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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 민간에서 사용하고 있는 방법을 그대로 적용하여 SD계통의 암수 랫드에 28일간 반복 경구투여하는 방법으로 식품의약품안전청 고시(제2009-116호)에 준하여 실험을 수행하여 초오에 대한 NOEL(no observed effect level, 최대무 영향용량)을 확인 하고자 하였다. 그러나 본 연구에서는 조직병리를 분석하지 않아 초오의 28일 반복투여독성시험이기에는 한계가 있으며 오히려 90일 또는 180일 반복투여독성시험에 있어서 용량결정 시험이라고 할 수 있다.
- 본 연구는 민간에서 초오를 사용하고 있는 방법을 이용하여 NOEL을 알아보기 위하여 SD 계통 암, 수 랫드를 이용하여 28 일 반복 투여독성시험을 시행하였다.
제안 방법
- WBC는 이전 연구12,13)를 참고하여 시험물질 유래 중요한 변화, 시험물질 유래 경미한 변화 및 비시험물질 유래 변화의 3단계로 이루어졌다. WBC의 3단계는 본 시험의 목적인 NOEL, NOAEL(No Observed Adverse Effect Level, 최대무독성용량) 및 LOAEL(Lowest Observed Adverse Effect Level, 최소독성용량) 등의 독성지표를 얻기 위해 이들 각각의 정의에 따라 시험물질-유래 중요한 변화는 adverse effect로 분류되었고 시험물질-유래 경미한 변화는 시험물질에 의한 non-adverse effect로 분류되었다. 일반 적으로 NOAEL은 시험물질에 의해 심각한 독성를 유발하지 않는 최대독성영향이지만 경미한 영향인 non-adverse effect를 나타내는 최대무독성용량이며 LOAEL은 adverse effect를 유발하는 최소독성용량을 의미 한다.
- 요검사 − 각 군당 5마리에 대하여 투여 13주에 요검사를 실시하였다. 동물을 대사 케이지에 수용하여 3~4시간 동안 채뇨한 신선뇨 중 약 1 ml을 취하여 0.3 ml의 요를 요검사용 시험지에 묻힌 후, 요자동분석기를 이용하여 GLU(glucose), BIL(bilirubin), KET(ketone body), LEU(leukocyte), OB(occult blood), PRO (protein), URO(urobilinogen), NIT(nitrite), SG(specific gravity), pH, Color의 항목을 측정하였다. 일반검사 후 남은 요를 1,500 rpm으로 5분간 원심분리한 후, 그 침전물을 S.
- 일반증상관찰 및 체중측정 − 모든 동물에 대해서 1일 1회 90일 동안 일반증상의 종류와 및 증상의 정도와 더불어 사망 및 빈사동물을 관찰하였다. 모든 동물의 체중을 투여개시일, 주 1회, 부검전일 및 부검일에 측정하였다. 부검일 체중은 절식을 실시하였으므로, 체중평가에서 제외하고 부검전일 체중을 평가하였다.
- 순화, 투여 및 관찰기간 중 Polysulfone 사육상자(260W×420L×150H mm)에 수용하였고, 사육상자 당 동물수는 검역·순화기간 2~3마리/관찰기간 1마리로 하였다. 모든 사육기자재는 고압증기멸균기(121oC 20분)로 멸균하여 사용 하였고, 실험동물용 방사선 멸균사료(Zeigler Bros., Inc. USA)와 음용수는 자유 섭취하도록 하였다.
- 부검 및 장기중량 측정 − 부검 전날 절식(17시간)한 계획부검 동물에 대하여 부검 당일에 Isoflurane으로 흡입 마취하여 복대동맥에서 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사를 위한 채혈을 실시하였다.
- 이후 복대동맥 및 복대정맥을 절단하여 방혈/치사시킨 다음, 모든 장기에 대해 부검소견을 관찰한 후 기록지에 기록하였다. 부검 시 적출한 장기 난소, 부신, 뇌하수체, 가슴샘, 전립샘, 고환, 부고환, 비장, 신장, 심장, 폐, 뇌, 간장을 전자저울을 이용하여 중량을 측정하였다. 양측성 장기는 양측 장기를 각각 측정하였다.
- 모든 동물의 체중을 투여개시일, 주 1회, 부검전일 및 부검일에 측정하였다. 부검일 체중은 절식을 실시하였으므로, 체중평가에서 제외하고 부검전일 체중을 평가하였다.
- 사료섭취량 산정 − 투여개시 전의 사료섭취량은 군분리일부터 투여개시 일까지 1일간의 섭취량을 측정하였고, 투여기간에는 7일간의 섭취량을 측정하여 1일의 평균섭취량을 산출하였다.
- 시험물질 추출은 민간에서 초오를 달여 사용하는 방법을 바탕으로 초오 900 g을 3000~5000 ml의 음용수에 넣어 2시간 동안 전탕하였다. 증발되고 남은 용액을 최종 투여액 5 g/10 ml로 맞추어 경구투여용 존데를 장착한 주산관을 통해 위내에 직접 투여되었다.
- 안검사 − 동물 도입 시 모든 동물에 대하여 육안으로 눈의 외관을 관찰하였다.
- 부검 시 적출한 장기 난소, 부신, 뇌하수체, 가슴샘, 전립샘, 고환, 부고환, 비장, 신장, 심장, 폐, 뇌, 간장을 전자저울을 이용하여 중량을 측정하였다. 양측성 장기는 양측 장기를 각각 측정하였다. 중량측정 장기에 대하여는 부검 시 체중에 대한 상대중량을 산출하였다.
- 요검사 − 각 군당 5마리에 대하여 투여 13주에 요검사를 실시하였다.
- 혈액생화학적 검사 − 혈액 일부를 clot activator가 들어있는 vacutainer tube에 주입하고 15~20분간 상온에 방치하여 응고시켰다. 이 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈액생화학분석기를 활용하여 AST, ALT, ALP, BUN, CRE, GLU, CHO, PRO, CPK, ALB, BIL, TG, IP, A/G ratio를 측정 하였다. 전해질은 전해질 분석기로 측정하였다.
- 부검 및 장기중량 측정 − 부검 전날 절식(17시간)한 계획부검 동물에 대하여 부검 당일에 Isoflurane으로 흡입 마취하여 복대동맥에서 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사를 위한 채혈을 실시하였다. 이후 복대동맥 및 복대정맥을 절단하여 방혈/치사시킨 다음, 모든 장기에 대해 부검소견을 관찰한 후 기록지에 기록하였다. 부검 시 적출한 장기 난소, 부신, 뇌하수체, 가슴샘, 전립샘, 고환, 부고환, 비장, 신장, 심장, 폐, 뇌, 간장을 전자저울을 이용하여 중량을 측정하였다.
- 3 ml의 요를 요검사용 시험지에 묻힌 후, 요자동분석기를 이용하여 GLU(glucose), BIL(bilirubin), KET(ketone body), LEU(leukocyte), OB(occult blood), PRO (protein), URO(urobilinogen), NIT(nitrite), SG(specific gravity), pH, Color의 항목을 측정하였다. 일반검사 후 남은 요를 1,500 rpm으로 5분간 원심분리한 후, 그 침전물을 S.M(SternheimerMalbin)법으로 염색하여 RBC(red blood cell), WBC(white blood cell), Epithelial cell 및 Cast를 관찰하였다. 요 총량은 24 시간 동안 계속 채집한 요로 측정하였다.
- 입수한 모든 동물 중 군 분리 일에 측정한 평균 체중에 가장 가까운 암수 각 20마리를 선정하여 체중에 따라 각 군 평균 체중이 균등하도록 무작위로 암수 각 4군, 군당 5마리로 시험군을 구성하였다(Table I). 일반적으로 천연물 추출물의 경우에는 예상 임상용량이 높을 수 있기 때문에 가능한 높은 NOEL을 얻기 위해 반복투여독성시험에서 일반적으로 이용되고 있는 한계용량인 1,000 mg/kg/day보다 5배 높은 5,000 mg/㎏/day 최고용량으로 하여 공비 2를 두어 2,500, 1,250 mg/kg/day을 중용량군 및 저용량군으로 각각 설정을 하였다.
- 일반증상관찰 및 체중측정 − 모든 동물에 대해서 1일 1회 90일 동안 일반증상의 종류와 및 증상의 정도와 더불어 사망 및 빈사동물을 관찰하였다.
- 이 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈액생화학분석기를 활용하여 AST, ALT, ALP, BUN, CRE, GLU, CHO, PRO, CPK, ALB, BIL, TG, IP, A/G ratio를 측정 하였다. 전해질은 전해질 분석기로 측정하였다.
- 증발되고 남은 용액을 최종 투여액 5 g/10 ml로 맞추어 경구투여용 존데를 장착한 주산관을 통해 위내에 직접 투여되었다. 초오 추출물은 투여 기간 동안 냉장보관(보관고번호 : K-4) 하였으며, 투여횟수 및 기간은 1회/일, 7일/주, 4주간으로 투여는 오전에 이루어졌다.
- 사료섭취량 산정 − 투여개시 전의 사료섭취량은 군분리일부터 투여개시 일까지 1일간의 섭취량을 측정하였고, 투여기간에는 7일간의 섭취량을 측정하여 1일의 평균섭취량을 산출하였다. 투여 13주째에는 6일간의 섭취량을 측정하여 1일의 평균섭취량을 산출하였다.
- 안검사 − 동물 도입 시 모든 동물에 대하여 육안으로 눈의 외관을 관찰하였다. 투여 마지막 주에는 모든 동물을 육안으로 눈의 외관을 관찰한 후, 각 군당 5마리에 대해서는 안구에 산동제를 점적하여 안저사진기로 전안부, 중간투광체 및 안저를 관찰하였다.
- 혈액응고시간 검사 − 부검시 채혈한 혈액 중 1.8 ml을 3.2% sodium citrate 0.2 ml이 들어있는 Microtube에 주입한 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 혈장으로 PT(prothrombin time), APTT(activated partial thromboplastin time)를 측정하였다.
- 혈액학적 검사 − 부검 시 채혈한 혈액 일부를 항응고제인 EDTA2K가 들어있는 CBC bottle에 주입한 후 자동혈액분석기로 일반혈액학적검사(WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW, HDW, PLT, MPV, RET)와 백혈구감별계수(NEU, LYM, MONO, EOS, BASO, LUC)를 측정하였다.
대상 데이터
- GLP기관인 대구가톨릭대학교 GLP센터에서 전 과정 시험을 시행하였다. SD계통의 암수 랫드에 28일 반복 경구투여 독성시험은 동물보호법에 근거한 대구가톨릭대학교 동물실험윤리위원 회의 승인을 받아 실시되었다(승인번호 : 제IACUC-2012-017호).
- 본 시험에 사용한 초오는 법제를 하지 않은 것으로 광명당제약(원산지: 경주 양복면)에서 구입하여 잡질을 제거한 후 사용하였으며 상온 보관하였다.
- 본 시험에서는 특정병원균 부재(SPF) 5주령 암수 50마리 Sprague Dawley계 랫드(SD 랫드)를 (주)대한바이오링크에서 구입하여 1주일 동안 검수검역 및 순화를 시켰다. 동물실의 사육 환경은 온도 23±3oC, 상대습도 50±20%, 형광등조명 12 hr(08:00 점등~20:00 소등) 및 조도 150~300 Lux, 환기횟수 10~20회/시간, 소음 60 dB 이하, 암모니아 농도 20 ppm 이하인 환경에서 사육하였다.
- 순화, 투여 및 관찰기간 중 Polysulfone 사육상자(260W×420L×150H mm)에 수용하였고, 사육상자 당 동물수는 검역·순화기간 2~3마리/관찰기간 1마리로 하였다.
- 입수한 모든 동물 중 군 분리 일에 측정한 평균 체중에 가장 가까운 암수 각 20마리를 선정하여 체중에 따라 각 군 평균 체중이 균등하도록 무작위로 암수 각 4군, 군당 5마리로 시험군을 구성하였다(Table I). 일반적으로 천연물 추출물의 경우에는 예상 임상용량이 높을 수 있기 때문에 가능한 높은 NOEL을 얻기 위해 반복투여독성시험에서 일반적으로 이용되고 있는 한계용량인 1,000 mg/kg/day보다 5배 높은 5,000 mg/㎏/day 최고용량으로 하여 공비 2를 두어 2,500, 1,250 mg/kg/day을 중용량군 및 저용량군으로 각각 설정을 하였다.
데이터처리
- Kruskal-Wallis' Htest를 실시한 후, 유의성이 있으면 MannWhitney U-test를 적용하여 대조군과의 유의성을 확인하였다.
- 대조군과 투여군 간의 평균비교에는 모수적인 다중비교 혹은 비모수적인 다중비교를 사용하였으며, 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계 패키지인 SPSS 14.0을 이용하였다. Kruskal-Wallis' Htest를 실시한 후, 유의성이 있으면 MannWhitney U-test를 적용하여 대조군과의 유의성을 확인하였다.
이론/모형
- 본 연구는 한국한의학연구원 민간요법 발굴·보존 및 DB구축을 통한 지식 자원화(K12210)의 지원으로 이루어졌다.
- 요색조는 Fisher's exact test를 적용하였다.
- 초오 열수 추출물의 반복투여독성시험을 통해 얻어진 변화 또는 독성은 독성의 정도와 양상에 따라 weight-based classification (WBC, 독성 강도에 따른 분류)로 이루어졌다. WBC는 이전 연구12,13)를 참고하여 시험물질 유래 중요한 변화, 시험물질 유래 경미한 변화 및 비시험물질 유래 변화의 3단계로 이루어졌다.
- 2 ml이 들어있는 Microtube에 주입한 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 혈장으로 PT(prothrombin time), APTT(activated partial thromboplastin time)를 측정하였다. 혈액응고시간검사기를 사용하여 Nephelometric Analysis 방법으로 초 단위로 측정하였다.
성능/효과
- 3) Aconitine 성분은 사람에게 있어 0.2 mg만 복용하여도 중독이 되고 3~4 mg은 치사량으로 조사되었다.16) 그래서 민간에서는 초오에 명태 또는 돼지족을 같이 넣고 삶아서 먹는데, 실제 명태와 초오를 같이 삶아 먹으면 독성이 줄어든다는 연구결과도 보고되어 있다.
- 증례보고를 보면 초오를 끊이거나 소주에 담구거나 환약으로 복용 했을 경우 위장관 증상(오심, 구토, 복통), 전신 감각이상, 신경학적 증상, 심계항진, 실신 등의 증상들이 2시간 이내에 발생했다고 한다.8) 관절통과 소화불량 치료를 위해 초오를 복용했다가 중독증상(심계항진, 흉통, 어지럼증, 실신 등)이 발생한 경우도 있었다.5)
- a)Weight gains in the main groups are body weight difference between week 4 and 1 st dosed day.
- 초오는 옛날에 사약으로 쓰였을 만큼 독성이 강한 약재임에도 불구하고 독성시험에 관한 연구는 별로 많지 않다. 그래서 이를 바탕으로 본 연구에서는 초오 열수 추출물을 1,250, 2,500 및 5,000 mg/kg/day으로 경구투여하여 반복투여독성 시험을 실시하였으나 사망동물은 관찰되지 않았으며, 일반증상 및 시험물질에 의한 영향으로 보이는 증상도 관찰되지 않았다. 초오의 aconitine 함량의 변화를 보면 수치전에는 366.
- 본 시험조건에서 초오의 투여 농도에 따라서 통계적으로 유의한 변화가 관찰되었으나 이는 비시험물질-유래변화가 확인되었다. 따라서 본 시험의 독성 판정기준에 따라 암수 모두 NOEL은 5,000 mg/kg/day으로 추정 할 수 있었다. 그러나 초오 열수 추출물에서 아무런 독성현상이 확인되지 않았기 때문에 더 높은 용량과 열수 추출물이 아닌 유기용매 추출물에 대한 독성 정도를 파악할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
- 본 시험조건에서 초오의 투여 농도에 따라서 통계적으로 유의한 변화가 관찰되었으나 이는 비시험물질-유래변화가 확인되었다. 따라서 본 시험의 독성 판정기준에 따라 암수 모두 NOEL은 5,000 mg/kg/day으로 추정 할 수 있었다.
- 실험결과 투여기간 중 사망동물은 관찰되지 않았으며, 일반증상관찰소견에서도 시험물질에 영향으로 보이는 특이증상은 없었다. 체중변화, 증체량 및 사료섭취량에서도 시험물질에 의한 변화는 관찰되지 않았다.
- 실험기간 중 대조군을 포함한 모든 시험군에서 사망동물은 없었으며, 투여 중 일반증상 관찰 결과 시험물질에 영향으로 보이는 특이증상은 없었다(Table III).
- 이상의 시험결과로 보아 본 시험 조건에서는 초오의 투여 농도에 따라서 통계적으로 유의한 변화가 관찰되었으나 이는 비시험물질-유래변화가 확인되었다. 따라서 초오 추출물의 랫드에 대한 NOEL은 5,000 mg/kg/day으로 추정된다.
- 임상병리 소견에서 요검사 결과, 수컷 OB 및 pH 수치가 통계적으로 유의한 변화를(p<0.05) 보였고, 생화학적 검사에서도 수컷의 IP 수치 및 암컷 CL - 수치가 통계적으로 유의한 변화가(p<0.05) 나타났으나 이는 모두 정상범위 내결과로 보여진다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서는 민간에서 사용하고 있는 방법을 그대로 적용하여 SD계통의 암수 랫드에 28일간 반복 경구투여하는 방법으로 식품의약품안전청 고시(제2009-116호)에 준하여 실험을 수행하여 초오에 대한 NOEL(no observed effect level, 최대무 영향용량)을 확인 하고자 하였다. 그러나 본 연구에서는 조직병리를 분석하지 않아 초오의 28일 반복투여독성시험이기에는 한계가 있으며 오히려 90일 또는 180일 반복투여독성시험에 있어서 용량결정 시험이라고 할 수 있다.
- 따라서 본 시험의 독성 판정기준에 따라 암수 모두 NOEL은 5,000 mg/kg/day으로 추정 할 수 있었다. 그러나 초오 열수 추출물에서 아무런 독성현상이 확인되지 않았기 때문에 더 높은 용량과 열수 추출물이 아닌 유기용매 추출물에 대한 독성 정도를 파악할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
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