Methylovorus sp. Strain SS1 DSM11726으로부터 rpoH 유전자의 클로닝과 염기서열 분석 Cloning and Nucleotide Sequence Analysis of the rpoH Gene from Methylovorus sp. Strain SS1 DSM11726원문보기
열충격 시그마인자를 코딩하는 유전자 rpoH가 결여된 돌연변이체 대장균(Escherichia coli satrain A7448)을, 메탄올 자화세균인 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 phagemid library로 형질전환 시켜서 $30^{\circ}C$에서 성장하는 Escherichia colistrain A7448 로부터 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 rpoH 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 1,793-bp 염기서열 분석 결과 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 284개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 32,006, p1값은 5.79로 나타났으며, 동일계열의 ${\beta}$-proteobacteria에 속하는 세균들의 RpoH와 높은 상동성을 보여주었다. Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 대장균의 RpoH의 기능을 대신할 수 있음을 보여주었다. 열충격 후 RpoH양은 15분까지 지속적으로 증가하다 20분 뒤 양이 감소하는 양상을 나타내었다. 이는 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH 단백질 역시 열에 의해 유도됨을 말해 준다.
열충격 시그마인자를 코딩하는 유전자 rpoH가 결여된 돌연변이체 대장균(Escherichia coli satrain A7448)을, 메탄올 자화세균인 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 phagemid library로 형질전환 시켜서 $30^{\circ}C$에서 성장하는 Escherichia coli strain A7448 로부터 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 rpoH 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 1,793-bp 염기서열 분석 결과 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 284개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 32,006, p1값은 5.79로 나타났으며, 동일계열의 ${\beta}$-proteobacteria에 속하는 세균들의 RpoH와 높은 상동성을 보여주었다. Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 대장균의 RpoH의 기능을 대신할 수 있음을 보여주었다. 열충격 후 RpoH양은 15분까지 지속적으로 증가하다 20분 뒤 양이 감소하는 양상을 나타내었다. 이는 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH 단백질 역시 열에 의해 유도됨을 말해 준다.
Using complementation of RpoH deficient E. coli strain A7448, the rpoH gene encoding heat shock sigma factor 32 (${\sigma}^{32}$) from Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726 was cloned and sequenced. Sequence analysis of a stretch of 1,796-bp revealed existence of an open reading frame enco...
Using complementation of RpoH deficient E. coli strain A7448, the rpoH gene encoding heat shock sigma factor 32 (${\sigma}^{32}$) from Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726 was cloned and sequenced. Sequence analysis of a stretch of 1,796-bp revealed existence of an open reading frame encoding a polypeptide of 284 amino acid (32,006 dalton). Deduced amino acid sequence of the Methylovorus sp. strain SS1 RpoH showed that 59.6%, 39.1% and 51.4% identities with those of Nitrosomonas europaea (${\beta}$-proteobacteria), Agrobacterium tumefaciens ($\alpha$-proteobacteria) and E. coli (${\gamma}$-proteobacteria). The expression level of the functional ortholog of RpoH of Methylovorus sp. strain SS1 was increased transiently after heat induction, further indicating that it functions as a heat shock sigma factor.
Using complementation of RpoH deficient E. coli strain A7448, the rpoH gene encoding heat shock sigma factor 32 (${\sigma}^{32}$) from Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726 was cloned and sequenced. Sequence analysis of a stretch of 1,796-bp revealed existence of an open reading frame encoding a polypeptide of 284 amino acid (32,006 dalton). Deduced amino acid sequence of the Methylovorus sp. strain SS1 RpoH showed that 59.6%, 39.1% and 51.4% identities with those of Nitrosomonas europaea (${\beta}$-proteobacteria), Agrobacterium tumefaciens ($\alpha$-proteobacteria) and E. coli (${\gamma}$-proteobacteria). The expression level of the functional ortholog of RpoH of Methylovorus sp. strain SS1 was increased transiently after heat induction, further indicating that it functions as a heat shock sigma factor.
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제안 방법
열충격 동안의。32 수준을 immunoblot을 통해 조사하였다. 30也의 열충격 전 조건에서는 거의 확인할 수 없었던。32 수준은 열충격 5분 후부터 확인 되었으며 약 15분간 지속되다가 떨어지는 양상을 나타내었다(Fig.
strain SSI 에서 대표적인 열충격 유전자인 dnaK와 groE 오페론 유전자를 클로닝 하여 이들의 프로모터 부분을 살펴본 결과 이 세균의 프로모터 영역이 대장균의 /2가 결합할 수 있는 부위와 많은 상동성을 지니고 있음을 알게 되었고[5, 6], 이 세균에서도 역시 <产 homolog에 의한 열충격 반응의 조절 가능성을 생각하게 되었다. 본 논문에서는。32를 암호화하는 rpoH 유전자를 클로닝 하여 특성을 조사하였다.
Chromosomal DNA의 분리는 Goldberg오+ Ohrnan[9]의 방법을 변형하여 수행하였다. 50 mg 기본염류배지에 0.
DNA sequencinge 자동염기서열분석기인 377 automated DNA sequencer(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 이용하였다. 염기서열분석은 National Center for Biotechnology Infor- mation(NCBI)의 Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST)을 통해 수행하였다.
대장균은 Luria-Bertani 배지를 이용하여 37。(3에서 배양하였고 필요에 따라 적절한 항생제를 첨가하였다. Genomic library 제조를 위한 플라스미드로 pBluescript II KS+(Stratagene, USA)를 사용하였다.
strain SSI RpoH sequences to RpoH homologs from other organisms. The dendrogram shown here was constructed employing the DNAS1AR program using the entire sequence lengths and default parameters for similarity computation and sequence alignments.
strain SS1 이 암호화하는 RpoH 아미노산 서열과 비교하였다. 실험균주의 RpoH는 동일 계열의 [3-proteobacteria에 속하는 Nitrosomonas europaea, Neisseria meningitidis, 및 Chromobacterium violaceume 각각 59.
sp. strain SS1의 세포 주출액을 만들어 denaturing 조건하에서 [13], 12.5% polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 gele nylon membrane (Schleicher and Schuell)으로 transfer흐'!였다.
strain SSI DSM11726의 phagemid library로 형질전환 시켜서 30也에서 성장하는 Escherichia coli strain A7448 로부터 Methylovorus sp. strain SSI DSM11726의 zpoH 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 1, 793-bp 염기서열 분석 결과 Methylovorus sp.
Methylovorus sp. strain SSI의 genomic DNA를 제한효소 &小으로 완전 소화하여 , agarose 전기영동을 실시하여 약 3~15 kb 크기의 DNA 절편을 분리하여 미리 동일한 효소로 잘라 놓은 pBluescript II KS+에 ligation시켜 genomic library를 구축하였다.
2 mg lysing solution(10% SDS와 5 mg의 pronase를 1 mg ET buffere] 녹임)을 첨가하여 37。<2에서 1시간 방치하였다. 반응액에 동일 양의 phenol: chloroform:isoamyl alcohol(25:24:l, vol/vol) 용액을 첨가흐} 고 원심분리하여 (15,000xg, 5분, 4℃), 상등액을 취하고, 동일 과정을 3회 반복 하였다. 이렇게 얻은 상등액에 상등액의 세 배 부피로 차가운 ethanol 더하여 엉기는 chromosomal DNA를 유리막대를 이용하여 건져낸 후, 70% ethanol로 세척한 다음 2 mL의 TE buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.
strain SSI genomic DNA가 들어가 있음을 확인하였다. 이 가운데 하나의 클론을 선택하여 pSS32로 명명하고(Fig. 1), 양쪽 방향에서 염기서열을 읽기 시작하여 이로부터 대장균의 中oH 유전자 염기서열과 상동성이 높은 부위인 1, 793 bp Spel-Nrul DNA 절편에 대한 염기서열을 결정하였다(Fig. 2). 염기서열 분석 결과 178번째 nucleotide AUG로 시작하여 1, 032번째 UAA로 끝나는 총 855개로 구성된 1개의 open reading figie이 존재하였다.
strain SSI phagemid library를 대장균 strain A7448에 도입시킨 뒤 X-gal과 IPTG를 넣어준 LB- plate상에 도말하고 3VC에서 배양하였다. 이렇게 해서 선별한 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 이를 다시 E. coli DH5o로 옮긴 다음 플라스미드를 추출하여 앞의 과정을 한번 더 반복하여 확인 과정을 거친 뒤 염기서열을 결정하였다.
대상 데이터
실시하였다. Electroporatione Bio-Rad사의 Gene Pulser""와 Pulse Controller®- 사용하였다.
전기영동이 끝난 gele nylon membrane (Schleicher and Schuell)으로 transfer흐'!였다. Immunoblot을 위한 c产의 항체는 Xanthomonas campestris의(产에 대해 만든 토끼의 혈청 내에 존재하는 polyclonal antibody(대만 National Chung Hsing University의 Ming-Te Yang 박사로부터 분양 받음)를 사용하였으며, detection을 위한 2차 항체는 anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)를 사용하였다.
coll DH5a는 genomic library 구축을 위한 host로 사용하였다. RpoH가 결여된 E. coll strain A7448(KY1612A 中oH[入PF入3-PgroE-LacZ]Ki】n)[l]은 Israel Hebrew 대 학의 A. Oppenheim 박사로부터 분양 받았으며, rpoH 유전자를 찾기 위한 균주로 사용하였다. 대장균은 Luria-Bertani 배지를 이용하여 37。(3에서 배양하였고 필요에 따라 적절한 항생제를 첨가하였다.
pBluescript II KS+에 구축한 Methylovorus sp. strain SS1의 library를 가지고 competent E. coli strain A7448을 형질전환 시켜 X.gal과 IPTG가 함유된 배지에서 30℃ 조건에서 배양하였을 때 10개의 파란색을 띄는 콜로니를 선별하였다. 이들 colony로부터 각각의 DNA를 추출하여 전기영동을 실시하였을 때 모든 콜로니에서 약 5.
제한효소와 T4 DNA ligase는 GIBCO BRL(Gaithers- burg, MD)에서 구입하였다. 제한효소의 사용, DNA ligation 및 기타 DNA 재조합 방법은 Sambrook 등[18]과 시료 제공자의 지시에 따라 수행하였다.
이론/모형
이용하였다. 염기서열분석은 National Center for Biotechnology Infor- mation(NCBI)의 Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST)을 통해 수행하였다.
MD)에서 구입하였다. 제한효소의 사용, DNA ligation 및 기타 DNA 재조합 방법은 Sambrook 등[18]과 시료 제공자의 지시에 따라 수행하였다. 그 외의 시약들은 Sigma 제품 (Sigma Chemical Co.
형질전환은 electroporation[4] 또는 CaCh 방법 [(2)을 병행하여 실시하였다. Electroporatione Bio-Rad사의 Gene Pulser""와 Pulse Controller®- 사용하였다.
성능/효과
rpoH 구조유전자의 번역 종결코돈으로부터 20 nucleotide downstream쪽으로 inverted repeat 구조가 발견되었으며 이 구조가 만드는 stem-loop 2차 구조의 자유에너지는 -156.5 kJ/mcJ로 비교적 높은 수치를 나타내었다. 이러한 사실은 rpoH 유전자 다음에서 rho-independent한 전사 종결이 일어남을 말해 준다.
1, 793-bp 염기서열 분석 결과 Methylovorus sp. strain SSI DSMH726의 RpoH는 284개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 32, 006, p값은 5.79로 나티났으며, 동일계열의 p-proteobacteriae] 속하는 세균들의 RpoH와 높은 상동성을 보여주었다. Methylovorus sp.
3 kb 크기의 Methylovorus sp. strain SSI genomic DNA가 들어가 있음을 확인하였다. 이 가운데 하나의 클론을 선택하여 pSS32로 명명하고(Fig.
우리는 이 전에 Methylovorus sp. strain SSI 에서 대표적인 열충격 유전자인 dnaK와 groE 오페론 유전자를 클로닝 하여 이들의 프로모터 부분을 살펴본 결과 이 세균의 프로모터 영역이 대장균의 /2가 결합할 수 있는 부위와 많은 상동성을 지니고 있음을 알게 되었고[5, 6], 이 세균에서도 역시 <产 homolog에 의한 열충격 반응의 조절 가능성을 생각하게 되었다. 본 논문에서는。32를 암호화하는 rpoH 유전자를 클로닝 하여 특성을 조사하였다.
。32를 암호화하는 中oH 유전자는 현재까지 그람 음성 세균에서 만 클로닝 되었으며, 현재까지 0-proteobacteria에 속하는 세균에서는 Burkholderia, Ralstonia, NeZsserzN등에서만 rpoH 유전자가 확인되었다.
세포 내 o끄의 수준이 높아질수록 더 많은 열충격 단백질이 합성되는데 이는 보다 높은 온도에서의 세균 성장과 관련이 있다[25]. 또한 rpoH 유전자의 돌연변이체는 20。。이상의 온도에서는 성장할 수 없는 결과로부테28] a32 regulonel 의해 암호화 되는 단백질이 세균의 고온 성장에 필수적 임을 알게 되었다. 세균이 steady-state 성장하는 동안의 양은 세포 한 개당 10-30 개 정도로 매우 적다.
7%의 identity를 나타냈다. 그리고 a-proteobacteria에 속하는 Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens 卫妇과는 39.1%, 41.5% 및 33.4%의 identity를 보여주었다. 한편 y-proteobacteria에 속하는 Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli 및 Proteus mirabilis와는 51.
strain SS1 이 암호화하는 RpoH 아미노산 서열과 비교하였다. 실험균주의 RpoH는 동일 계열의 [3-proteobacteria에 속하는 Nitrosomonas europaea, Neisseria meningitidis, 및 Chromobacterium violaceume 각각 59.6%, 58.8% 및 57.7%의 identity를 나타냈다. 그리고 a-proteobacteria에 속하는 Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens 卫妇과는 39.
4%의 identity를 보여주었다. 한편 y-proteobacteria에 속하는 Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli 및 Proteus mirabilis와는 51.7%, 51.4% 및 49.3%의 identity를 보여주었다.
참고문헌 (28)
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