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문제 정의
- 본 연구에서 선정한 미생물은 유류분해능이 있다고 보고된 호기성미생물 Pseudomonas fluorescence이며, 이는 생물막 형성이외에도 부가적인 오염물질 분해효과를 확인 하기 위한 것이다(Komlos et al., 1998). P.
제안 방법
- 회분식 실험은 칼럼 실험에 필요한 미생물의 동역학상수 측정을 위해 실시하였다. 250 mL 삼각플라스크에 2종의 탄소원(글루코즈와 당밀)의 농도를 각각 0.5, 1, 2, 5, 10 g/L로 변화하였고, 영양액 조성(Table 1)도 동일한 배율로 희석하였다. P.
- 42 mm)로 거른 후, 체에 잔류한 모래 시료와 통과한 모래의 비를 다양한 비율로 혼합하여 칼럼에 충진하였다. 2개의 Column을 직렬로 연결한 칼럼반응조(높이 480 mm)의 최하단부에 미생물 접종액 30 mL을 주입한 후 미생물의 Washout을 방지하기 위하여 24시간 동안 지체기를 둔 후 통수하였다. 이때 시간의 경과에 따른 투수계수의 변화를 관측함과 동시에 유입수와 유출수 시료를 채취하여 DO, pH, 온도 및 CODcr을 측정하였다.
- Table 3에서와 같이 40번체를 통과한 작은 모래의 양이 증가할수록 공시험에서의 투수계수는 감소하였으며, 투수 계수의 변화값을 고려하여 본 실험에서는 충진한 모래의 40번체 잔류량 : 통과량의 비를 1 : 0.5(투수계수 0.041 cm/sec)로 결정하였다.
- fluorescence를 접종한 반응조는 상온 (23 ± 2℃)에서 Shaker table(150 rpm)로 교반하면서, 2시간 간격으로 Optical density(OD)의 변화를 600 nm에서 측정하였다. 그러나 당밀 반응조에서 OD를 측정할 때, 당밀에 의해 간섭이 되어 당밀 반응조에서는 VSS(Volatile suspended solids) 농도를 직접 측정하였다. VSS의 측정은 Gelman社의 Glass fiber filter(pore size 0.
- )에 설치하고 오염이 있더라도 미생물의 성장을 최소화하기 위하여 Feed tank는 냉장고 내부에 설치하였다. 그리고 실험시작 전에 오염을 방지하기 위하여 모든 실험 장치를 80% 에탄올로 살균 혹은 Autoclave 멸균을 하여 사용하였다. 일정수두 실험에서는 각 칼럼 수두변화는 칼럼반응조의 측면에 연결된 Piezometer로 측정하였다.
- 또한 미생물의 오염 및 미생물 증식을 방지하기 위하여 Air filter(Whatman社 polycap 36 TF, pore size 0.2 µm)를 설치하였다.
- 미생물막 발달에 의한 통한 투수계수의 변화, 기질의 소모 및 미생물량의 변화는 일정수위 투수 시험으로 측정하였다. 투수계수의 단기변화측정을 위해 탈이온수로 깨끗이 씻은 일반 모래를 체(눈목 0.
- 미생물을 접종하지 않고 모래로만 채운 칼럼에서의 투수계수는 Fig. 2와 같이 병렬로 연결하여 짧은 시간 내많은 실험을 수행하였고, 미생물 막에 의한 투수계수 감소를 측정한 일정수두 실험(2.0 m)은 Fig. 3과 같이 Unit 칼럼을 직렬로 배치하여 실험하였다. 부수장치로 칼럼내로 기질과 영양액을 유입시키는 Constant head reservoir와 이 Reservoir에 물을 공급하기 위한 펌프 장치, 마지막으로 영양액을 저장하는 Feed tank는 별도로 구성하였다.
- 3과 같이 Unit 칼럼을 직렬로 배치하여 실험하였다. 부수장치로 칼럼내로 기질과 영양액을 유입시키는 Constant head reservoir와 이 Reservoir에 물을 공급하기 위한 펌프 장치, 마지막으로 영양액을 저장하는 Feed tank는 별도로 구성하였다. Constant head reservoir내에는 높이 150 mm의 월류벽을 설치하여 여분의 영양액이 월류하여 다시 Feed tank로 유하되어 일정한 수두를 유지한다.
- 반면에 당밀을 탄소원으로 한 영양액에 접종한 경우에는 고농도(5~10 g/L)에서는 지체기가 없이 곧바로 대수성장기를 보였고, 저농도에서도 지체기가 10시간 이내로 매우 짧은 것으로 관측되었다. 상기에서 기술한 바와 같이 Glucose 주입 반응조에서는 Fig. 4에서와 같이 OD600값과 VSS가 선형관계를 보였으므로, OD600을 측정하여 대수성장기에서의 기질의 농도(S) 에 따른 미생물 성장속도(V)를 관측하고, Monod식(Eqn. 1)의 제 변수를 Fig. 5에서와 같이 Lineweaver-Burk식 (Eqn. 2)으로 산정하였다.
- 이때 시간의 경과에 따른 투수계수의 변화를 관측함과 동시에 유입수와 유출수 시료를 채취하여 DO, pH, 온도 및 CODcr을 측정하였다. 실험 5일 후, Column을 해체하고각 Sample port위치에서 토양시료 10~15 g을 채취하여 VSS(Volatile Suspended Solids)를 측정하였다. 칼럼실험에 사용된 영양액은 Table 1 농도의 1/10배로 기질(당밀1 g/L)을 별도로 첨가하고 저장소에 넣기 전 Filter(0.
- 45 µm)로 시료를 여과한 후, Standard Methods 2540 D(APHAAwwA-WPCF, 1995)에 의해 측정하였다. 오염 방지를 위하여 실험 장치는 모두 Autoclave로 멸균한 뒤 사용하였으며, P. fluorescence의 접종은 Clean bench에서 실시하고, 접종 후 통기가 가능한 멸균 Plug를 장착하여 오염을 방지하였다.
- 2개의 Column을 직렬로 연결한 칼럼반응조(높이 480 mm)의 최하단부에 미생물 접종액 30 mL을 주입한 후 미생물의 Washout을 방지하기 위하여 24시간 동안 지체기를 둔 후 통수하였다. 이때 시간의 경과에 따른 투수계수의 변화를 관측함과 동시에 유입수와 유출수 시료를 채취하여 DO, pH, 온도 및 CODcr을 측정하였다. 실험 5일 후, Column을 해체하고각 Sample port위치에서 토양시료 10~15 g을 채취하여 VSS(Volatile Suspended Solids)를 측정하였다.
- , 1998), 투수계수의 감소를 정확히 평가하고 부수적인 오염물질의 저감효과를 확인하기 위해서는 단일 미생물로 생성된 생물막의 발달에 의한 투수계수의 감소 및 지속적 유지 실험이 필요하다. 이에 본 연구에서는 단일 미생물을 이용하여 기초적 생물학적 동역학 상수를 산정하고 탄소원을 선택한 후, 이를 바탕으로 실험실 규모의 수두변화 측정이 가능한 칼럼 반응조에 적용하여 단일미생물에 의한 생물막의 초기생성 시 기질과 전자수용체 주입에 따른 투수계수의 감소와 미생물량 및 기질의 소모율 변화를 관측하였다.
- 일정 수위 투수시험 시작 전, 40번체(눈목 0.42 mm)를 통과시킨 모래와 40체에 잔류한 모래의 비율을 변화하면서 칼럼에 충진하고 미생물을 접종하지 않은 채로 공시험을 실시하였다. 그리고 각각의 경우에 대한 투수계수 K(cm/sec)를 Eqn.
- 그리고 실험시작 전에 오염을 방지하기 위하여 모든 실험 장치를 80% 에탄올로 살균 혹은 Autoclave 멸균을 하여 사용하였다. 일정수두 실험에서는 각 칼럼 수두변화는 칼럼반응조의 측면에 연결된 Piezometer로 측정하였다.
- 토양 내 미생물막의 성장에 의한 투수계수 감소 및 미생물량의 측정을 수행하기 위해 칼럼 반응조를 고안하였다. 칼럼 실험 장치를 운영하는 방법은 크게 직렬과 병렬연결로 구분할 수 있는데, 본 연구에서는 필요에 따라 직렬 혹은 병렬로 조립하여 칼럼 본체의 큰 변경 없이 쉽게 두 가지 방식으로 실험을 수행할 수 있도록 Unit 칼럼을 고안하여 사용하였다.
- 칼럼의 양단(유입구 및 유출구)에서 시료를 채취하여 CODcr, pH 및 DO를 측정하였으며, 칼럼 실험기간 동안에는 칼럼 외부에 열선을 감아 온도를 23 ± 2℃로 유지하였다.
- 토양 내 미생물막의 성장에 의한 투수계수 감소 및 미생물량의 측정을 수행하기 위해 칼럼 반응조를 고안하였다. 칼럼 실험 장치를 운영하는 방법은 크게 직렬과 병렬연결로 구분할 수 있는데, 본 연구에서는 필요에 따라 직렬 혹은 병렬로 조립하여 칼럼 본체의 큰 변경 없이 쉽게 두 가지 방식으로 실험을 수행할 수 있도록 Unit 칼럼을 고안하여 사용하였다.
- 미생물막 발달에 의한 통한 투수계수의 변화, 기질의 소모 및 미생물량의 변화는 일정수위 투수 시험으로 측정하였다. 투수계수의 단기변화측정을 위해 탈이온수로 깨끗이 씻은 일반 모래를 체(눈목 0.42 mm)로 거른 후, 체에 잔류한 모래 시료와 통과한 모래의 비를 다양한 비율로 혼합하여 칼럼에 충진하였다. 2개의 Column을 직렬로 연결한 칼럼반응조(높이 480 mm)의 최하단부에 미생물 접종액 30 mL을 주입한 후 미생물의 Washout을 방지하기 위하여 24시간 동안 지체기를 둔 후 통수하였다.
- 호기성 조건하에서 순수미생물에 의한 생물벽체의 형성 조건을 파악하기 위하여, 순수미생물 Pseudomonas fluorescence를 분양받아 두 가지 탄소원(글루코즈와 당밀)에 대한 동역학 상수를 산정하고, 동역학 상수 값에 따라 칼럼반응조 유입수의 기질농도를 결정한 후, 칼럼실험을 실시하였다. 실험 결과에 의하면 호기성 조건하에서의 투수계수 감소속도는 초기 3일간 급격하였으나, 3일 이후부터는 완만하게 변하였다.
- 회분식 실험은 칼럼 실험에 필요한 미생물의 동역학상수 측정을 위해 실시하였다. 250 mL 삼각플라스크에 2종의 탄소원(글루코즈와 당밀)의 농도를 각각 0.
대상 데이터
- P. fluorescence는 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 동결·건조된 균주를 생리식염수(0.8% NaCl)로 재생시킨 후, Table 1의 조성을 갖는 평판배지에 접종하여 25℃ 저온배양기에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 아크릴 Unit 칼럼은 Fig. 1과 같이 높이 240 mm, 내경 100 mm이며, 측면에 양단으로부터 40 mm, 내부 간격 80 mm가 되는 3곳의 위치에 원둘레를 따라 90도 간격으로 내경 3/8' 원형 Hole 4개를 설치하였다.
이론/모형
- 그리고 각각의 경우에 대한 투수계수 K(cm/sec)를 Eqn. 3의 Darcy 법칙에 대입하여 산출하였다.
- 칼럼의 양단(유입구 및 유출구)에서 시료를 채취하여 CODcr, pH 및 DO를 측정하였으며, 칼럼 실험기간 동안에는 칼럼 외부에 열선을 감아 온도를 23 ± 2℃로 유지하였다. DO와 온도 는 DO meter(YSI社 model 5100)를, pH는 pH meter(ORION社 model 550) 로, CODcr은 Standard Methods의 Closed refluxcolorimetric method로 측정하였다.
- VSS의 측정은 Gelman社의 Glass fiber filter(pore size 0.45 µm)로 시료를 여과한 후, Standard Methods 2540 D(APHAAwwA-WPCF, 1995)에 의해 측정하였다.
성능/효과
- , 1997). 그 결과 토양의 투수계수가 현저히 감소한다.
- 그 결과, 글루코즈와 당밀반응조의 상관계수가 0.95 및 0.88로 비교적 높은 선형관계를 보였으며, 산정된 미생물 동역학 상수는 Table 2에서와 같이 글루코즈의 경우 Vmax 0.246, Ks 509.9이며, 당밀의 경우 Vmax 0.073, Ks 326.6로 각각 산정되었다.
- 실험 결과에 의하면 호기성 조건하에서의 투수계수 감소속도는 초기 3일간 급격하였으나, 3일 이후부터는 완만하게 변하였다. 기질 농도와 전자수용체 농도를 측정하여 그 원인을 살펴본 결과, 기질의 농도보다는 전자수용체의 농도가 미생물 성장의 제한 조건이 되는 것으로 판단하였다. 그러나 6일 만에 투수계수가 다른 조건에 비하여 매우 빨리 일어났으나, 6.
- , 1995). 따라서 본 연구에서 탄소원과 질소원이 충분한 상태에서 산소부족이 환경스트레스로 작용하고 EPS 생산을 유도할 수도 있으나, 그 결과인 투수계수의 급격한 감소가 발생하지는 않았다. 그러므로 투수계수의 감소는 미생물 증식이 더욱 중요한 요인이 되며, 반응벽체 내 미생물의 증식은 산소 농도에 제한된 것으로 추정된다.
- 호기성 조건하에서 순수미생물에 의한 생물벽체의 형성 조건을 파악하기 위하여, 순수미생물 Pseudomonas fluorescence를 분양받아 두 가지 탄소원(글루코즈와 당밀)에 대한 동역학 상수를 산정하고, 동역학 상수 값에 따라 칼럼반응조 유입수의 기질농도를 결정한 후, 칼럼실험을 실시하였다. 실험 결과에 의하면 호기성 조건하에서의 투수계수 감소속도는 초기 3일간 급격하였으나, 3일 이후부터는 완만하게 변하였다. 기질 농도와 전자수용체 농도를 측정하여 그 원인을 살펴본 결과, 기질의 농도보다는 전자수용체의 농도가 미생물 성장의 제한 조건이 되는 것으로 판단하였다.
- 실험결과에 따르면 글루코즈가 당밀에 비해 최대비성장 속도는 3.4배로 높았으나, 당밀은 반속도상수가 작아 미생물의 기질친화력이 크고, 미생물 접종시 지체기가 짧거나 거의 없었다. 더불어, 당밀에 탄소원이 풍부하여 오염물질의 분해시 에너지원으로 적절하며, 유류 및 염소계 유기용매의 탈염소반응시 충분한 탄소를 제공하며 글루코즈에 비하여 저렴하므로(Kao et al.
- 6) 위치의 시료를 채취하여 VSS를 측정한 결과이다. 이 결과에서는 기존에 보고된 바와 같이 기질과 전자수용체(산소)가 고농도로 존재하는 유입되는 유입부 인근 (1번 위치)에서의 미생물량이 3.143 mg/Kg-soil 로 가장 높고, 상부로 이동할수록 미생물량이 감소하는 것을 보여주고 있다. 그 이유는 초기에 주입된 기질 및 전자수용체에 의하여 주입정 인근부터 미생물이 성장하고, 성장과정에서 미생물이 배출하는 EPS가 공극을 메움으로써 투수계수의 감소가 발생하지만, 생물벽체 내부로의 기질이동을 감소시켜 벽체내부에서의 미생물 증식을 제한하는 요인이 되는 것으로 보고되고 있다(Kim et al.
- 칼럼반응조 유입수 및 유출수의 기질(CODcr)과 DO 농도를 측정한 결과에 의하면(Fig. 8, Fig. 9) 기질은 반응조 유출수에서 여전히 높은 농도를 보이고 있으나 투수계수의 감소가 0.001 sm/sec 이하로 감소되는 4일째부터는 전자수용체인 산소의 농도가 크게 낮아지는 것을 알 수 있다. 미생물 EPS는 표면전하, 친유성과 같은 물리화학적 특성에 영향을 주어 부착성을 조절하지만, EPS 생산은 환경여건, 기질의 양과 종류, 성장율 및 성장단계 등의 많은 변수에 영향을 받는다.
후속연구
- 8 × 10−3배 감소하여 문헌상에 보고된 탈질조건에서의 투수계수 감소보다는 빠른 것으로 나타났다. 그러므로 생물벽체를 오염물질의 확산방지용으로 사용하기 위해서는 통기성 생물막 형성 미생물을 이용하여 초기에는 투수계수의 신속한 감소를 위하여 호기성 조건으로 운영하다가 생물막이 형성된 다음에는 질산성 질소를 전자수용체로 사용하는 2단 생물벽체가 필요할 것으로 판단된다. 이에 상기의 두 조건에 대한 생물벽체 형성 및 투수계수 감소 실험을 수행하고 있다.
- 특히, 생물벽체는 주입된 기질, 전자수용체, 접종된 미생물종 및 미생물군의 구성에 따라 안정성이 변화하므로 (Komlos et al., 1998), 투수계수의 감소를 정확히 평가하고 부수적인 오염물질의 저감효과를 확인하기 위해서는 단일 미생물로 생성된 생물막의 발달에 의한 투수계수의 감소 및 지속적 유지 실험이 필요하다. 이에 본 연구에서는 단일 미생물을 이용하여 기초적 생물학적 동역학 상수를 산정하고 탄소원을 선택한 후, 이를 바탕으로 실험실 규모의 수두변화 측정이 가능한 칼럼 반응조에 적용하여 단일미생물에 의한 생물막의 초기생성 시 기질과 전자수용체 주입에 따른 투수계수의 감소와 미생물량 및 기질의 소모율 변화를 관측하였다.
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