing is associated with compromised performance of its fundamental barrier functions, with undesirable changes in appearance. Since this may introduce a detrimental impact on the quality of life, significant effort to discover effective ingredients against ageing is being invested. Recently, collagen hydrolysates containing tripeptides such as GlyPro-Hyp (GPH) have been developed with anticipation of improved effects compared to that of existing collagen hydrolysate-products. To evaluate the cutaneous hydration effect of collagen tripeptides (CTP), meaningful biomarkers in human dermal fibroblasts (HDF) and NC/Nga Tnd mice were analyzed in this study. Increased levels of ceramide kinase, hyaluronic acid, collagen 1A, and hyaluronan synthase-2 (HAS2), and decreased levels of hyaluronidase-1 (HYAL1) and CD44 in HDF cells were demonstrated. Furthermore, significant reduction of transepidermal water loss (TEWL), scratching behavior, HYAL1, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 and increased water content and HAS2 were verified by in vivo tests. These results strongly suggest the potential of CTP as a skin hydration agent.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

3에서 확인할 수 있듯이 콜라겐 트리펩타이드를 처리한 CTP70군에서는 UVB 조사로 감소한 HAS2의 단백질 발현을 증가시켰고, 증가했던 HYAL1의 단백질 발현은 감소하는 경향을 보였다. 더불어 Collagen 1A의 단백질 발현을 확인하고자 하였는데 이는 콜라겐 합성 유전자로서 이것의 발현증가는 직접적인 피부 조직의 콜라겐함량 증가를 의미한다. Fig.
동물실험에서 Collagen 1A와 AQP3 (aquaporin 3)의 단백질 발현량을 확인해 보았다. Figure 8에서 확인할 수 있듯이 피부 건조를 유발한 C군에서 Collagen 1A 단백질 발현량이 줄어들었고, 콜라겐 트리펩티이드를 경구 투여한 CTP군에서는 그 발현량이 유의적인 수준은 아니었으나 증가함을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 식용 어류로부터 얻은 콜라겐을 효소 처리하여 글라이신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp, GPH)과 같은 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 얻었고, 이 저분자 콜라겐 가수분해물(이하 콜라겐 트리펩타이드)의 피부 보습효과를 생체 외 실험(in vitro)과 생체 내 실험(in vivo)을 설계하여 증명하고자 하였다. 사람의 피부 섬유아세포 HDF 세포를 자외선 조사를 통해 인위적으로 손상된 세포를 만든 후, 콜라겐 트리펩타이드가 이를 회복시키는 정도를 몇 가지 보습인자의 활성과 발현량으로 확인하였다.
피부 보습 효능과 관련된 유전자로는 HAS2 (hyaluronan synthase-2), HYAL1 (hyaluronidase-1) 그리고 Collagen 1A가 대표적이다(Michelacci, 2003; Stern과 Jedrzejas, 2006; Wang 등 2014). 본 연구에서는 콜라겐 트리펩타이드의 처리로 인하여 상기의 유전자들의 mRNA와 단백질 발현정도를 확인하였다. Fig.
본 연구에서는 현재까지 알려진 콜라겐 펩타이드보다 더 작은 평균 분자량(500 Da)을 가지며, N-말단에 글라이신(G, Gly)을 가지는 트리펩타이드(Gly-X-Y)의 함량이 전체 펩타이드 혼합물의 20% 이상을 차지하는 저분자 가수분해물인 ‘콜라겐 트리펩타이 드’에 대한 유효성 평가를 시행하고자 하였다.
세포실험에서 확인한 바와 같이 동물실험에서도 콜라겐 트리펩타이드가 피부 조직에서 HAS2, HYAL1의 효소활성에 어떠한 변화를 유도하는지 확인하였다. HYAL1의 경우, 피부 건조에 의해 C군에서 HYAL1의 발현이 p<0.

제안 방법

(주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화 및 사육을 거치었고 사육온도 22±3℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간 12시간(07:00~19:00)을 유지하며 사육하였다.
5 unit Taq polymerase (Qiagen, German town, MD, USA)를 섞고 94℃ 5분, 95℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 30초, 72℃ 10분, 35 cycles로 PCR를 실시하였다. 1.5% agarose gel (ARMNESCO, Cleveland, OH, USA)에서 전기영동을 실시하였으며, ethidium bromide (Sigma Aldrich)로 염색하여 특정 band를 확인하였다. 본 실험의 RT-PCR에 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다.
96-well plate에 well당 0.5×104 cells로 HDF cell를 분주하고 24시간 동안 배양한 후 콜라겐 트리펩타이드를 농도별(20, 30, 50, 100, 150, 200 μg/mL)로 첨가한 배지로 교체한 뒤 48시간 동안 배양하였다.
단백질 분석을 위해 피부 조직을 cell lysis buffer에 넣고 균질기로 조직을 파쇄한 후 원심분리하여 상층액만 취하였다. Bradford assay로 단백질을 정량한 후, SDS-PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. Semi-dry transfer system (Bio-Rad)을 이용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane에 이동시킨 후 Collagen 1A, AQP3, HYAL1, HAS2 (Santa Cruz Bio-technology), CD44, IL-6 (Abcam, Cambridge, MA, USA)과 TNF-α의 발현 정도를 ChemiDoc XRS+ system (Bio-Rad) 장비를 이용하여 관찰하였으며 GAPDH로 보정하였다.
CTP군은 17 mg/kg bw과 34 mg/kg bw, 두 가지의 용량으로 4주간 경구 투여시킨 실험군이며, 실험동물의 체중변화는 일주일에 1회 저울(Sartorius, Göttingen, Germany)을 통해 측정하였다.
CTP군은 실험물질인 콜라겐 트리펩타이드 처리군으로 무혈청 배양액에 녹여 두 종의 농도(35, 70 μg/mL)로 처리하였다.
HDF cell를 1×106 cells/well의 밀도로 100 mm plate에 분주하여 안정화시킨 후 5개의 실험군의 설정값에 따라 시료의 처리와 UVB 조사를 실시하였으며, 각 군마다 3번 반복 실험하였다.
HDF 세포에 각 실험군에 설정된 시료의 처리와 자외선 조사를 실시한 후, 24시간 배양한 다음 배양액을 수거하여 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 이용하여 ceramide kinase (MyBioSource, San Diego, CA, USA)와 hyaluronic acid (HA, Echelon Biosciences Inc., Salt Lake City, UT, USA)의 농도를 측정하였다.
본 연구의 생체 내 실험에서는 5개의 군, 각 10마리씩을 설정하였다. N군은 정상(normal)군으로 6주령의 Balb-C mouse를 사용하였으며 C군(control, 음성대조군)과 NAG군(N-acetylglucosamine, 양성대조군) 그리고 CTP군(콜라겐 트리펩타이드 처리군)은 6주령의 NC/Nga Tnd 마우스를 사용하여 시료의 처리 전 피부 건조를 유도시켰다. 피부 표피의 수분을 방출시키기 위해 희생되어 해부되기 1주일 전부터 아세톤(acetone)과 에테르(ether)를 1:1로 섞은 용액에 화장솜(2×2 cm)을 적신 후, 등에 15초간 올려놓은 뒤 30초간 같은 부분을 증류수로 닦아내어 피부 건조 모델을 구축하였다(Okawa 등, 2012).
단백질 분석을 위해 시료의 처리와 자외선 조사 이후 24시간의 배양시간을 거친 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하여 cell scraper로 세포를 회수하였다. RIPA (radiommunoprecipitation assay) buffer를 넣고 세포를 용해시켜 4℃, 13,000 rpm, 20분간 원심분리를 수행하였다(Zor와 Selinger, 1996). Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하고, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분리하였다.
Semi-dry transfer system (Bio-Rad)을 이용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane에 이동시킨 후 Collagen 1A, AQP3, HYAL1, HAS2 (Santa Cruz Bio-technology), CD44, IL-6 (Abcam, Cambridge, MA, USA)과 TNF-α의 발현 정도를 ChemiDoc XRS+ system (Bio-Rad) 장비를 이용하여 관찰하였으며 GAPDH로 보정하였다.
콜라겐 트리펩타이드가 HDF 세포에 독성을 미치는지 여부를 평가하기 위하여 세포독성 평가를 선행하였다. WST-1 용액(watersoluble tetrazolium salt assay, Daeil Lab Service, Cheongju, South Korea)을 이용하여 시료 처리군에 대한 세포생존율을 대조군에 대한 생존율과 비교하여 백분율로 표시하였다(Tominaga 등, 1999). 96-well plate에 well당 0.
1×TBST buffer로 10분, 3회 세척 후, primary antibody인 Collagen 1A, hyaluronanidase-1 (HYAL1), hyaluronan synthase-2 (HAS2), CD44 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 처리하였고, 이후 4℃ overnight 반응시킨 후 1×TBST buffer로 10분, 3회 세척하였다. Western blot detection kit (Abfrontier, West Save Gold, Seoul, South Korea)를 이용하여 membrane과 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ system (Bio-Rad) 장비를 이용하여 발현 정도를 관찰하였으며, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Santa Cruz Biotechnology)로 그 값을 보정하였다.
cDNA로부터 유전자를 증폭하기 위하여, 1 μL cDNA, 0.5 mM의 5'과 3' primer, 10X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 200 mM dNTP, 25 mM MgCl2, 2.5 unit Taq polymerase (Qiagen, German town, MD, USA)를 섞고 94℃ 5분, 95℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 30초, 72℃ 10분, 35 cycles로 PCR를 실시하였다.
각 실험군의 경피수분손실량을 측정하기 위해 측정대상의 동물들을 항온항습시설(온도 21.5±2℃, 상대습도 40±5%)에서 30분 이상 안정을 취하게 한 후, Vapometer (Delfin Technologies Ltd, Kuopio, Finland)를 이용하여 피부 표면으로부터 증발되는 수분의 양을 측정하였고, 이 때 3회 반복하여 수치가 안정화되는 구간의 평균값을 기록하였다.
CTP군은 실험물질인 콜라겐 트리펩타이드 처리군으로 무혈청 배양액에 녹여 두 종의 농도(35, 70 μg/mL)로 처리하였다. 각각 물질 처리 후 2시간을 배양하였고, 이후 배지를 제거한 후 PBS를 첨가하고 UVB를 75 mJ/cm²의 선량으로 2분간 조사하였다.
단백질 분석을 위해 시료의 처리와 자외선 조사 이후 24시간의 배양시간을 거친 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하여 cell scraper로 세포를 회수하였다. RIPA (radiommunoprecipitation assay) buffer를 넣고 세포를 용해시켜 4℃, 13,000 rpm, 20분간 원심분리를 수행하였다(Zor와 Selinger, 1996).
또한 피부가 건조할 시 유도될 수 있는 염증인자인 TNF-α와 IL-6의 단백질 발현량을 동물 피부 조직을 적출하여 확인하였고, 염색법을 통하여 피부 진피 내 탄력섬유의 변화를 가시적으로 제시하였다.
본 연구에서는 식용 어류로부터 얻은 콜라겐을 효소 처리하여 글라이신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp, GPH)과 같은 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 얻었고, 이 저분자 콜라겐 가수분해물(이하 콜라겐 트리펩타이드)의 피부 보습효과를 생체 외 실험(in vitro)과 생체 내 실험(in vivo)을 설계하여 증명하고자 하였다. 사람의 피부 섬유아세포 HDF 세포를 자외선 조사를 통해 인위적으로 손상된 세포를 만든 후, 콜라겐 트리펩타이드가 이를 회복시키는 정도를 몇 가지 보습인자의 활성과 발현량으로 확인하였다. Ceramide kinase의 효소활성은 콜라겐 트리펩타이드의 농도에 의존적으로 증가하였고, hyaluronic acid의 농도 역시 유의적으로 증가하였다.
본 연구는 (주)동남의화학연구원 동물실험위원회(SEMI, Institutional Animal Care and Use committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다(윤리승인번호: SEMI-16-06). 사육기간이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 후, CO₂로 마취시킨 후 피부를 적출하였고, 적출한 피부 조직은 생리식염수로 세척한 후 여지로 수분을 제거하여 다음 실험에 사용하였다.
세포배양은 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Welgene, Seoul, Korea)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Welgene, Seoul, Korea)과 1% 항생제 용액(penicillin-streptomycin solution, Gibco, Waltham, MA, USA)을 첨가한 후 37℃에서 5% CO2 배양기(SANYO, Osaka, Japan)에서 진행하였고, 2-3일 간격으로 계대배양 하였다.
실험 군에 설정된 값의 처리가 가려움증을 억제하는 효과가 어느 정도인지를 확인하기 위해 동물이 자신의 몸을 긁는 모습을 관찰하고 그 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 같은 군의 동물들은 하나의 우리 내에서 10분간 관찰되었고, 각각 몇 번을 긁는지를 확인하였다.
실험 군에 설정된 값의 처리가 피부 보습에 미치는 영향 및 특성을 확인하기 위하여 피부 건조가 유발된 부위에 피부 수분 함량측정기, Corneometer CM 820 (Courage-hazake, Koln, Germany)을 이용하여 피부 수분량을 측정하였다. 항온 항습시설(온도 21.
이후 4 μm 두께로 절편을 만들어 슬라이드를 제작하고 실온에서 Bouin 용액에 하룻밤 담근 후 Masson’s trichrome 염색을 실시하였다. 염색된 슬라이드의 광학현미경(Nikon Co., Tokyo, Japan) 관찰을 통하여 진피 층 내 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 확인하였다.
이러한 염증에 관여하는 인자인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 확인해 보았다(Fig. 6).
이후 4 μm 두께로 절편을 만들어 슬라이드를 제작하고 실온에서 Bouin 용액에 하룻밤 담근 후 Masson’s trichrome 염색을 실시하였다.
적출한 피부 조직을 측정 인자들에 맞는 각각의 완충용액(buffer)로 마쇄한 후 ceramide kinase (MyBioSource)와 HA (Echelon Biosciences Inc.)의 효소활성을 microplate reader (Bio-TEK)를 이용하여 측정하였다.
총 트리펩타이드의 함량은 어떠한 아미노산의 세가지 조합으로 이루어진 화합물들 전체를 HPLC로 동정하였고, 그 중 본 원료의 지표성분이라 할 수 있는 GPH의 함량은 표준품(Bachem, Bubendorf, Switzerland)을 구매하여 HPLC 분석을 통해 [(검액 중의 GPH 면적×표준품 채취량(g))/(표준용액중의 GPH면적×검액 채취량(g))]×검액의 희석배수×표준품 순수 농도 (%)로서 분석하였다.
콜라겐 트리펩타이드가 HDF 세포에 독성을 미치는지 여부를 평가하기 위하여 세포독성 평가를 선행하였다. WST-1 용액(watersoluble tetrazolium salt assay, Daeil Lab Service, Cheongju, South Korea)을 이용하여 시료 처리군에 대한 세포생존율을 대조군에 대한 생존율과 비교하여 백분율로 표시하였다(Tominaga 등, 1999).
콜라겐 트리펩타이드의 피부 보습 효과를 알아보기 위해 세라마이드 키나이제(ceramide kinase, CERK)와 히알루론산(hyaluronic acid, HA)의 세포에서의 농도변화를 측정하였다. 세라마이드(ceramide)는 피부 표피의 각질층을 구성하는 피부 지질의 구성 물질로서 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되어 생성되는데, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes)사이의 공간을 채워 세포간의 결합력을 제공하는 역할을 하며, 세라마이드의 감소가 피부 보호막의 기능저하의 원인이 된다는 연구가 다수 보고된 바 있다(Di Marzio 등, 2008; Imokawa 등, 1991).
피부 표피의 수분을 방출시키기 위해 희생되어 해부되기 1주일 전부터 아세톤(acetone)과 에테르(ether)를 1:1로 섞은 용액에 화장솜(2×2 cm)을 적신 후, 등에 15초간 올려놓은 뒤 30초간 같은 부분을 증류수로 닦아내어 피부 건조 모델을 구축하였다(Okawa 등, 2012).
피부의 조직학적 형태의 비교를 위해 실험 종료 이후 절취한 피부 조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 조직 처리방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투시키고 파라핀에 포매하였다. 이후 4 μm 두께로 절편을 만들어 슬라이드를 제작하고 실온에서 Bouin 용액에 하룻밤 담근 후 Masson’s trichrome 염색을 실시하였다.
항온 항습시설(온도 21.5±2℃, 상대습도 40±5%)에서 30분 이상 안정을 취하게 한 후 일정영역을 표시하여 수분량을 측정하였다.

대상 데이터

즉 피부 각질층의 수분도 조절에 있어 세라마이드의 농도 조절이 필수적이며 세라마이드 키나아제는 세라마이드를 인산화시키는 효소로 이것의 농도 증가는 세라마이드의 함량증가를 반증한다. 더불어 히알루론산은 피부에 존재하는 고분자물질로 이것이 가지는 다수의 친수성 작용기에 근거한 피부 보습작용이 명료하게 알려져 있기에 본 연구에서 이를 보습인자로서 선정하였다(Papakonstantinou 등, 2012). C군에서 보이는 것처럼 HDF 세포의 UVB 조사는 세라마이드 키나아제와 히알루론산의 농도를 각각 유의 수준으로(p<0.
본 생체 내 실험에 사용한 동물은 생후 6주령의 Balb-c mouse (Samtako BioKorea Co., Osan, Korea)와 생후 6주령의 NC/Nga Tnd mouse (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea)를 공급받아 사용하였다. (주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화 및 사육을 거치었고 사육온도 22±3℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간 12시간(07:00~19:00)을 유지하며 사육하였다.
본 실험에서 사용한 콜라겐 트리펩타이드는 아미코젠 주식회사(Amicogen Inc., Jinju, South Korea)에서 제조한 소재를 사용하였다. 이는 틸라피아의 어피를 Bacillus종의 비병원성 박테리아를 이용한 콜라겐 가수분해효소 2종을 처리하여 얻은 저분자콜라겐 가수분해물(Collagen-Tripep20S, CTP)로서 평균분자량 500 Da을 가지며 트리펩타이드 함량 20%, GPH (Glycine-Proline-Hydroxyproline) 함량 3.
본 연구의 생체 내 실험에서는 5개의 군, 각 10마리씩을 설정하였다. N군은 정상(normal)군으로 6주령의 Balb-C mouse를 사용하였으며 C군(control, 음성대조군)과 NAG군(N-acetylglucosamine, 양성대조군) 그리고 CTP군(콜라겐 트리펩타이드 처리군)은 6주령의 NC/Nga Tnd 마우스를 사용하여 시료의 처리 전 피부 건조를 유도시켰다.
(주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화 및 사육을 거치었고 사육온도 22±3℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간 12시간(07:00~19:00)을 유지하며 사육하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Samtako BioKorea Co.)를 급여하였고, 음수는 자유 섭취시켰다. 본 연구는 (주)동남의화학연구원 동물실험위원회(SEMI, Institutional Animal Care and Use committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다(윤리승인번호: SEMI-16-06).
생체 외 세포실험에서는 사람의 피부 섬유아세포인 HDF 세포(Human Dermal Fibroblast cell, PromoCell, Heidelberg, Germany)를 사용하였다. 세포배양은 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Welgene, Seoul, Korea)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Welgene, Seoul, Korea)과 1% 항생제 용액(penicillin-streptomycin solution, Gibco, Waltham, MA, USA)을 첨가한 후 37℃에서 5% CO₂ 배양기(SANYO, Osaka, Japan)에서 진행하였고, 2-3일 간격으로 계대배양 하였다.

데이터처리

생체 외 실험(세포실험)과 생체 내 실험(동물실험)의 결과는 평균±표준오차로 표기하였다.
생체 외 실험(세포실험)과 생체 내 실험(동물실험)의 결과는 평균±표준오차로 표기하였다. 통계적 유의성 검정은 ANOVA 검사(Statview Inc., Nesbit, MS, USA)로 실시하였으며 p-value 값이 0.05 미만이거나 0.001 미만일 때, 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

이론/모형

RIPA (radiommunoprecipitation assay) buffer를 넣고 세포를 용해시켜 4℃, 13,000 rpm, 20분간 원심분리를 수행하였다(Zor와 Selinger, 1996). Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하고, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분리하였다. Semi-dry transfer system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane에 이동시킨 후 5% skim milk를 함유한 blocking buffer (5% skim milk, 1×TBST buffer)를 1시간 동안 처리하였다.

성능/효과

7은 Masson’s trichrome 염색을 통해 피부 진피 내 탄력섬유의 변화를 관찰한 결과이다. C군은 건조증 유도에 의해 진피 내 변성된 탄력섬유를 쉽게 확인할 수 있었으며, 4주간 시료 처리로 탄력 섬유가 C군에 비해 상대적으로 많이 조밀해지고 푸른색으로 염색이 된 콜라겐의 양도 N군에 비해 확연히 줄어들었다. 하지만 NAG군 및 시료를 4주간 처리한 CTP 투여군 모두 콜라겐의 양이 C군과 비교하여 볼 때, 상대적으로 증가하여 푸른색으로 보다 진하게 염색되었으며, 이는 콜라겐 트리펩타이드의 경구 투여가 NC/Nga Tnd 마우스에서 아세톤과 에테르로 유도된 피부 건조에도 불구하고 피부 조직 내 콜라겐 층을 유지시키며, 피부 건조를 효과적으로 차단하여 교원질 섬유구조 형태를 조밀하게 유지시킨 것으로 판단된다.
HAS2와 HYAL1의 단백질 발현 양상 역시 mRNA의 발현양상과 유사하였다. Fig. 3에서 확인할 수 있듯이 콜라겐 트리펩타이드를 처리한 CTP70군에서는 UVB 조사로 감소한 HAS2의 단백질 발현을 증가시켰고, 증가했던 HYAL1의 단백질 발현은 감소하는 경향을 보였다. 더불어 Collagen 1A의 단백질 발현을 확인하고자 하였는데 이는 콜라겐 합성 유전자로서 이것의 발현증가는 직접적인 피부 조직의 콜라겐함량 증가를 의미한다.
HYAL1의 경우, 피부 건조에 의해 C군에서 HYAL1의 발현이 p<0.05 유의수준으로 N군에 비해 증가하였으며, 4주간의 시료투여로 인하여 특히 CTP 17에서 p<0.05 유의수준으로 HYAL1 발현량이 감소하였다.
6). 건조가 유도된 콜라겐 트리펩타이드를 경구투여한 CTP군에서는 해당 면역인자들의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, IL-6의 경우 CTP 17군에서 p<0.
건조증이 유발되고 어떤 시료의 처리를 하지 않은 C군에서는 p<0.05 유의수준으로 긁는 횟수가 증가하였고, 양성대조군과 콜라겐 트리펩타이드 시료 투여를 한 군에서는 긁는 횟수가 확연히 감소함을 확인하였다(p<0.05).
Ceramide kinase의 효소활성은 콜라겐 트리펩타이드의 농도에 의존적으로 증가하였고, hyaluronic acid의 농도 역시 유의적으로 증가하였다. 더불어 히알루론산을 합성하는 유전자인 HAS2의 mRNA와 단백질 발현량이 시료의 처리양에 비례하여 증가하였고, 히알루론산을 분해하는 효소인 HYAL1의 수준은 콜라겐 트리펩다이드의 농도에 의존적으로 감소하였다. 상기의 효과는 1형 콜라겐을 합성하는 Collagen 1A 유전자의 단백질 발현량과 피부염증과 종양발생 시 증가한다고 알려진 CD44의 발현량의 확인으로 증명되었다.
CD44는 세포 간 부착(cell-cell adhesion)과 신호전달(cell signaling)에 중요한 역할을 하나 종양세포 및 염증세포에서 악성진행(malignant progression) 및 암세포의 전이(metastasis), 그리고 미생물의 침입(invasion)에 관여함이 밝혀진 바 있다(Naor 등, 1997; Puré와 Cuff, 2001). 따라서 본 연구에서는 CD44의 발현 감소여부를 피부 건강의 유효성평가 근거로 선정하였고, Fig. 4에 나타난 바와 같이 CPT70군에서는 이 항원의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 4).
001) 증가하였다. 따라서 세포에의 콜라겐 트리펩타이드의 처리는 피부 보습인자의 증가에 직접적으로 관여하는 것이 확인되었다(Fig. 1).
N군, C군, NAG군 및 CTP 용량 별 처리군으로 총 5개의 시험군, 총 50마리의 동물에서 4주간의 시료의 경구투여 과정에서 사망하거나 특이한 소견이 관찰된 경우는 없었다. 모든 군에서 예상 가능한 성장에 따른 고른 체중변화를 나타내었으며, 시험기간에 걸쳐 체중증가에 관한 어떠한 통계적인 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
AQP3는 세포막의 기저 외층에 존재하는 수분의 이동통로를 합성하는 유전자로 건선을 앓고 있는 환자의 피부에서 건강한 경우보다 그 발현량이 현저히 감소되어 있는 것으로 알려져 있다(Sasaki 등, 1998). 본 동물실험에서 4주간의 콜라겐 트리펩타이드의 경구 투여 후, 동물의 피부 조직을 분석하여 AQP3 발현량을 확인한 바 CTP 17군에서 AQP3가 많이 발현된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
더불어 히알루론산을 합성하는 유전자인 HAS2의 mRNA와 단백질 발현량이 시료의 처리양에 비례하여 증가하였고, 히알루론산을 분해하는 효소인 HYAL1의 수준은 콜라겐 트리펩다이드의 농도에 의존적으로 감소하였다. 상기의 효과는 1형 콜라겐을 합성하는 Collagen 1A 유전자의 단백질 발현량과 피부염증과 종양발생 시 증가한다고 알려진 CD44의 발현량의 확인으로 증명되었다. 유기용매의 도포로 피부 건조를 유도한 동물모델을 사용하여 콜라겐 트리펩타이드의 피부에의 유효성을 평가하기 위해 경피수분손실량(TEWL)와 수분 함유량을 직접적으로 측정한 바, 콜라겐 트리펩타이드 34 mg/kg bw의 고용량 처리군에서 가장 긍정적인 변화가 확인되었으나 17 mg/kg bw의 콜라겐 트리펩타이드 처리군에서도 수분함량에서 유의적인 변화가 관찰되었다.
05 유의수준으로 낮아지는 것이 관찰되었다 각질층의 수분함량은 표피에서 생성·분비되는 지질, 흡착체인 피지막과 각질층 내 존재하는 수용성 성분인 자연보습인자(natural moisture factor, NMF)에 의해 결정되며, 표피의 수분증발은 세라마이드 및 자연보습인자의 함량변화와 관련된다(Jacobi, 1959; Spencer, 1976). 시험군의 각질층의 수분함량을 직접적으로 측정한 결과 역시 N군의 동물 군은 표피층의 수분함량의 변화가 없었으나, CTP군에서는 C군에 비해 수분함량이 유의적이면서 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 5).
상기의 효과는 1형 콜라겐을 합성하는 Collagen 1A 유전자의 단백질 발현량과 피부염증과 종양발생 시 증가한다고 알려진 CD44의 발현량의 확인으로 증명되었다. 유기용매의 도포로 피부 건조를 유도한 동물모델을 사용하여 콜라겐 트리펩타이드의 피부에의 유효성을 평가하기 위해 경피수분손실량(TEWL)와 수분 함유량을 직접적으로 측정한 바, 콜라겐 트리펩타이드 34 mg/kg bw의 고용량 처리군에서 가장 긍정적인 변화가 확인되었으나 17 mg/kg bw의 콜라겐 트리펩타이드 처리군에서도 수분함량에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 이는 피부 건조로 유도된 가려움증에 대하여 동물이 자신의 몸을 긁는 행위를 계수한 결과와 같은 양상을 보였다.
또한 피부가 건조할 시 유도될 수 있는 염증인자인 TNF-α와 IL-6의 단백질 발현량을 동물 피부 조직을 적출하여 확인하였고, 염색법을 통하여 피부 진피 내 탄력섬유의 변화를 가시적으로 제시하였다. 이 피부 조직에서의 Collagen 1A와 AQP3의 단백질 발현량 및 세라마이드 키나이제, HAS2, 그리고 HYAL1 효소활성 결과는 상기의 누적된 콜라겐 트리펩타이드의 보습 효과를 더불어 증명하여 주었다. 이상의 결과로부터 본 연구의 저자는 콜라겐 트리펩타이드가 피부 보습에 효능을 갖는 소재로서 활용가치가 높음을 알 수 있었으며, 현재 시장에서 유통되고 있는 분자량 1000 Da 이상의 콜라겐 가수분해물보다도 저분자화 되며 트리펩타이드를 다량 함유하는 상기의 소재가 증명된 유효성과 증가된 체내 흡수도에 근거하여 보다 확장된 가능성을 보여줄 수 있을 것이라 판단된다.
, Jinju, South Korea)에서 제조한 소재를 사용하였다. 이는 틸라피아의 어피를 Bacillus종의 비병원성 박테리아를 이용한 콜라겐 가수분해효소 2종을 처리하여 얻은 저분자콜라겐 가수분해물(Collagen-Tripep20S, CTP)로서 평균분자량 500 Da을 가지며 트리펩타이드 함량 20%, GPH (Glycine-Proline-Hydroxyproline) 함량 3.2%를 보였다. 총 트리펩타이드의 함량은 어떠한 아미노산의 세가지 조합으로 이루어진 화합물들 전체를 HPLC로 동정하였고, 그 중 본 원료의 지표성분이라 할 수 있는 GPH의 함량은 표준품(Bachem, Bubendorf, Switzerland)을 구매하여 HPLC 분석을 통해 [(검액 중의 GPH 면적×표준품 채취량(g))/(표준용액중의 GPH면적×검액 채취량(g))]×검액의 희석배수×표준품 순수 농도 (%)로서 분석하였다.
콜라겐 트리펩타이드의 세포독성여부를 확인하기 위해 농도 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 처리에 따른 HDF 세포의 세포생존율을 측정한 결과, 콜라겐 트리펩타이드 200 μg/mL 농도까지 세포독성을 보이지 않은 바 콜라겐 트리펩타이드가 설정된 농도범위에서 안전함이 검증되었다.
피부 건조 유도로 인해 C군의 ceramide kinase 효소활성은 N군에 비해 p<0.001 유의수준으로 감소하였으나 4주간 콜라겐 트리펩타이드 17 mg/kg bw 및 34 mg/kg bw 처리로 인하여 각각 p<0.05, p<0.001 유의수준으로 ceramide kinase 효소 활성이 명백히 증가한 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
C군은 건조증 유도에 의해 진피 내 변성된 탄력섬유를 쉽게 확인할 수 있었으며, 4주간 시료 처리로 탄력 섬유가 C군에 비해 상대적으로 많이 조밀해지고 푸른색으로 염색이 된 콜라겐의 양도 N군에 비해 확연히 줄어들었다. 하지만 NAG군 및 시료를 4주간 처리한 CTP 투여군 모두 콜라겐의 양이 C군과 비교하여 볼 때, 상대적으로 증가하여 푸른색으로 보다 진하게 염색되었으며, 이는 콜라겐 트리펩타이드의 경구 투여가 NC/Nga Tnd 마우스에서 아세톤과 에테르로 유도된 피부 건조에도 불구하고 피부 조직 내 콜라겐 층을 유지시키며, 피부 건조를 효과적으로 차단하여 교원질 섬유구조 형태를 조밀하게 유지시킨 것으로 판단된다.

후속연구

이 피부 조직에서의 Collagen 1A와 AQP3의 단백질 발현량 및 세라마이드 키나이제, HAS2, 그리고 HYAL1 효소활성 결과는 상기의 누적된 콜라겐 트리펩타이드의 보습 효과를 더불어 증명하여 주었다. 이상의 결과로부터 본 연구의 저자는 콜라겐 트리펩타이드가 피부 보습에 효능을 갖는 소재로서 활용가치가 높음을 알 수 있었으며, 현재 시장에서 유통되고 있는 분자량 1000 Da 이상의 콜라겐 가수분해물보다도 저분자화 되며 트리펩타이드를 다량 함유하는 상기의 소재가 증명된 유효성과 증가된 체내 흡수도에 근거하여 보다 확장된 가능성을 보여줄 수 있을 것이라 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	피부란?	피부는 신체의 외부를 둘러싸고 있는 기관으로 외부의 유해한 자극에 대하여 장벽의 역할을 수행하고, 체내의 불필요한 수분과 전해질의 외부 유출을 방지한다. 또한 피부는 체온조절과 촉각, 압각, 통각, 온도 자극에 대한 감각기능을 가지며, 면역기능의 활성화에도 관여한다고 알려져 있다(Randall과 Visscher, 2006).
	피부가 건조할 때 피부 건조증이 유발되는 이유는?	각질층은 피부의 가장 바깥층으로 기저층에서 생성된 세포가 각화작용에 의해 죽은 세포로 피부 단백질 가수분해효소에 의해 매일 분해되어 우리 몸에서 떨어져 나가며, 이 각질층의 분리를 일으키는 단백질 가수분해효소는 충분한 수분이 존재하여야만 활성화될 수 있다. 하지만 피부가 건조한 상태에서는 각질층의 자연박리가 적절히 일어나지 못하여 피부에 남아있게 되고, 피부 피지선의 기능이 제 기능을 하지 못하게 되어 피부 건조증이 유발된다. 그리하여 피부의 건강을 지키는 관점에서 피부 보습 효과를 일으키는 성분의 발굴에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다(Verdier-Sévrain과 Bonté, 2007).
	트리펩타이드, Gly-Pro-Hyp의 어떤 특징 때문에 이를 많이 함유한 콜라겐 트리펩타이드를 연구하게 되었는가?	또한 콜라겐 트리펩타이드 중 글라이신, 프롤린 그리고 하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp, GPH) 조합의 펩타이드의 함량을 별도로 동정하였는데, 이 트리펩타이드는 배양된 활막세포에서 섬유아세포에 화학주성으로 작용하고, 히알루론산의 생산을 촉진한다고 알려진 유효물질이다(Kim 등, 2009; Lee 등, 2008; Ohara 등, 2010). 트리펩타이드, Gly-Pro-Hyp는 Sprague-Dawley rat의 위액에서 2시간 동안 분해되지 않았고 소장의 세포층을 가로질러 전신순환계로 흡수된다는 것이 밝혀져 있다(Aito-Inoue 등, 2007; Sontakke 등, 2016). 따라서 이를 많이 함유하는 콜라겐 트리펩타이드의 피부에 대한 유효성이 검증된다면 기존의 콜라겐 펩타이드보다 개선된 생체 이용률과 기능성으로 이것이 가지는 잠재적 가치가 다분하다 할 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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