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문제 정의
- 자료를 요구하고 있다. 이에 따라 이 연구에서는 전통적으로 당뇨병 치료에 사용되어온 천연물 35가지를 in vitro에서 스크리닝 하여 최종 선택된 한방 천연물 복합제를 다양한 식품소재로 활용이 가능하도록 부형제 starch 를 사용하여 동결건조 분말로 제조하여 마이크로캡슐화(69.27~96.84 μm) 한 시험물질의 안전성을 평가하고자하였다. 시험물질은 (재)대구테크노파크에서 의뢰한 것으로 전 임상 안전성평가시험의 일환으로 SD계통의 암수랫드에 대한 단회 및 4주 반복투여 경구독성시험을 의약품 독성시험기준(식품의약품안전청고시, 제 1999-61 호) 에준하여 수행하였다.
제안 방법
- 4주 반복투여 독성시험: 실험동물은 5주령 Sprague- Dawley계 랫드 암수 각각 40마리씩을 (주)오리엔트바이오로부터 분양 받아 1주일 순화기간을 거친 다음 닌괴법을 이용하여 항당뇨 시험에 각 8군으로 나누어 각 군당 10마리씩 4주간 사육 시험하였다. 순화 및 시험 전 기간동안 동물은 온도 22~24℃, 상대습도 45~55%, 환기 횟수 15회/시간 및 조명시간 12시간의 환경에서 사육하였다.
- 4주 반복투여 독성시험: 투여량은 0 ㎎/㎏ B.W, 500㎎/㎏ B.W, 1000 ㎎/㎏ B.W, 2000 ㎎/㎏ B.W으로 설정하였고 , 한약추출고형물 마이크로캡슐의 한약재 성분함량이 51.4% 이므로 500 ㎎/㎏ B.W의 농도에서 973 ㎎/㎏ B.W을 1000 ㎎/㎏ B.W의 농도에서 1946 mg/ kg B.W을 2000 ㎎/㎏ B.W의 농도에서 3892 ㎎/㎏B.W을 투여하였다.
- 뇨검사: 대사케이지를 이용하여 신선뇨(3시간이내)를채취하여 1 ml 주사기를 사용하여 1 ml의 요를 채취한 후 0.3 mle 요 일반검사 중 stick검사에 이용하고, 나머지 0.7 mle 요침사검사에 사용하였다. 뇨검사는 뇨분석기(AJ4270, Japan)를 이용하여 glucose, bilirubin, ketone, protein, nitrite, occult blood, WBC 및 침사를 검사하였다.
- 7 mle 요침사검사에 사용하였다. 뇨검사는 뇨분석기(AJ4270, Japan)를 이용하여 glucose, bilirubin, ketone, protein, nitrite, occult blood, WBC 및 침사를 검사하였다.
- 단회투여 독성시험: 실험동물은 5주령 Sprague- Dawley 계 랫드 암수 각각 10마리씩을 (주)오리엔트바이오로부터 분양 받아 1주일 순화기간을 거친 다음 난괴 법을 이용하여 4군으로 나누어 각 군당 5마리씩 2주간 사육 시험하였다. 순화 및 시험 전 기간 동안 동물은 온도 22~ 24℃, 상대습도 45~55%, 환기횟수 15회/시간 및 조명 시간 12시간의 환경에서 사육하였다.
- 단회투여 독성시험: 예비시험결과, 독성징후가 관찰되지 않아 식약청 고시에 명시된 최고농도인 2,000 ㎎/㎏ B.W을 투여량으로 설정하였다. 한약추출고형물 마이크로캡슐의 한약재 성분 함량이 51.
- 모든 장기와 조직은 충분한 고정을 거친 후 파라핀 포매하고 4로 박절하여 Hematoxylin & Eosin(H&티염색을 실시하여 광학 현미경하에서 조직병리학적 검사를 실시하였다.
- 부검: 시험 종료시 생존동물은 에테르 마취로 안락사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다.
- 부신의 공포화(vacuolation)가 500 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었고 신장의 만성진행성신증(chronic progressive nephropathy)0] 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 1례 , 2례 관찰되었다. 신장으! 염증(inflammation) 소견이 0, 1000 및 2000㎎/㎏/day 투여군에서 각각 례, 1례, 3례 관찰되었다.
- 분리한 혈청은 자동생화학분석기(KONELAB 20XT, Finland)를 이용하여 알부민(albumin), ALP(alkaline phosphatase), ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), BUN(blood urea nitrogen), 총 콜레스테롤(total cholesterol), 크레아티닌 (creatinine), GGT(gamma glutamyl transpeptidase), 포도당(glucose), IP(inorganic phosphorus), LDH(lactate dehydrogenase), 총 빌리루빈(total bilirubin), 총 단백질 (total protein), 중성지방(triglyceride)을 측정하였다. 전해질 분석 검사는 분리한 혈청으로 전해질 자동 분석장치(AVL 9180, USAX 이용하여 염소(이, chloride), 나트륨 (Na, sodium), 칼륨(K, potassium}을 측정하였다.
- 일반증상 및 사망동물의 관찰. 시험기간 중 모든 동물에 대하여 매일 2회 일정한 시간에 일반증상의 변화, 빈사 및 사망유무를 관찰하였다.
- 암컷의 경우 간장의 공포화가 500, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 1례, 2례, 1례씩 관찰되었고간장의 미세육아종이 500 및 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었다. 신장의 만성진행성신증이 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 1례 관찰되었고 신장의 염증 소견이 0, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 2례 , 1례, 2례 관찰되었다. 폐의 혈관주위 염증세포 침윤이 0 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었고 폐의 암적색 반점 (dark red spots)이 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 례 관찰되었다(Table 10).
- 심장의 염증(inflammation) 소견이 0 ㎎/㎏/day, 1000㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었다. 폐의 혈관주위 염증세포 침윤(perivasc니ar inflammatory cell infiltration)이 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 1 례 관찰되었다.
- 안검사: 투여 개시전에 모든 동물에 대하여 외안 검사를 실시하였고 투여후에는 최종 주에 모든 동물의 외관을육안적으로 관찰하였다. 특히 대조군과 최고용량군의 경우 검안기(Riestar, GermanyX 이용하여 눈의 안저를 검사하였다.
- 특히 대조군과 최고용량군의 경우 검안기(Riestar, GermanyX 이용하여 눈의 안저를 검사하였다. 안저검사는 산동제(오큐트로핀, 삼일제약(주)}를이용하여 동공을 확장 시킨 후 검사하였다.
- 폐의 혈관주위 염증세포 침윤(perivasc니ar inflammatory cell infiltration)이 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 1 례 관찰되었다. 암컷의 경우 간장의 공포화가 500, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 1례, 2례, 1례씩 관찰되었고간장의 미세육아종이 500 및 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었다. 신장의 만성진행성신증이 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 1례 관찰되었고 신장의 염증 소견이 0, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 2례 , 1례, 2례 관찰되었다.
- 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음 모든 장기에 대하여 육안검사를 실시하였다. 전 실험동물에 대하여 뇌, 뇌하수체, 심장, 간, 폐, 비장, 흉선, 신장, 부신, 전립선, 자궁, 고환, 부고환, 난소의 중량을 측정하였고, 부검 전 절식된 체중에 대한 상대장기중량을 산출하였다.
- 일반증상 및 사망동물의 관찰 투여당일은 8시간까지매시간 일반증상을 관찰하였고, 투여 다음날부터 14일까지는 매일 1회씩 일반 증상의 변화, 운동성, 외관 및 사망동물의 유무를 주의 깊게 관찰하였다.
- 장기중량 측정: 시험종료 후 모든 동물을 부검 하루 전에 절식시킨 다음 부검 직 전에 체중을 측정하였다. 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음 모든 장기에 대하여 육안검사를 실시하였다.
- 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음 모든 장기에 대하여 육안검사를 실시하였다. 전 실험동물에 대하여 뇌, 뇌하수체, 심장, 간, 폐, 비장, 흉선, 신장, 부신, 전립선, 자궁, 고환, 부고환, 난소의 중량을 측정하였고, 부검 전 절식된 체중에 대한 상대장기중량을 산출하였다.
- 분리한 혈청은 자동생화학분석기(KONELAB 20XT, Finland)를 이용하여 알부민(albumin), ALP(alkaline phosphatase), ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), BUN(blood urea nitrogen), 총 콜레스테롤(total cholesterol), 크레아티닌 (creatinine), GGT(gamma glutamyl transpeptidase), 포도당(glucose), IP(inorganic phosphorus), LDH(lactate dehydrogenase), 총 빌리루빈(total bilirubin), 총 단백질 (total protein), 중성지방(triglyceride)을 측정하였다. 전해질 분석 검사는 분리한 혈청으로 전해질 자동 분석장치(AVL 9180, USAX 이용하여 염소(이, chloride), 나트륨 (Na, sodium), 칼륨(K, potassium}을 측정하였다.
- 조직병리학적 검사: 투여한 모든 동물의 육안적 병변을 관찰하고 고환, 부고환, 난소, 전립선, 자궁, 비장, 간장, 신장, 부신, 갑상선, 가슴샘, 심장, 펴L 뇌, 뇌하수체 중 고환 및 부고환을 제외한 나머지는 10% 중성포르말린 용액에 고정하였으며 , 고환 및 부고환은 Bouin 용액에 고정하였다. 모든 장기와 조직은 충분한 고정을 거친 후 파라핀 포매하고 4로 박절하여 Hematoxylin & Eosin(H&티염색을 실시하여 광학 현미경하에서 조직병리학적 검사를 실시하였다.
- 체주 사료섭취량 및 음수량 측정: 시험기간 중 모든동물의 체중은 투여개시 전 및 주 1회 실시하였으며, 사료섭취량 및 음수량 측정은 주 1회 실시하였다.
- 체중측정 모든 동물에 대하여 투여직전과 투여 1, 3, 7, 10일 후 그리고 부검 직전인 14일에 총 6회 체중을 측정하였다.
- 투여방법 및 투여기간. 투여경로는 인체적용경로인 경구투여 를 선택하였으며 단회 투여 독성 시험은 시험물질에 멸균수를 가하여 반죽하여 시험개시 시 1회 투여하였고, 4주 반복투여 독성시험의 경우 시험물질을 식이 섭취량을 고려하여 분말사료(샘타코(주))에 투여용량에 따라 혼합하여 일 1회, 주 7회, 4주 동안 연속 투여하였다.
- 관찰하였다. 특히 대조군과 최고용량군의 경우 검안기(Riestar, GermanyX 이용하여 눈의 안저를 검사하였다. 안저검사는 산동제(오큐트로핀, 삼일제약(주)}를이용하여 동공을 확장 시킨 후 검사하였다.
- 신장의 만성진행성신증이 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 1례 관찰되었고 신장의 염증 소견이 0, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각각 2례 , 1례, 2례 관찰되었다. 폐의 혈관주위 염증세포 침윤이 0 및 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 각 1례씩 관찰되었고 폐의 암적색 반점 (dark red spots)이 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 례 관찰되었다(Table 10).
- W을 투여량으로 설정하였다. 한약추출고형물 마이크로캡슐의 한약재 성분 함량이 51.4% 이므로 2000 ㎎/㎏ B.W의 농도에서 3892 ㎎/㎏ B.W을 투여하였다.
- 한약추출고형물의 경구투여에 의한 단회투여시 독성유무의 확인 및 반복투여시의 독성을 조사하기 위하여 SD 랫드에 0 및 2000 ㎎/㎏/day의 용량으로 단회경구투여하였고, 0, 500, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day의 용량으로 4주간 반복적으로 경구투여하였다. 단회 투여 독성 시험결과, 본 시험조건하에서 사망동물은 관찰되지 않았으며 시험물질과 연관된 특기할만한 임상증상, 체중변화 및 부검 시육안적 소견이 관찰되지 않았기에 LD50치는 2000 ㎎/㎏이상일 것으로 판단된다.
- 혈액학적 검사: 혈액학적 검사를 위해 부검 전에 하룻밤 절식시킨 후, 에테르를 이용한 마취상태에서 개복하여복대동맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈액응고 방지제인 K2EDTA가 들어있는 CBC 채혈병에 혈액을 취한 후 coulter mixei기 위에서 5분 이상 혼합한 뒤 자동혈구분석기(HEMAVET HV-950FS, USA)를 이용하여 백혈구수(WBC, white blood cell conut), 호중구수(NEUT, neutrophil count), 림프구수(LYMPH, lymphocyte count), 단핵구수(MONO, monocyte count), 호산구수(EOSIN, eosinophil count), 호염기구수(BASO, basophil count), 적혈구 수(RBC, red blood cell count), 혈색소농도(HGB, hemoglobin concentration), 적혈구용적(HCT, hematocrit), 평균적혈구용적(MCV, mean corpuscular volume), 평균적 혈구혈색소량 (MCH, mean corpuscular hemoglobin), 평균적 혈구혈색소농도(MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration), 적혈구분포폭(RDW, red cell distribution width), 혈소판수(PLt, plate count)를 측정하였다.
대상 데이터
- 순화 및 시험 전 기간 동안 동물은 온도 22~ 24℃, 상대습도 45~55%, 환기횟수 15회/시간 및 조명 시간 12시간의 환경에서 사육하였다. 동물의 수용은 polycarbonatee] 실험동물용 cage(정도 B&P(주))를 사용하여 cage당 2마리씩 넣어 시험하였고, 사료는 실험동물용 분말 사료(샘타코(주)}를 자유로 섭취시켰고, 물은 살균 . 소독하여 자유로 섭취시켰다.
- 순화 및 시험 전 기간동안 동물은 온도 22~24℃, 상대습도 45~55%, 환기 횟수 15회/시간 및 조명시간 12시간의 환경에서 사육하였다. 동물의 수용은 polycarbonate제 실험동물용 cage(정도 B&P(주))를 사용하여 cage당 2마리씩 넣어 시험하였고, 사료는 실험동물용 분말사료(샘타코(주)}를 자유로 섭취시켰고, 물은 살균 . 소독하여 자유로 섭취시켰다.
- 시험물질. 시험에 사용한 한약추출고형물 마이크로캡슐은 생지황, 황정, 단삼, 오미자, 갈근, 감초 생약 성분으로 구성되어 있으며 분말상태로 (재) 대구테크노파크에서제공받아 사용하였다(Table 1). 마이크로캡슐 350 g에 생약 성분 180 g을 함유하고 있으며 부형제 100 g, 코팅제 70 g으로 이루어져 있다.
데이터처리
- 체중, 사료섭취량, 혈액학치, 혈액생화학치및 장기중량은 평균값 및 표준편차로 나타내었다. 사료섭취량과 음수량은 일원배치분산분석 (one-way analysis of variance)을 하였으며, Dunnett's test의 다중비교법으로 분석하였고 그 외 대조군과 실험물질 투여군간의 비교는Student's t-test를 이용하여 유의성여부를 검사하였다.
- 통계처리. 체중, 사료섭취량, 혈액학치, 혈액생화학치및 장기중량은 평균값 및 표준편차로 나타내었다. 사료섭취량과 음수량은 일원배치분산분석 (one-way analysis of variance)을 하였으며, Dunnett's test의 다중비교법으로 분석하였고 그 외 대조군과 실험물질 투여군간의 비교는Student's t-test를 이용하여 유의성여부를 검사하였다.
- 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계패키지인 SPSSWIN(v12.아를 이용하였으며 유의수준은 0.05이하로 하였다.
이론/모형
- 84 μm) 한 시험물질의 안전성을 평가하고자하였다. 시험물질은 (재)대구테크노파크에서 의뢰한 것으로 전 임상 안전성평가시험의 일환으로 SD계통의 암수랫드에 대한 단회 및 4주 반복투여 경구독성시험을 의약품 독성시험기준(식품의약품안전청고시, 제 1999-61 호) 에준하여 수행하였다.
성능/효과
- 4주 반복투여독성시험결과, 모든 시험군에서 시험기간동안 시험물질로 인한 일반증상 및 사망동물은 관찰되지않았다. 체중의 변화는 지속적인 증가 추세를 보였으며통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았다.
- 0, 500, 1000 및 2000 ㎎/㎏/day의 용량으로 4주간 반복적으로 경구투여하였다. 단회 투여 독성 시험결과, 본 시험조건하에서 사망동물은 관찰되지 않았으며 시험물질과 연관된 특기할만한 임상증상, 체중변화 및 부검 시육안적 소견이 관찰되지 않았기에 LD50치는 2000 ㎎/㎏이상일 것으로 판단된다.
- 암컷의 경우 물섭취량은 대조군에 비해 3주째에 500 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의적으로 증가하였다. 대조군과의 상대중량 비교에서 500 ㎎/㎏/ day 투여군에서 자궁의 유의적인 증가, 2000 ㎎/㎏/day투여군에서 좌측부신의 유의적인 감소가 있었으며 간장과 신장의 조직병리학적 소견을 고려해 볼 때 시험물질의 투여와 관련된 독성학적인 변화가 있는 것으로 사료된다.
- 대조군과의 상대중량 비교에서 수컷의 경우 500 mg/ kg/day 투여군에서 좌측 신장의 유의적인 증가(p<0.05), 1000 ㎎/㎏/day 투여군에서 간장과 좌측신장의 유의적인 증가(pv0.05), 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 간장, 좌우측 신장의 유의적인 증가가 있었다(pv0.05). 암컷의 경우 500 ㎎/㎏/day 투여군에서 자궁의 유의적인 증가(pv 0.
- 물 섭취량은 대조군에 비하여 암컷 500 ㎎/㎏/day 투여군에서 3주째에 약 25.8% 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
- 사료 섭취량 및 물섭취량의 변화: 대조군에 비하여 암컷 수컷 모든 실험군에서 시험물질 투여와 관련된 유의성 있는 식이섭취량 변화는 관찰되지 않았다(Table 4). 물 섭취량은 대조군에 비하여 암컷 500 ㎎/㎏/day 투여군에서 3주째에 약 25.
- 7% 유의적으로 증가하였다. 암컷의경우 대조군에 비하여 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 적혈구의 수가 11.4% 유의적으로 감소하였다(Table 7). 이와 같은 혈액학적 수치는 모두 정상범위이내의 변화로 용량 상관성이 결여되며 시험물질 투여로 인한 독성학적 변화로는 판단되지 않는다(Wolford et al.
- 이상의 시험결과로 보아 본 시험조건하에서 한약추출고형물의 랫드에 대한 무해용량(no observed adverse effect level, NOAEL)은 암컷 수컷 모두 500 ㎎/㎏/day이하인 것으로 사료된다.
- 일반증상 및 사망률: 모든 시험군에서 시험 전 기간동안 시험물질 투여로 인한 특기할 만한 일반증상 및 사망동물은 관찰되지 않았다(Table 3).
- 장기중량: 대조군과의 절대중량 비교에서 수컷의 경우2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 간장 및 좌측 신장의 유의적인 증가가 있었고(pv0.05), 암컷의 경우 500 ㎎/㎏/ day 투여군에서 자궁의 유의적인 증가(pv0.05), 1000 mg/ kg/day 투여군에서 뇌의 유의적인 감소(p<0.05), 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 좌측 부신의 유의적인 감소가 있었다(p<0.05)(Table 9).
- 체중변화 암수 대조, 실험 모든 군에서 지속적인 증가 추세를 보였으며 통계학적으로 유의성 있는 변화는 보이지 않았다(Fig. 1).
- 체중변화 암수 대조, 실험 모든 군에서 지속적인 증가 추세를 보였으며 통계학적으로 유의성 있는 변화는 보이지 않았다(Fig. 2).
- 체중의 변화는 지속적인 증가 추세를 보였으며통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았다. 안검사 및뇨검사에서 모든 투여군에서 대조군에 비하여 시험물질투여와 관련된 유의성 있는 변화 및 특이 이상 소견이 관찰되지 않았으며 혈액학적 검사에서 모든 투여군에서 정상범위의 수치를 보였다.
- 마이크로캡슐 350 g에 생약 성분 180 g을 함유하고 있으며 부형제 100 g, 코팅제 70 g으로 이루어져 있다. 코팅제의 소재인 제인은 함수에탄올에서 추출되는 소수성이 강한 옥수수 단백질 성분으로 물에서는 녹지 않지만, 미생물이나 장에서 효소 분해되는 생분해성 소재로 피막형성 능력이 우수하며 최적화한 조건(분무속도: 0.7 ml/min, 공기유입온도: 70℃, 분무압력: 1.9kg/cm2)으로 제조된 한약추출고형물 마이크로캡슐은 pH 1.2의 산에서는 안정하고 pH 6.8에서 저장 4시간 이후에 용출율이 크게 증가되었으며, 수분 활성 도가 증가함에 따라 수분함량이 0.1 ~10%로 상대적으로 흡습에 안정한 분말이었다.
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