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문제 정의
- 여성의 경우에는 생식능력의 감소가 발생할 수 있으며, 산모가 섭취하였을 경우에는 하혈, 진통이 올 수 있고 심할 경우에는 유산하기도 한다(10). 따라서 본 연구에서는 경남 함양 지역에서 재배된 종자가 형성되지 않은 여주 미숙과의 독성에 대해 평가하여 일일허용섭취량(acceptable daily intake, ADI)을 제안하고자 한다.
가설 설정
- 0K 프로그램(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 연속자료의 분석(체중, 사료섭 취량, 혈액학적 검사, 혈액응고시간, 혈액생화학적 검사, 장기중량)은 일반적인 정규성을 가정하고 통계처리를 실시하였다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 방법을 통하여 군 간 유의성을 확인하고 등분산을 검정하였다.
제안 방법
- Vicine 표준용액은 3.12, 6.25, 12.50, 25.00, 50.00, 100.00 및 200.00 μg/mL로 단계적으로 희석한 후 HPLC로 분석하여 검량선을 작성하였다.
- 농축된 여주 추출물을 50중량%, 덱스트린 49중량%, 유화제 1중량%로 혼합한 후 65~ 80°C에서 30~40분간 살균하였다.
- 농축은 감압농축기(Busung Tech, Anseong, Korea)를 사용하여 65°C로 15~20 Brix까지 농축하였다.
- 시험의 투여용량 결정을 위하여 본 시험물질을 이용하여 2,500 및 5,000 mg/kg의 투여용량으로 암수 각 1마리에 단회 경구투여 한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 독성학적 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 시험물질이 천연 물인 것을 고려하여 본시험에서는 5,000 mg/kg의 단일 시험물질 투여군을 설정하였고, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 두었다. 체중을 기준으로 20 mL/kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 단회 경구투여 하였다.
- 용량설정 및 일반증상관찰: 시험의 투여용량 결정을 위하여 본 시험물질을 이용하여 0, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/ kg/d의 투여용량으로 2주 반복투여 용량결정시험을 실시한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 이상증상 및 독성 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 시험물질이 천연물인 것을 고려하여 본 시험에서는 5,000 mg/kg/d를 고용량 투여군으로 하고, 공비를 2로 두어 중용량(2,500 mg/kg/d) 및 저용량 (1,250 mg/kg/d)을 투여군으로 설정하였으며, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 두었다. 체중을 기준으로 20 mL/ kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구 투여 하였다.
- 단회 경구투여 독성시험, 2주 반복투여 용량결정시험 및 13주 반복 경구투여 독성시험을 위하여 specific pathogen free(SPF) Sprague-Dawley(SD) 랫드를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 제공받았고, 단회 경구투여 독성 시험(8주령) 및 2주 반복투여 용량결정시험(6주령)은 암수 각각 군당 5마리, 13주 반복 경구투여 독성시험(6주령)은 암수 각각 군당 10마리의 동물을 이용하였다. 랫드는 SPF 동물실에 입수하여 약 일주일간의 순화기간을 거친 후 일반 증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 사용하였고, 투여 전일에 체중을 측정하고 Excel program을 이용하여 순위화한 체중으로 군 분리를 실시하였다. 동물은 검역, 순화, 투여 및 관찰기간에 스테인리스제 망사육상자(250W×350 L×180H mm)에 수용하였다.
- 채집한 신선뇨를 요검사용 시험지(SIEMENS, Erlangen, Germany)와 요자동분석장치(CliniTek 50, SIEMENS) 를 이용하여 요당(glucose), 빌리루빈(bilirubin), 케톤체(ketone body), 요비중(specific gravity), 잠혈(occult blood), pH, 단백질(protein), 유로빌리노겐(urobilinogen) 및 아질산염(nitrite)을 측정하였고, 요침사 검사는 현미경을 이용하여 적혈구(erythrocyte), 백혈구(leukocyte), 상피세포(epithelial cell), 원주(casts)를 관찰하고 색조는 육안으로 관찰하였다. 모든 동물에 대하여 부검 전 하룻밤 절식한(단, 음수는 제공) 후 부검 당일 동물을 isoflurane으로 마취하고 개복하여 후대동맥에서 주사기를 이용하여 채혈 하였다. 채혈한 혈액은 EDTA-K2 Tube(BD, Franklin Lakes, NJ, USA), 3.
- 하지만 그 정도가 경미하여 본 기관이 다년간 수집한 SD 랫드의 생물학적 변동범위에 속하여 시험 물질에 의한 영향이 아닌 것으로 판단된다(14). 부검 결과 수컷 부형제대조군 및 5,000 mg/kg/d 투여군에서 좌측 갑상선의 무형성(aplasia) 및 우측 갑상선의 비대(enlargement), 수컷 2,500 mg/kg/d 투여군에서 우측 귀에 결절(nodule), 암컷 부형제대조군에서 양측 안구의 혼탁 및 좌측 신장의 낭이 각 1례씩 관찰되어 조직병리학적 검사를 실시하였다. 검사 결과 좌측 갑상선의 무형성 및 우측 갑상 선의 비대는 편측성의 무형성 및 과다형성(hyperplasia), 우측 귀의 결절은 귓바퀴 연골병증(auricular chondropathy), 양측 안구혼탁(opacity)은 수정체 변성(lenticular degeneration) 및 망막주름(retinal fold), 좌측 신장의 낭(cyst)은 세뇨관변성을 동반한 신장피질에서의 낭(cyst, with tubular degeneration, cortex)으로 확인되었다.
- 부형제 대조군 및 고용량군의 모든 고정 장기와 부검소견이 관찰된 모든 장기에 대해 조직전처리, 포매, 박절, hematoxylin and eosin(H&E) 염색 및 봉입하여 조직표 본을 제작하여 검경하였다.
- 동물은 검역, 순화, 투여 및 관찰기간에 스테인리스제 망사육상자(250W×350 L×180H mm)에 수용하였다. 사료 Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet(Harlan Co., Ltd., Madison, WI, USA)를 두열바이오텍(Seoul, Korea)으로부터 공급받아 급이하고, 물은 음용 상수도수를 정수시킨 후폴리카보네이트제 물병에 넣고 자유섭취 시켰다. 실험동물실은 온도 22±3°C, 상대습도 50±20%, 명암 cycle은 형광등 조명 12 h(08:00 점등~20:00 소등), 환기횟수 10~15회 /h, 조도 150~300 lx, 소음 60 db 이하 및 암모니아 농도 5 ppm 이하로 유지하였다.
- 이때 온도는 80°C를 넘지 않도록 하였다. 살균된 추출액을 분무건조기(Me Hyun Engineering, Anyang, Korea)를 통해 분말화하고 80 mesh로 여과하여 최종적으로 여주 추출 분말을 얻었다.
- 시료 2 g을 칭량하여 25 mL의 증류수를 추출용매로 하여 50°C에서 30분간 초음파 추출(sonication)을 실시하고, 원심분리(3,000 rpm, 15 min) 하여 상층액을 모으고 잔사에 증류수 25 mL를 첨가한 후 상기 방법과 동일하게 추출 및원심분리 하여 얻은 상층액을 최종 50 mL로 정용한 다음 여과(0.2 μm PTFE syringe filter)하여 이를 HPLC 분석시 료로 사용하였다.
- 체중을 기준으로 20 mL/kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 단회 경구투여 하였다. 시험 항목은 모든 동물에 대하여 매일 1회 일반증상관찰을 하였으며, 투여 당일에는 투여 30분 후 및 이후 6시간까지 시간 마다 관찰하였다. 일반증상관찰은 투여 후 14일까지 실시하였다.
- 여주의 추출은 (주)대호양행(Hwaseong, Korea)에 의뢰하여 다음과 같은 조건으로 대량생산을 수행하였다. 칭량된 여주의 15배수의 70% 주정으로 70°C에서 4시간 동안 1차 추출하고, 추출물을 얻고 남은 잔여물을 다시 10배수의 70% 주정으로 2시간 동안 2차 추출하였다.
- 60 mm, 4 micron, Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였고 시료 주입량은 10 μL, 검출파장은 270 nm에서 측정하였다. 이동상으로는 A용매(0.5% formic acid in water)와 B용매(0.5% formic acid in acetonitrile)로 하여 A:B는 96:4로, 유속은 0.3 mL/min으로 분석하였다. Vicine 표준용액은 3.
- 시험 항목은 모든 동물에 대하여 매일 1회 일반증상관찰을 하였으며, 투여 당일에는 투여 30분 후 및 이후 6시간까지 시간 마다 관찰하였다. 일반증상관찰은 투여 후 14일까지 실시하였다. 체중은 투여 전, 투여 후 1, 7 및 14일째(부검 전)에 측정하였다.
- 임상병리검사: 투여 마지막 주에 시험군당 암수 각 5마리의 동물을 대사케이지를 이용하여 신선요를 채집하여 요검사를 실시하고, 요량은 약 24시간 동안 채집한 양을 측정하 였다. 채집한 신선뇨를 요검사용 시험지(SIEMENS, Erlangen, Germany)와 요자동분석장치(CliniTek 50, SIEMENS) 를 이용하여 요당(glucose), 빌리루빈(bilirubin), 케톤체(ketone body), 요비중(specific gravity), 잠혈(occult blood), pH, 단백질(protein), 유로빌리노겐(urobilinogen) 및 아질산염(nitrite)을 측정하였고, 요침사 검사는 현미경을 이용하여 적혈구(erythrocyte), 백혈구(leukocyte), 상피세포(epithelial cell), 원주(casts)를 관찰하고 색조는 육안으로 관찰하였다.
- 조직병리검사: 모든 생존동물에 대하여 최종계획부검을 실시하여 모든 장기의 부검소견을 관찰하였고, 고환, 전립 선, 난소, 자궁, 비장, 간장, 흉선, 부신, 신장, 심장, 폐, 뇌및 뇌하수체를 적출하여 전자저울로 절대장기중량을 측정 하였으며, 부검 전 체중을 바탕으로 상대장기중량을 산출하였다. 조직의 보존은 부검 후 뇌(brain), 뇌하수체(pituitary gland), 심장(heart), 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 방광(urinary bladder), 장간막림프절(mesenteric lymph node), 흉선(thymus), 비장(spleen), 췌장(pancreas), 침샘 (salivary gland), 턱밑림프절(submandibular lymph node), 갑상선(thyroid gland), 부갑상선(parathyroid gland), 부신(adrenal gland), 식도(esophagus), 대동맥(aorta), 척수(spinal cord), 좌골신경(sciatic nerve), 골격근(skeletal muscle), 피부(skin), 유선(mammary gland), 위(stomach), 십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum), 맹장 (cecum), 결장(colon), 직장(rectum), 대퇴골(femur), 흉골(sternum), 기관(trachea), 혀(tongue), 전립선(prostate gland), 고환(testes), 부고환(epididymis), 정낭(seminal vesicle), 난소(ovary), 자궁(uterus) 및 질(vagina)을 10% 중성 포르말린액으로 고정하였으며, 고환(testes)과 부고환(epididymis)은 Bouin’s 액에, 안구는 Davidson’s 액에 고정하였다.
- 조직의 보존은 부검 후 뇌(brain), 뇌하수체(pituitary gland), 심장(heart), 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 방광(urinary bladder), 장간막림프절(mesenteric lymph node), 흉선(thymus), 비장(spleen), 췌장(pancreas), 침샘 (salivary gland), 턱밑림프절(submandibular lymph node), 갑상선(thyroid gland), 부갑상선(parathyroid gland), 부신(adrenal gland), 식도(esophagus), 대동맥(aorta), 척수(spinal cord), 좌골신경(sciatic nerve), 골격근(skeletal muscle), 피부(skin), 유선(mammary gland), 위(stomach), 십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum), 맹장 (cecum), 결장(colon), 직장(rectum), 대퇴골(femur), 흉골(sternum), 기관(trachea), 혀(tongue), 전립선(prostate gland), 고환(testes), 부고환(epididymis), 정낭(seminal vesicle), 난소(ovary), 자궁(uterus) 및 질(vagina)을 10% 중성 포르말린액으로 고정하였으며, 고환(testes)과 부고환(epididymis)은 Bouin’s 액에, 안구는 Davidson’s 액에 고정하였다.
- 임상병리검사: 투여 마지막 주에 시험군당 암수 각 5마리의 동물을 대사케이지를 이용하여 신선요를 채집하여 요검사를 실시하고, 요량은 약 24시간 동안 채집한 양을 측정하 였다. 채집한 신선뇨를 요검사용 시험지(SIEMENS, Erlangen, Germany)와 요자동분석장치(CliniTek 50, SIEMENS) 를 이용하여 요당(glucose), 빌리루빈(bilirubin), 케톤체(ketone body), 요비중(specific gravity), 잠혈(occult blood), pH, 단백질(protein), 유로빌리노겐(urobilinogen) 및 아질산염(nitrite)을 측정하였고, 요침사 검사는 현미경을 이용하여 적혈구(erythrocyte), 백혈구(leukocyte), 상피세포(epithelial cell), 원주(casts)를 관찰하고 색조는 육안으로 관찰하였다. 모든 동물에 대하여 부검 전 하룻밤 절식한(단, 음수는 제공) 후 부검 당일 동물을 isoflurane으로 마취하고 개복하여 후대동맥에서 주사기를 이용하여 채혈 하였다.
- 모든 동물에 대하여 부검 전 하룻밤 절식한(단, 음수는 제공) 후 부검 당일 동물을 isoflurane으로 마취하고 개복하여 후대동맥에서 주사기를 이용하여 채혈 하였다. 채혈한 혈액은 EDTA-K2 Tube(BD, Franklin Lakes, NJ, USA), 3.2% Sodium citrate Tube(Vacuette North America, Monroe, NC, USA), Serum separating Tube(Sekisui Medical Co., Ltd., Osaka, Japan)에 담았고, 혈청과 혈장의 분리를 위하여 원심분리기로 3,000 rpm, 10 분간 원심분리 하여 상층액을 검사에 사용하였다. 혈액학적 검사는 EDTA-K2 Tube의 전혈로 혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS)를 이용하여 WBC(white blood cell count), RBC(red blood cell count), HCT(hematocrit), Hb(hemoglobin concentration), RDW(red cell distribution width), MCV(mean corpuscular volume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), differential blood count, PLT (platelet), MPV(mean platelet volume) 및 Reti(reticulocyte)를 측정하였다.
- 일반증상관찰은 투여 후 14일까지 실시하였다. 체중은 투여 전, 투여 후 1, 7 및 14일째(부검 전)에 측정하였다. 투여 후 14일째에 모든 생존동물을 CO2 가스를 이용하여 마취시킨 후 개복하여 후대정맥과 복대동맥을 절단하는 방법으로 방혈 치사시켜 장기에 대한 육안적인 부검 소견을 관찰하였다.
- 따라서 시험물질이 천연물인 것을 고려하여 본 시험에서는 5,000 mg/kg/d를 고용량 투여군으로 하고, 공비를 2로 두어 중용량(2,500 mg/kg/d) 및 저용량 (1,250 mg/kg/d)을 투여군으로 설정하였으며, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 두었다. 체중을 기준으로 20 mL/ kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구 투여 하였다. 투여횟수 및 투여기간은 1회/일, 7회/주, 13주간 투여하였다.
- 체중을 기준으로 20 mL/kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 단회 경구투여 하였다.
- 칭량된 여주의 15배수의 70% 주정으로 70°C에서 4시간 동안 1차 추출하고, 추출물을 얻고 남은 잔여물을 다시 10배수의 70% 주정으로 2시간 동안 2차 추출하였다.
- 투여 전 기간에 걸쳐 1일 1회 투여 직후의 일반증상을 관찰하였고, 모든 동물에 대하여 주 1회 체중과 사료섭취량 측정을 측정하였다. 투여 마지막 주에 부형제 대조군 및 고용량군에 대하여 검안경(Vantage plus, Keeler LTD., Windsor, UK)과 안저사진기(Genesis, Kowa Co., Ltd., Nagoya, Japan)를 이용하여 눈의 안저부위를 관찰하였다.
- 투여횟수 및 투여기간은 1회/일, 7회/주, 13주간 투여하였다. 투여 전 기간에 걸쳐 1일 1회 투여 직후의 일반증상을 관찰하였고, 모든 동물에 대하여 주 1회 체중과 사료섭취량 측정을 측정하였다. 투여 마지막 주에 부형제 대조군 및 고용량군에 대하여 검안경(Vantage plus, Keeler LTD.
- 체중은 투여 전, 투여 후 1, 7 및 14일째(부검 전)에 측정하였다. 투여 후 14일째에 모든 생존동물을 CO2 가스를 이용하여 마취시킨 후 개복하여 후대정맥과 복대동맥을 절단하는 방법으로 방혈 치사시켜 장기에 대한 육안적인 부검 소견을 관찰하였다.
- 체중을 기준으로 20 mL/ kg으로 투여액량을 계산하고, 투여방법은 동물의 경배부 피부를 잡아 고정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구 투여 하였다. 투여횟수 및 투여기간은 1회/일, 7회/주, 13주간 투여하였다. 투여 전 기간에 걸쳐 1일 1회 투여 직후의 일반증상을 관찰하였고, 모든 동물에 대하여 주 1회 체중과 사료섭취량 측정을 측정하였다.
- 혈액생화학적 검사는 Serum separating Tube의 혈액을 실온에 방치 후 응고시켜 원심분리 하여 얻어진 혈청을 혈액생화학검사기(Hitachi 7180, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase), GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase), ALP(alkaline phosphatase), BIL(total bilirubin), BUN(blood urea nitrogen), CRE(creatinine), UA(uric acid), GLU (glucose), CHO(total cholesterol), TG(triglyceride), PRO (total protein), ALB(albumin), A/G ratio(albumin-globulin ratio), LDH(lactate dehydrogenase), CPK(creatine phosphokinase), Ca(calcium), P(inorganic phosphorus), Mg(magnesium), Na(sodium), K(potassium) 및 Cl(chloride)을 측정하였다.
- 혈액학적 검사는 EDTA-K2 Tube의 전혈로 혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS)를 이용하여 WBC(white blood cell count), RBC(red blood cell count), HCT(hematocrit), Hb(hemoglobin concentration), RDW(red cell distribution width), MCV(mean corpuscular volume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), differential blood count, PLT (platelet), MPV(mean platelet volume) 및 Reti(reticulocyte)를 측정하였다. 혈액응고시간 검사는 3.2% Sodium citrate Tube에 담아 응고를 방지하고 원심분리 하여 얻어진 혈장을 혈액응고시간 검사장치(ACL7000, Instrumentation Laboratory Co., Lexington, MA, USA)를 이용 하여 PT(prothrombin time) 및 APTT(active partial thromboplastin time)를 측정하였다. 혈액생화학적 검사는 Serum separating Tube의 혈액을 실온에 방치 후 응고시켜 원심분리 하여 얻어진 혈청을 혈액생화학검사기(Hitachi 7180, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase), GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase), ALP(alkaline phosphatase), BIL(total bilirubin), BUN(blood urea nitrogen), CRE(creatinine), UA(uric acid), GLU (glucose), CHO(total cholesterol), TG(triglyceride), PRO (total protein), ALB(albumin), A/G ratio(albumin-globulin ratio), LDH(lactate dehydrogenase), CPK(creatine phosphokinase), Ca(calcium), P(inorganic phosphorus), Mg(magnesium), Na(sodium), K(potassium) 및 Cl(chloride)을 측정하였다.
- , Osaka, Japan)에 담았고, 혈청과 혈장의 분리를 위하여 원심분리기로 3,000 rpm, 10 분간 원심분리 하여 상층액을 검사에 사용하였다. 혈액학적 검사는 EDTA-K2 Tube의 전혈로 혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS)를 이용하여 WBC(white blood cell count), RBC(red blood cell count), HCT(hematocrit), Hb(hemoglobin concentration), RDW(red cell distribution width), MCV(mean corpuscular volume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), differential blood count, PLT (platelet), MPV(mean platelet volume) 및 Reti(reticulocyte)를 측정하였다. 혈액응고시간 검사는 3.
대상 데이터
- Vicine 분석에 사용한 칼럼은 Phenomenex hydro-RP C18, 80A(250×4.60 mm, 4 micron, Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였고 시료 주입량은 10 μL, 검출파장은 270 nm에서 측정하였다.
- 단회 경구투여 독성시험, 2주 반복투여 용량결정시험 및 13주 반복 경구투여 독성시험을 위하여 specific pathogen free(SPF) Sprague-Dawley(SD) 랫드를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 제공받았고, 단회 경구투여 독성 시험(8주령) 및 2주 반복투여 용량결정시험(6주령)은 암수 각각 군당 5마리, 13주 반복 경구투여 독성시험(6주령)은 암수 각각 군당 10마리의 동물을 이용하였다. 랫드는 SPF 동물실에 입수하여 약 일주일간의 순화기간을 거친 후 일반 증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 사용하였고, 투여 전일에 체중을 측정하고 Excel program을 이용하여 순위화한 체중으로 군 분리를 실시하였다.
- 동물은 검역, 순화, 투여 및 관찰기간에 스테인리스제 망사육상자(250W×350 L×180H mm)에 수용하였다.
- 실험에 사용한 여주 원재료는 경남 함양에 소재한 함양영농조합법인 천령식품 지점으로부터 확보하였고 경남 함양군에서 2014년도 4월부터 재배된 Nakanokoya 품종의 여주 미숙과 열매를 6월 중순에 수확하여 물로 세척, 절단 가공한 후 그 절편을 40~50°C 조건으로 수분 함량이 5~7%가 되도록 열풍건조(TJDL-15WA, Joongang Precision Co., Ltd., Daegu, Korea) 하여 사용하였다.
데이터처리
- 부형제 대조군과 시험물질 투여군 간의 비교는 일반적으로 모수적인 다중비교(parametric multiple comparison procedures) 혹은 비모수적인 다중비교(non parametric multiple comparison procedures)를 사용하였고, P<0.05 인 경우에 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.
- 일원배치 분산분석에서 유의성이 인정되고 등분산이 인정되면 Duncan’s multiple range test를, 등분산이 인정되지 않으면 Dunnett’s T test를 사용하였다. 비연속적인 자료의 분석 (요검사)은 증상의 정도로 표시된 데이터를 척도변환을 실시하여 카이제곱검정을 사용하였다.
- 연속자료의 분석(체중, 사료섭 취량, 혈액학적 검사, 혈액응고시간, 혈액생화학적 검사, 장기중량)은 일반적인 정규성을 가정하고 통계처리를 실시하였다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 방법을 통하여 군 간 유의성을 확인하고 등분산을 검정하였다. 일원배치 분산분석에서 유의성이 인정되고 등분산이 인정되면 Duncan’s multiple range test를, 등분산이 인정되지 않으면 Dunnett’s T test를 사용하였다.
- 일원배치 분산분석에서 유의성이 인정되고 등분산이 인정되면 Duncan’s multiple range test를, 등분산이 인정되지 않으면 Dunnett’s T test를 사용하였다.
이론/모형
- 또한, 모든 시험은 식품의약품안전처 고시 제2014-136호(2014년 07월 30일) ‘의약품등의 독성시험 기준’과 식품의약품안전처 고시 제2014-67호(2014년 02월 12일) ‘비임상시험관리기준’에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 13주 반복 경구투여에서 실험기간 동안 사망동물 및 특이한 일반증상은 관찰되지 않았다. 실험기간 동안 암수 2,500 및 5,000 mg/kg/d 투여군 동물에서 각각 투여 6, 4주째부터 산발적으로 유연(salivation)이 발생하였고, 5,000 mg/kg/ d 투여군에서 빈도수가 높게 발생하였지만, 시험물질에 의한 일시적인 타액 분비 촉진으로 판단되며 천연물 추출물에서 흔히 발생하는 일반증상으로 독성학적 의미가 없다(11).
- 부검 결과 수컷 부형제대조군 및 5,000 mg/kg/d 투여군에서 좌측 갑상선의 무형성(aplasia) 및 우측 갑상선의 비대(enlargement), 수컷 2,500 mg/kg/d 투여군에서 우측 귀에 결절(nodule), 암컷 부형제대조군에서 양측 안구의 혼탁 및 좌측 신장의 낭이 각 1례씩 관찰되어 조직병리학적 검사를 실시하였다. 검사 결과 좌측 갑상선의 무형성 및 우측 갑상 선의 비대는 편측성의 무형성 및 과다형성(hyperplasia), 우측 귀의 결절은 귓바퀴 연골병증(auricular chondropathy), 양측 안구혼탁(opacity)은 수정체 변성(lenticular degeneration) 및 망막주름(retinal fold), 좌측 신장의 낭(cyst)은 세뇨관변성을 동반한 신장피질에서의 낭(cyst, with tubular degeneration, cortex)으로 확인되었다. 하지만 부형제 대조군에서 관찰되었거나 부형제대조군과의 발생빈도 차이가 없는 자연발생적인 병변이었으며, 특히 귓바퀴 연골병증은 시험물질 중용량군에서 관찰된 단발성 소견이었을 뿐 아니라 랫드에서 드물지만 자연발생적으로 발생 가능한 소견 으로 보고되어 있어 독성학적 의미는 없었다(16).
- 모든 시험 결과를 종합해보았을 때 모든 시험항목에서 전신적인 독성학적 변화가 관찰되지 않았으므로 여주 추출물의 무독성량(no observed adverse effect level, NOAEL) 은 5,000 mg/kg/d로 판단되며(18), ADI를 3,000 mg/man으로 제시한다(19).
- 1). 반복 경구용 시험용 시료에서도 vicine과 RT값이 일치하는 피크는 없었고, 9.305 및 10.088분에 검출된 근접 피크의 스펙트럼을 확인한 결과 vicine과 일치하는 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로부터 여주 70% 주정 추출물에는 vicine이 존재하지 않거나 극미량일 것으로 판단된다.
- 실험종료 시 모든 생존동물의 부검 결과, 특이한 육안소견은 관찰되지 않았다. 본 시험의 최대 투여용량인 5,000 mg/kg/d 투여군에서 이상증상과 사망동물이 발견되지 않았기 때문에 개략의 치사량(approximate lethal dose, ALD)은 암수 모두 5,000 mg/kg/d로 판단된다.
- 사료 섭취량 측정 결과 수컷 2,500 mg/kg/d 투여군 8주차 사료 섭취량의 감소(P<0.01)가 관찰되었다(Fig. 6, 7).
- 시험의 투여용량 결정을 위하여 본 시험물질을 이용하여 2,500 및 5,000 mg/kg의 투여용량으로 암수 각 1마리에 단회 경구투여 한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 독성학적 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 시험물질이 천연 물인 것을 고려하여 본시험에서는 5,000 mg/kg의 단일 시험물질 투여군을 설정하였고, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 두었다.
- 2, 3). 실험종료 시 모든 생존동물의 부검 결과, 특이한 육안소견은 관찰되지 않았다. 본 시험의 최대 투여용량인 5,000 mg/kg/d 투여군에서 이상증상과 사망동물이 발견되지 않았기 때문에 개략의 치사량(approximate lethal dose, ALD)은 암수 모두 5,000 mg/kg/d로 판단된다.
- 암수 부형제대조군 및 5,000 mg/kg/d 투여군의 폐에 대한 조직병리검사 결과, 암･수컷 5,000 mg/kg/d 투여군에서 폐포 또는 종말기관지에 국소성의 염증(focal inflammation, alveolar)이 각 1례씩 관찰되었다. 소견 관찰부위가 폐의 종말기관지 부분이었고, 투여액량이 20 mL/kg이었던 점, 시험물질 투여 후 암수 모든 시험군에서 유연 증상이 관찰된 점 등으로 미루어 시험물질역류로 인한 경미한 흡인(aspiration) 소견으로 판단되며, 이는 시험물질 경구투여에 의한 직접적인 영향은 아닌 것으로 판단된다.
- 3 nm로 확인되었다. 여주 원재료에서는 vicine과 RT값이 일치하는 피크는 없었고, 9.373 및 10.222분에 검출된 근접 피크의 스펙트럼을 확인한 결과 vicine과 일치하는 않는 것으로 보아 원재료로 사용한 여주에는 vicine 존재 하지 않거나 극미량일 것으로 판단된다(Fig. 1). 반복 경구용 시험용 시료에서도 vicine과 RT값이 일치하는 피크는 없었고, 9.
- 요검사 및 요색조 관찰 결과 암수 시험물질 투여군의 케톤체, 요비중, 단백질 및 요색 항목, 수컷 시험물질 투여군의 백혈구 항목에서 부형제대조군보다 증가하는 경향을 보였 으며(P<0.01 or P<0.05), 암수 모든 시험군의 요색은 볏짚색(straw)과 무색(colorless)이 관찰되었고 시험물질 투여군 대부분의 요색은 볏짚색으로 관찰되었다(Table 1).
- 용량설정 및 일반증상관찰: 시험의 투여용량 결정을 위하여 본 시험물질을 이용하여 0, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/ kg/d의 투여용량으로 2주 반복투여 용량결정시험을 실시한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 이상증상 및 독성 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 시험물질이 천연물인 것을 고려하여 본 시험에서는 5,000 mg/kg/d를 고용량 투여군으로 하고, 공비를 2로 두어 중용량(2,500 mg/kg/d) 및 저용량 (1,250 mg/kg/d)을 투여군으로 설정하였으며, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 두었다.
- 088분에 검출된 근접 피크의 스펙트럼을 확인한 결과 vicine과 일치하는 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로부터 여주 70% 주정 추출물에는 vicine이 존재하지 않거나 극미량일 것으로 판단된다.
- 절대 및 상대 장기중량 측정 결과 암컷 5,000 mg/kg/d 투여군의 뇌에 대한 절대장기중량 수치가 감소하였다(P< 0.01)(Table 7, 8).
- 실험기간 동안 암수 2,500 및 5,000 mg/kg/d 투여군 동물에서 각각 투여 6, 4주째부터 산발적으로 유연(salivation)이 발생하였고, 5,000 mg/kg/ d 투여군에서 빈도수가 높게 발생하였지만, 시험물질에 의한 일시적인 타액 분비 촉진으로 판단되며 천연물 추출물에서 흔히 발생하는 일반증상으로 독성학적 의미가 없다(11). 체중측정 결과 암수 모든 시험군에서 시험물질과 관련된 통계학적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 4, 5). 사료 섭취량 측정 결과 수컷 2,500 mg/kg/d 투여군 8주차 사료 섭취량의 감소(P<0.
- 단회 경구투여 독성시험에서 실험기간 동안 사망동물 및특이한 일반증상은 관찰되지 않았다. 투여 전, 투여 후 1, 7 및 14일째 체중측정 결과, 암수 모든 시험군에서 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았고, 정상적인 체중 증가가 관찰되었다(Fig. 2, 3). 실험종료 시 모든 생존동물의 부검 결과, 특이한 육안소견은 관찰되지 않았다.
- 혈액생화학적 검사 결과 수컷 2,500 mg/kg/d 투여군의 UA, 수컷 5,000 mg/kg/d 투여군의 A/G ratio 및 UA 수치의 증가(P<0.01 or P<0.05), 암컷 2,500 및 5,000 mg/kg/d 투여군의 T-BIL 수치가 감소하였다(P<0.01)(Table 5, 6).
- 혈액응고시간 검사 결과 암수 모든 시험군에서 시험물질과 관련된 통계학적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다(Table 4).
- 혈액학적 검사 결과 수컷 1,250 mg/kg/d 투여군의 MCV 및 MCH 수치 증가, 수컷 5,000 mg/kg/d 투여군의 LUC 및 LUP 수치 증가, 암컷 2,500 mg/kg/d 투여군의 RDW 수치 증가, 암컷 5,000 mg/kg/d 투여군의 BA 수치 증가(P<0.05), 암컷 5,000 mg/kg/d 투여군의 Reti 수치는 감소하였 으나(P<0.05)(Table 2, 3), 그 정도가 미미하여 본 기관이 다년간 수집한 SD 랫드의 생물학적 변동범위에 속하고(14), 뚜렷한 용량의존성도 관찰되지 않아 시험물질에 의한 영향이 아닌 것으로 판단된다.
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