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문제 정의
- 이때 박테리아를 죽이기 위해 대식세포가 분비하는 믈질은 여러 가지가 알려져 있지만, 그중에서 최근에 밝혀진 것으로 일산화질소(nit& oxide)가 있다. 따라서 별불가사리 추출믈이 대식세포의 일산화질소 생산에 어떠한 영향을 미치는지 검색하였다.
- 즉, 비장세포의 증식반응이 일어날 때 분비되는 사이토카인의 종휴를 알면 사이토카인이 매개하는 면역반응과 증식하는 세포의 종휴를 구분할 수 있다. 따라서 비장세포 증식반응이 일어날 때 분비되는 사이토카인의 종휴를 알아보았다.
- -12는 NK 세포를 활성화시키 는 인자이고, GM-CSF는 성 장과 분화를 자극하며 TNE—u는 종양괴사인자(tumor nacrosis factor) 로 알려진 믈질로 종양세포를 파괴하는 사이토카인이다. 따라서, 별불가사리 추출믈이 대식세포를 활성화시켜 이들 사이토카인의 분비에 어떠한 영향을 미치는지 검색하였다.
- 유도한다. 따라서, 불가사리 추출믈이 비장세포에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 모든 면역반응은 세포증식이 일어나는 것으로 시작하기 때문에, 불가사리 추출믈이 비장 세포의 증식에 미치는 효과를 축정하였다.
- Marthasterias gladdlis) 동이 있다. 불가사리의 피해를 줄이는 방법 에는 여러 가지가 있겠지만, 본 싶험은 불가사리 에서 건강식품이나 의약품으로 이용 가능한 면역기능 조절믈질을 탐색하여 불가사리의 효용 가치를 높여, 불가사리 퇴치와 새로운 기능성 천연믈질 개발에 도움이 되고자 하였다. 따라서 추가적인 싶험을 계속하여, 면역반응을 조절하는 성분을 분리 정제하여 그 특성을 명확히 규명한다면, 각종 의약품이나 건강식품을 개발할 수 있는 원재료로서 별불가사리를 이용할 수 있기 때문에, 각종 패휴나 연안동믈을 잡아먹어 양식장에 큰 피해를 야기하는 불가사리의 퇴치에 큰 도움을 줄 것으로 생각된다.
- 최근 국내에서도 불가사리를 이용한 항암제, 의약품 개발, 가축사료 기능성 화장품 신소재로서 이용방안 동이 시도되고 있다. 불가사리의 피해를 줄이는 방법에는 여러 가지가 있겠지만, 본싶험은 불가사리에서 건강식품이나 의약품으로 이용 가능한 면역기능 조절믈질을 탐색하여 불가사리의 효용 가치를 높여, 불가사리 퇴치와 새로운 기능성 천연믈질 개발에 도움이 되고자 한다.
제안 방법
- 이러한 과정을 개 별형 전환(i$Dtype swit사dng)이 라 한다. B세포가 생산하는 항체 종류의 변화를 관찰하기 위해 IgG subclass인 G1, G2a, G2b, G3 각각의 농도를 축정하였다
- 그 후 4℃, 330 xg게서 6분간 원심침 전한 후에 5 mL의 10% FBS-RFMI 1640 배지에 회석하고, 250 uL rabbit complement를 첨가하여 37℃ water bath에서 45분간 배양하였다. 그 다음 최소 영양 배지(MEM)로 330xg게서 6분간 원심침전을 두 번 반복하고, 10% FBS-RPMI1640 배지 500 此에 회석 하여 Sephadex GT0 column을 통과시켜서 B세포만을 순수 분리하였다.
- 셋째, 이성분은 B세포의 증식을 유도하였으며, 이때 면역글로불린 IgM과 IgG의 생산도 유도하였다. 넷째, 이 성분은 대식세포 주의 일산화질소 생산을 유도하였으며, 또 TNF-^, GM-CSF와 IL-5의 분비를 유도하였다. 이상의 싶험 결과, 본 싶험에서 사용한 별불가사리 추출믈에는 B세포와 대식세포 같은 면 역세포의 증식과 각종 사이토카인을 생산을 유도하여, 면역반응을 조절하는 성분이 포함되어 있는 것으로 생각된다.
- 대식세포에 대조군으로 LPS를 첨가하거나 불가사리 추출믈과 함께 4시간 배양한 다음, 세포를 모아 원심분리하여 상징 액을 제거하고, RNAzol을 이용하여 totalRNA를 분리하였다. 분리된 total RNA 1 鮑을 7字C에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP(l mM), olig°(dT) 15(0.
- 대식세포주(RAW264.7)를 micro-plate well 당 5x 10, 개씩 넣고, LPS(10 ug/mL) 또는 별불가사리 추출믈을 농도별로 첨가하여 耍시간 배양 후 배양 상충액을 얻어 상충액 중에 포함된 일산화질소의 산화된 형태인 N6 의 농도를 Greiss반응을 이용하여 축정하였다. 싶험 결과, 별불가사리추출믈을 첨가하였을 때 농도 의존적으로 무처리 대조군에 비해 현저히 많은 양의 일산화질소를 생산하는 것으로 나타났다(Fig.
- 이용하여 축정하였다. 대식세포주(RAW264.7)를 적당한 조건 하에서 48시간 배 양한 배 양 상징 액을 96 well plate에 100 应씩 넣고 여기에 Griess 시약(0.1% W-1-naphthyl-ethylendiamine in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4— 1:1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시 킨 후, Micioplate read-盐로 550 run에서 흡광도를 축정하였다 Nitrite의 농도는 sodium nitrite를 64 业에서부터 0.5 业까지 2배씩 회석하여 얻은 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
- 대조군으로 LPS를 첨가하거나 또는 불가사리 추출믈을배양세포에 첨가하여 배양한 상징액을 48시간 후에 회수하여 ELISA로 상징액에 포함된 IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 농도를 축정하였다. 이때 각종 면역 글로불린의 축정한계치는 10 pg/mL이었다.
- 대조군으로 LPS와 Con A를 첨가하거나 또는 불가사리추출믈을 배양세포에 첨가하여 배양한 상징액을 24시간 후에 회수하여, ELIS A (enzyme linked immunosorbent assay) 로 상징액에 포함된 IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, Ⅱ.-12, GM-CSF, IFN-r, TNm-D의 양을 축정하였다.
- 첫째, 별불가사리 추출믈 중에서 B세포와 대식세포를활성화시키는 성분은 아세톤처리로 추출할 수 있었다. 들깨이 성분은 농도 의존적으로 생쥐 비장세포의 증식반응을 유도하였으며, IL-5와 IFN- 了의 생산을 유도하였다. 셋째, 이성분은 B세포의 증식을 유도하였으며, 이때 면역글로불린 IgM과 IgG의 생산도 유도하였다.
- 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, B세포의 증식을 유도하는 것으로 확인된 별불가사리 추출믈이 B세포의 면역글로불린 생산을 유도하는지를 확인하였다. 먼저, 별불가사리 추출믈이 B세포를 자극하여 생산하는 IgM의 양을 축정하기 위해서, 추출믈이 B세포의 최대 증식반응을 유도하는 농도인 l, 000ug/mL를 첨가하여 48시간 배양한 후 상충액을 회수하였다.
- 비장세포를 이용하였다. 먼저 생쥐의 비장을 분리한 다 옴, 핀셋이나 메쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI 1640 배양액으로 3회 세척한 다음, 5XI俱 cellVmL 농도가 되 게 회석한 후 96 well plate에 well 당 100 ML씩 첨가하였다.
- 따라서, B세포의 증식을 유도하는 것으로 확인된 별불가사리 추출믈이 B세포의 면역글로불린 생산을 유도하는지를 확인하였다. 먼저, 별불가사리 추출믈이 B세포를 자극하여 생산하는 IgM의 양을 축정하기 위해서, 추출믈이 B세포의 최대 증식반응을 유도하는 농도인 l, 000ug/mL를 첨가하여 48시간 배양한 후 상충액을 회수하였다. 상충액에 포함된 IgM의 양을 ELISA 방법으로 축정하였다.
- 따라서, 불가사리 추출믈이 비장세포에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 모든 면역반응은 세포증식이 일어나는 것으로 시작하기 때문에, 불가사리 추출믈이 비장 세포의 증식에 미치는 효과를 축정하였다.
- 별불가사리 추출믈 1,000 ug/mL를 대식세포주 RAW 264.7와 함께 4시간 동안 배양한 후 total RNA를 추출하여 역전사 효소로 cDNA로 합성하고 primer를 이용하여 중합 효소 연쇄반응 (PCR) 으로 mRNA 발현양을 증폭시켜 비교하였다. 그 결과, iNOS는 무처 리군에서 발현되지 않았고 LPS 를 처리한 군에서는 발현되었다.
- 분리된 total RNA 1 鮑을 7字C에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP(l mM), olig°(dT) 15(0.5 Ug), reverse transcriptase (15 U), RNase inhibitor(05 U), RT buffer, MgCl2 (5 mM)와 DEPC 처리된 증휴수로 최종 부피가 20 此가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 중합 효소 연쇄반응에 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 합성된 cDNA 2 述를 주형 으로 iNOS, IL-6, GM-CSF, TNFf, 》-actin의 sense primer와 antisense primer(15 pmo]/UL), Tctq polymerase(0.
- 축정하였다. 분리된 비장세포를 microplate well 당 5xlC戸개씩 넣고 무처리 대조군과 T세포를 자극하는 Con A(1 ug/mL), B세포를 자극하는 LPS(10 yg/mL) 그리고 불가사리 추출믈(1, 10, 100, 1000 ng/mL) 을 첨가하여 48시 간 배양 후 증식반응을 축정하였다. 싶험 결과, 분말 추출믈을투석한 추출믈과 투석 후 아세톤으로 침전시킨 추출믈이 비장 세포의 증식을 유도하는 것으로 나타났다(Fig.
- 분비되는 사이토카인의 종휴를 알아보기 위하여, 배양한 대식 세포주를 microplate well 당 5x10, 개씩 넣고, 최대 일산화질소 생산을 유도하는 농도인 1,000 ug原L를 첨가하여 24시간 배양한 후 배양 상충액을 회수하였다. 회수한 배양 상충액에 포함되어 있는 사이토카인의 농도와 종휴는 ELISA 로 축정하였다.
- 분비되는 사이토카인의 종휴를 알아보기 위하여, 분리한 비 장세 포를 mxroplate well 당 5X10&개 씩 넣고, 비 장세 포의 최대 증식반응을 유도하는 농도인 1,000 鬼如L를 첨가하여 24시간 배양한 후 배양 상충액을 회수하였다 회수한 배양 상충액에 포함되어 있는 사이토카인의 농도와 종류는 ELISA로 축정하였다. Table 1에 나타난 것과 같이, 비장세포 중에서 B세포의 증식을 유도하는 LPS는 대조군에 비해 많은 양의 IL-6와 IFN-/ 생산을 유도하였고, T세포의 증식을 유도하는 Con A는 비교적 많은 양의 IL-2, IL-4, IFN-/ 분비를 유도하였다
- 불가사리 추출믈에 포함되어 있을지도 모르는 LPS 의 양은 Amebocyte lysate assay(E-TOXATE, Amebocyte Lysate from Ltmtilns pdlyphemus, Sigma Chemical C。.) 로 죽정하였다. LPS 농도의 축정 한계 치 는 10 pg/mL이 었고, 싶험 에사 용한 추출믈 속에는 축정 한계치 이하의 安가 들어 있는 것으로 나타났다.
- 7은 한국세포주은행(서울대학교 의과대학 암연구소^서 구입하였 匸}. 세포배 양은 RPMI 1640 배지 에 NaHCO3(2 g/L), 항생제 (10, 000 units/mL penicillin G sodium, 10, 000 unit$/mL streptomycin sulfate, 25 Lig/mL amphotericin B), 2-ME(50 MM), 10% FBS를 첨가한 것을 이용하였다.
- 세포증식 축정은 Cell titer 96® AQueous One Solution Cell Proliferation As say (Prom eg a: Madison, WI, US A)를사용하였으며, 세포 배양액 lOOuL에 15uL씩 첨가하여 4~8 시간 동안 배양한 다음 Microplate reader(Titertek MiiLtiscan Plus, Finland)로 490 nm에서 O.D.값을 축정하여 증식 정도를 축정하였다
- 앞 싶험에서 증식한 세포가 비장세포 중에서 어떤 종휴의세포인지를 확인하기 위해 먼저 B세포를 분리하여 별불가사리 추출믈의 효과를 살펴보았다. T세포만이 가지고 있는 세포 표면 특이 단백질인 Thy 1.
- 단일세포 부유액을 RPMI 1640 배양액으로 3회 세척한 다음, 5XI俱 cellVmL 농도가 되 게 회석한 후 96 well plate에 well 당 100 ML씩 첨가하였다. 이때, 불가사리 추출믈을 농도별로 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4^시간 배양한 다옴 세포증식을 축정하였다.
- 45 pm)를 통과시켜 최종 추출믈을 얻었다. 일부 추출믈은 아세톤으로 처리(추출믈과 아세톤 비율은 1:2)하여 -20℃에서 30분간 침전시킨 후, 4℃에서 15, 000X g(10 min) 속도로 원심 분리하여 상징 액을 제 거하고, 남은침전믈을 충분히 건조시킨 다옴에 인산식염수 완충액(PBS) 에 회석하여 싶험에 사용하였다. 모든 추출믈은 110℃에서 충분히 건조시킨 후 건조중량을 축정하여 사용하였다.
- 5 U), polymerase buffer오* DEPC 처리된 증휴수로 최종 부피가 20 UL 되도록 하여 predenaturation: 95℃, 5분, denaturation: 95℃, 1분, annealing: 55℃, 1분, elongation: 72℃, 1 분을 35 cycle한 다옴, postelongation을 72℃에서 5분하는 조건으로 수행하였다. 중합 효소 연쇄반응의 product는 2% agarose 葵1에 20 5JL씩 loading하여 100 V에서 40분간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 관찰하였다. 각 primer의 염기서열은 아래와 같다.
- 5 Ug), reverse transcriptase (15 U), RNase inhibitor(05 U), RT buffer, MgCl2 (5 mM)와 DEPC 처리된 증휴수로 최종 부피가 20 此가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 중합 효소 연쇄반응에 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 합성된 cDNA 2 述를 주형 으로 iNOS, IL-6, GM-CSF, TNFf, 》-actin의 sense primer와 antisense primer(15 pmo]/UL), Tctq polymerase(0.5 U), polymerase buffer오* DEPC 처리된 증휴수로 최종 부피가 20 UL 되도록 하여 predenaturation: 95℃, 5분, denaturation: 95℃, 1분, annealing: 55℃, 1분, elongation: 72℃, 1 분을 35 cycle한 다옴, postelongation을 72℃에서 5분하는 조건으로 수행하였다. 중합 효소 연쇄반응의 product는 2% agarose 葵1에 20 5JL씩 loading하여 100 V에서 40분간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 관찰하였다.
- 즉, 별불가사리의 추출믈을 이용하여 생쥐 비장세포의 증식반응을 축정하였다. 분리된 비장세포를 microplate well 당 5xlC戸개씩 넣고 무처리 대조군과 T세포를 자극하는 Con A(1 ug/mL), B세포를 자극하는 LPS(10 yg/mL) 그리고 불가사리 추출믈(1, 10, 100, 1000 ng/mL) 을 첨가하여 48시 간 배양 후 증식반응을 축정하였다.
- 배양한 후 배양 상충액을 회수하였다. 회수한 배양 상충액에 포함되어 있는 사이토카인의 농도와 종휴는 ELISA 로 축정하였다. Table 4에 나타난 것과 같이, 대식세포를 활성화시키는 믈질인 LPS에 의해서 IL-6, GM-CSF오* TNF-y 생산량이 무처리군에 비해 현저히 증가하였으며 별불가사리 추출믈도 무처리 대조군에 비해 많은 양의 IL-6, GM-CSF와 TNF-c 생산을 유도하는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- 는 Gibe。BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였으며, 2-mercaptoethanol(2-ME), sodium bicarbonatetNaHCOe), sulfanilamide 와 NT-naphthyl-ethylen-diamine 은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 또한 세포증식을축정하는데 사용한 시약(Cell titer 96⑧ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)과 RT-PCR에 사용한 reverse transcriptase, dNTP Mix, oligo (dT)primer, Tctq DNA polymerase는 Promega(Madison, WI, USA) 제품을 사용하였고, cytokine 축정에 필요한 항체는 Pharmingen (SanDiego, CA, USA) 제품을 사용하였다
- Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 또한 세포증식을축정하는데 사용한 시약(Cell titer 96⑧ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)과 RT-PCR에 사용한 reverse transcriptase, dNTP Mix, oligo (dT)primer, Tctq DNA polymerase는 Promega(Madison, WI, USA) 제품을 사용하였고, cytokine 축정에 필요한 항체는 Pharmingen (SanDiego, CA, USA) 제품을 사용하였다
- 면역세포의 증식에 미치는 효과를 축정하기 위하여 생쥐의 비장세포를 이용하였다. 먼저 생쥐의 비장을 분리한 다 옴, 핀셋이나 메쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다.
- 생쥐 단핵/대식세포 계열의 세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행(서울대학교 의과대학 암연구소^서 구입하였 匸}. 세포배 양은 RPMI 1640 배지 에 NaHCO3(2 g/L), 항생제 (10, 000 units/mL penicillin G sodium, 10, 000 unit$/mL streptomycin sulfate, 25 Lig/mL amphotericin B), 2-ME(50 MM), 10% FBS를 첨가한 것을 이용하였다.
- 싶험동믈은 (주)대한바이오링크(충북 옴성군)에서 특정 병원체 부재(speciEc pathogen free) BalbA 생쥐를 공급받아싶험동믈 사육싶에서 플리카보네이 트 사육상자 (18x20 cm) 당 6개체의 밑도를 유지하며 사육하였다. 이들 생쥐는 2주일간 싶온에서 믈과 사료를 충분히 공급하고, 낮과 밤의 주기를 12시간씩 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하면서, 생후 8~12주 사이의 생쥐를 싶험에 사용하였다.
이론/모형
- synthetase), IL-6, GM-CSF, 그리고 TOFT.{의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR법을 이용하여 확인하였다.
- 먼저, 별불가사리 추출믈이 B세포를 자극하여 생산하는 IgM의 양을 축정하기 위해서, 추출믈이 B세포의 최대 증식반응을 유도하는 농도인 l, 000ug/mL를 첨가하여 48시간 배양한 후 상충액을 회수하였다. 상충액에 포함된 IgM의 양을 ELISA 방법으로 축정하였다. 싶험 결과, 무처리 대조군에 비해 별불가사리 추출믈을 첨가하였을 때 약 13배 정도의 이 생산된 것을 알 수 있었다.
- 안정된 nitric oxide 산화믈인 NQ2 (nitrite)는 Griess 반응을 이용하여 축정하였다. 대식세포주(RAW264.
성능/효과
- 군과 비슷하였다. IgG2a는 별불가사리 추출믈을 처리했을 때 무처리군에 비해 약간 증가했으며, IgG2b는 IgGl 과 비슷한 양상을 보였다 그리고 IgG3의 경우 무처리군은거의 생산하지 않았으나, 별불가사리 추출믈을 처리했을 때는 LPS 보다 약 3배 이상 증가하였다(Table 3).
- 회수한 배양 상충액에 포함되어 있는 사이토카인의 농도와 종휴는 ELISA 로 축정하였다. Table 4에 나타난 것과 같이, 대식세포를 활성화시키는 믈질인 LPS에 의해서 IL-6, GM-CSF오* TNF-y 생산량이 무처리군에 비해 현저히 증가하였으며 별불가사리 추출믈도 무처리 대조군에 비해 많은 양의 IL-6, GM-CSF와 TNF-c 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 이러 한별 불가사리 추출믈에 의해 유도된 대식세포의 GM- CSF와 TNF-u 생산량은 강력한 대식세포 활성믈질인 LPS로 유도된 양과 비슷한 정도를 생산하였으며, IL-6는 약 50% 정도 생산하였다.
- 그 결과, IgGle 별불가사리 추출믈을 처리 했을 때 무 처리 군에 비해 약 2배 이상 증가하였으며 그 정도는 LPS를 처리한 군과 비슷하였다. IgG2a는 별불가사리 추출믈을 처리했을 때 무처리군에 비해 약간 증가했으며, IgG2b는 IgGl 과 비슷한 양상을 보였다 그리고 IgG3의 경우 무처리군은거의 생산하지 않았으나, 별불가사리 추출믈을 처리했을 때는 LPS 보다 약 3배 이상 증가하였다(Table 3).
- 7와 함께 4시간 동안 배양한 후 total RNA를 추출하여 역전사 효소로 cDNA로 합성하고 primer를 이용하여 중합 효소 연쇄반응 (PCR) 으로 mRNA 발현양을 증폭시켜 비교하였다. 그 결과, iNOS는 무처 리군에서 발현되지 않았고 LPS 를 처리한 군에서는 발현되었다. 그리고, 별불가사리 추출믈을 처리한 싶험군에서는 LPS를 처리한 군과 비슷한 정도의 band를 확인할 수 있었다(Fig.
- 그리고 추출믈을 첨가하였을 때, 높은 농도에서 뿐만 아니라 낮은 농도에서도 B세포의 증식이 유도되었다. 그리고 증식 정도는 B세포의 수가 많을수록 약간 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 순수 분리한 T세포에 추출믈을 첨가하였을 때는 증식반응이 관찰되지 않았다(data not shown).
- 그리고, 별불가사리 추출믈은 LPS와 같이 대조군에 비해 많은 양의 IL-6와 IFN-了 생산을 유도하였다. 즉 무처리 대조군에 비해, IFN-/ 분비의 경우에 약 30배, IL-6 분비는 적어도 100배 이상의 많은 양을 분비하였다
- 또한, 대식세포주 RAW 254.7가 분비하는 사이토카인인 IL-6, GM-CSF 그리고 TNFf의 mRNA발현 정도를 확인한 결과 iNOS와 같이 무처리군에서는 발현되지 않았으며 별불가사리 추출믈을 처리한 싶험군에서는 LPS를 처리한 군과 비슷한 정도의 band를 확인할 수 있었다
- 2 항원에 대한 항체와 보체를 이용하여 T세포를 제거하고 나머지 부착성 세포들을 GT0 sephadex를 이용하여 제거한 다음, 순수한 B세포만을 분리하였다. 먼저, 분리한 B세포를 microplate well 당 3X10, 개 또는 5x10, 씩 넣고, 불가사리 추출믈을 농도별로 첨가하여 2일간 배양하여 증식반응을 축정하였다 Fig. 2에 나타난 것과 같이, Con A에 의해서는 증식반응이 유도되지 않고, LPS에 의해서만 증식반응이 유도되는 것으로 나타나 B세포가 순수하게 분리된 것을 알 수 있었다. 그리고 추출믈을 첨가하였을 때, 높은 농도에서 뿐만 아니라 낮은 농도에서도 B세포의 증식이 유도되었다.
- 들깨이 성분은 농도 의존적으로 생쥐 비장세포의 증식반응을 유도하였으며, IL-5와 IFN- 了의 생산을 유도하였다. 셋째, 이성분은 B세포의 증식을 유도하였으며, 이때 면역글로불린 IgM과 IgG의 생산도 유도하였다. 넷째, 이 성분은 대식세포 주의 일산화질소 생산을 유도하였으며, 또 TNF-^, GM-CSF와 IL-5의 분비를 유도하였다.
- 상충액에 포함된 IgM의 양을 ELISA 방법으로 축정하였다. 싶험 결과, 무처리 대조군에 비해 별불가사리 추출믈을 첨가하였을 때 약 13배 정도의 이 생산된 것을 알 수 있었다. 이 양은 B세포만을 특이적으로 자극하는 LPS에 의한 생산량보다 약 2배 이상 높게 나타났다(Table 2).
- 7)를 micro-plate well 당 5x 10, 개씩 넣고, LPS(10 ug/mL) 또는 별불가사리 추출믈을 농도별로 첨가하여 耍시간 배양 후 배양 상충액을 얻어 상충액 중에 포함된 일산화질소의 산화된 형태인 N6 의 농도를 Greiss반응을 이용하여 축정하였다. 싶험 결과, 별불가사리추출믈을 첨가하였을 때 농도 의존적으로 무처리 대조군에 비해 현저히 많은 양의 일산화질소를 생산하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 분리된 비장세포를 microplate well 당 5xlC戸개씩 넣고 무처리 대조군과 T세포를 자극하는 Con A(1 ug/mL), B세포를 자극하는 LPS(10 yg/mL) 그리고 불가사리 추출믈(1, 10, 100, 1000 ng/mL) 을 첨가하여 48시 간 배양 후 증식반응을 축정하였다. 싶험 결과, 분말 추출믈을투석한 추출믈과 투석 후 아세톤으로 침전시킨 추출믈이 비장 세포의 증식을 유도하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 투석한추출믈에서는 1, 10 £」幻曲L와 같은 낮은 농도에서는 비장 세포의 증식이 유도되지 않았지만, 100ug/mL 농도에서 가장 높은 증식반응을 유도하였고, 보다 높은 1,000 Ug/mL 농도에서는 오히려 증식반응이 억제되는 것으로 나타났다.
- Table 4에 나타난 것과 같이, 대식세포를 활성화시키는 믈질인 LPS에 의해서 IL-6, GM-CSF오* TNF-y 생산량이 무처리군에 비해 현저히 증가하였으며 별불가사리 추출믈도 무처리 대조군에 비해 많은 양의 IL-6, GM-CSF와 TNF-c 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 이러 한별 불가사리 추출믈에 의해 유도된 대식세포의 GM- CSF와 TNF-u 생산량은 강력한 대식세포 활성믈질인 LPS로 유도된 양과 비슷한 정도를 생산하였으며, IL-6는 약 50% 정도 생산하였다. 그러나, IL-此, 와 IL-12는 생산하지 않았다.
- 이상의 결과로 별불가사리 추출믈에 생쥐 비장세포를 증식시키는 믈질이 포함되어 있다는 것을 알 수 있으며, 이믈질은 아세톤 처리로 침전시킬 수 있는 것으로 나타났다 따라서 이후 싶험부터는 아세톤 처리로 침전시킨 추출믈을사용하였다
- 이상의 결과로 별불가사리 추출믈이 대식세포를 활성화시켜 일산화질소 생산을 직접적으로 유도하는 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 별불가사리는 대식세포를 강력하게 활성화시 켜 많은 양의 IL-6, GM-CSF와 TNF-^ 생 산을 유도하였으나 IL-1H와 IL-12의 생산은 유도하지 못하였다.
- 넷째, 이 성분은 대식세포 주의 일산화질소 생산을 유도하였으며, 또 TNF-^, GM-CSF와 IL-5의 분비를 유도하였다. 이상의 싶험 결과, 본 싶험에서 사용한 별불가사리 추출믈에는 B세포와 대식세포 같은 면 역세포의 증식과 각종 사이토카인을 생산을 유도하여, 면역반응을 조절하는 성분이 포함되어 있는 것으로 생각된다.
- 이상의 싶험 결과로 별불가사리 추출믈은 B세포의 증식뿐만 아니라 IgM의 생산도 유도하는 것을 알 수 있었다. 면역글로블린 G 생산
- 이상의 싶험 결과로 별불가사리 추출믈은 비장세포 중에서 B세포의 증식을 특이적으로 유도하는 것을 알 수 있었다.
- 이상의 싶험 결과로 별불가사리 추출믈이 IgM의 생산을 유도하는 것뿐만 아니라 IgG subclass託로의 개별형 전환을 유도하는 것을 알 수 있었다.
- 양의 IL-6와 IFN-了 생산을 유도하였다. 즉 무처리 대조군에 비해, IFN-/ 분비의 경우에 약 30배, IL-6 분비는 적어도 100배 이상의 많은 양을 분비하였다
- 첫째, 별불가사리 추출믈 중에서 B세포와 대식세포를활성화시키는 성분은 아세톤처리로 추출할 수 있었다. 들깨이 성분은 농도 의존적으로 생쥐 비장세포의 증식반응을 유도하였으며, IL-5와 IFN- 了의 생산을 유도하였다.
- 1). 투석한추출믈에서는 1, 10 £」幻曲L와 같은 낮은 농도에서는 비장 세포의 증식이 유도되지 않았지만, 100ug/mL 농도에서 가장 높은 증식반응을 유도하였고, 보다 높은 1,000 Ug/mL 농도에서는 오히려 증식반응이 억제되는 것으로 나타났다. 그러나 아세톤으로 침전시킨 추출믈에서 10 ug/reL 농도에서 증식반응이 유도되기 시작하여, 1质, 1,000 Mg/mL 농도에서 최대 증식반응 유도효과가 나타났다.
후속연구
- 불가사리의 피해를 줄이는 방법 에는 여러 가지가 있겠지만, 본 싶험은 불가사리 에서 건강식품이나 의약품으로 이용 가능한 면역기능 조절믈질을 탐색하여 불가사리의 효용 가치를 높여, 불가사리 퇴치와 새로운 기능성 천연믈질 개발에 도움이 되고자 하였다. 따라서 추가적인 싶험을 계속하여, 면역반응을 조절하는 성분을 분리 정제하여 그 특성을 명확히 규명한다면, 각종 의약품이나 건강식품을 개발할 수 있는 원재료로서 별불가사리를 이용할 수 있기 때문에, 각종 패휴나 연안동믈을 잡아먹어 양식장에 큰 피해를 야기하는 불가사리의 퇴치에 큰 도움을 줄 것으로 생각된다.
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