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문제 정의
- 통해 고생산 균주를 선별하고자 하였고 선별된 균주를 이용하여 통계적 프로그램을 통해 생산 배지 조성을 최적화 하고자 하였다.
- 이를 위해서는 성장배양 전 단계인 포자형성 단계로부터 충분히 많은 포자를 형성하여야 하는데 기존의 포자형성 배지인 PDA는 충분한 양의 포자를 형성하지 못하여 slant에서의 배양이 불가능하였다. 따라서 통계적 프로그램인 Plackett-Burman design을 이용하여 포자형성 배지의 조성을 최적화하고자 하였다. 문헌 조사를 통해 쌀에서 생산 균주를 배양할 경우 다량의 포자를 획득할 수 있다는 결과를 토대로(11) 기본 배지 성분으로 rice powder 와 agar powder를 이 용하고 Plackett-Burman design에 따라 11가지 성분을 high value (+1)와 low value (-1)의 12가지 조합으로 혼합하여 첨가한 후 peE-dish에 부어 건조시키고 생산 균주의 포자를 약 1 X 106 spores로 접종하여 배양한 결과 각 조합에서 Table 2와 같은 결과를 확인하였다 이를 통계프로그램을 이용해 분석한 결과 각성분들이 생산균주의 포자형성에 미치는 영향을 나타내는 main effect와 실험의 유의성을 확인하는 P값은 Table 3과 같다' 실험 결과 대부분의 조합에서는 실험 균주가 본래 가지고 있는 포자형성 능력보다 낮거나 비슷하게 나타났지만, 6번 조합의 경우 주목할 만하게도 기존 배지에서보다 약 200배가량 많은 수의 포자를 형성하는 것으로 나타났다.
- 있다. 본 연구에서는 monacolin-K 고생산성 균주개량의 효율성을 큰 폭으로 증가시키고자, 기존의 플라스크 액상배양 방법을 소규모화시킨 tube 배양 방법을 개발함으로써 단기간에보다 많은 양의 균주를 테스트하고자 하였다. 이 차대 사산 물인 monacolin-K의 생합성은 각각의 배양단계에서의 생산 균주의 배양형태가 중요한더】, 특별히 최종 생산 배양에서 생산성 증가에 심각한 영향을 미치는 배양 형태인 직경 1 mm 이하의 pellet 모양을 유도하기 위해서는 성장배양 시에 반드시 고농도의 균사 모양이 유도되어야 하는 것으로 관찰되었다' 50 ml tube (7 ml의 조업 부피)를 이용하는 소 计모 액상 성장 배양의 경우 solid seed 배양 단계에서의 포자형성 배지의 조성을 통계적 방법을 통해 최적화하고, 또한 성장배지 성분에 brown rice 가루 20 g/L를 첨가할 때, 원하는 균사모양의 배양 형태가 유도됨을 확인할 수 있었다.
- 위와 같은 실험으로 결정된 성장 배양까지의 miniature 배양 방법을 모두 적용하여 생산 균주의 random screening을 수행하면서 기존방법인 flask 성장 배양의 경우와 비교함으로써 성장배양의 miniature 배양 방법 적용의 가능성을 확인하고자 하였다. 실험 결과 miniature 배양 방법의 경우 여전히 monacolin-K 생산성이 다소 불안정하기는 하지만 같은 조건에서 monacolin-K의 안정적인 형태인 lactone form 이 flask 성장배양의 경우보다 많이 생산되는 것을 확인할 수 있었고 같은 균주로 miniature 배양 방법과 flask 배양 방법을 동시에 수행하였을 때의 monacolin-K 생산성을 비교하였을 때 대부분의 균주가 배양과정에서의 오차범위를 포함하는 최대 생산성의 ±20% 내에 존재하는 것을 확인하였으므로 (Fig.
제안 방법
- 균사 형성 곰팡이의 배양 시 원활한 산소공급이 2차 대사산물의 생산을 위한 중요한 배양 인자라는 것이 많은 연구를 통해 알려져 있다(4). 50 ml tube 성장 배양 시에는 tube 구조상 산소의 공급이 제한적일 수밖에 없으므로 생산균주의 배양이 산소제한 조건에서 이루어져 monacolin-K 생산성이 불안정하였다, 따라서 소규모 성장 배양을 유지하되 같은 조건에서 산소공급을 최대한 늘리고자 성장 배양 tube를 기울여 진탕배양 할 경우 shaking의 효과가 증대되어 비교적 많은 양의 산소가 배양액 내로 공급될 수 있을 것이라 판단하여 성장 배양 시 tube를 기울여 진탕배양 하였다(Fig. 5). 결과 기존의 배양 방법에 비해 비교적 안정적으로 높은 생산성을 보이는 것을 확인하여(Fig.
- 실험결과를 Design expert program에 적용시켜 각 성분의 main effect와 실험의 유의성을 확인하는 P값을 확인하였다(Table 4). ANOVA 분석결과 P값이 0.05 이하로 유의성을 갖는 성분은 비록 없었지만, 가장 생산성이 높게 나온 8번 조합에서 main effect가 높은 성분들을 선택하여 해당 농도를 중심점으로 하는 중심합성계획법을 수행하였다.
- 2 inl/min로 하였다. Column 온도는 40℃ 로 고정하였고, UV absorbance detector (Younglin Co., Korea)를 이용하여 238 nm에서 시료 내의 monacolin-K 를 검출하였다.
- ruber 배양액을 homogenizer로 균일화시킨 후 sample로 취한 10 ml에 동량의 acetone을 첨가하여 완전히 혼합한 후에 12시간 동안 200 rpm, 28 ℃ 의 진탕 배양기에서 배양한 후 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 moiiacolin-K를 포함하고 있는 1 id의 상등액을 취했다. HPLC 분석을 위 한전 처리 과정으로 이 상등액을 15,000 rpm에서 10분간 다시 원심분리한 후 얻은 상등액을 0.2 ㎛의 microfiltei■를 통과 시켜 sample을 만들고 이를 이용하여 monacolin-K의 농도를 정량 분석하였다. Monacolin-K lactone form의 표준용액으로는 순수한 mevinolin을 농도별로 methanol에 용해시켜 사용하였고, acidic form인 mevinolinic acid 표준용액은 6 ml의 methanol에 4.
- Miniature 배양 방법의 확립을 위해 포자형성 과정과 성장 배양 단계의 조건을 변화시키면서 각 단계의 배지 조성을 변화시킴으로써 그 다음 단계인 생산 배지에 접종 시 변화된 배지 성분이 생산배 지에 전달되므로 생 산균주의 monacolin-K 생산성에 영향을 주어 생산성이 감소하는 결과를 관찰하였다. 따라서 miniature 배양을 위한 성장 배지 조성의 변화에 따른 새로운 생산 배지 조성을 확립할 필요가 있었다.
- Plackett-Burman design을 통해 monacolin-K 생산에 있어 비교적 큰 effect# 보이는 성분으로 확인된 glycerol, malt extract, yeast extract, brown rice의 4가지 성분을 이용하여 monacolin-K의 생산을 위한 각 성분들의 최적농도를 확립하고자 반응표면분석법을 수행하였다. 선정된 4가지 성분을 이용하여 중심합성계획법에 따라 6개의 중점을 포함하는 30가지 농도조합으로 실험을 수행한 결과 각 조합의 생산성은 Table 5와 같다.
- 따라서 tube 성장 배양의 filamentous 배양형태를 확립하기 위해 곰팡이의 균사 형성에 도움을 준다고 알려진 현미 (Brown rice)를 기존의 Cy 성장 배지에 농도별로 첨가하고 첨가 농도에 따른 성장 배양 형태, 그리고 생산배양에 접종하였을 때 생산 배양 형태와 생산성을 확인하였다(Fig. 3). 결과 현미를 20 g/L 이상 첨가했을 때 filamentous 성장 배양 형태와 pellet 생산 배양 형태를 형성하고 비교적 안정적인 monacolin-K 생산성을 나타냈다.
- 본연구에서 이용한 Momsms의 경우 포자나 균사체의 형성이 활발하지 않은 배양 생리적 특성으로 인하여 포자와 균사체를 충분히 확보하고자 plate에서 포자형성을 하였고 성장 배양 또한 플라스크에서 수행함으로써 배지의 양과 실험수행의 공간적인 문제 그리고 많은 실험 기자재의 확보가 선행되어야 하므로 균주의 mass screeninge 사실상 불가능한 상태였다. 따라서 균주의 mass screenin음을 위해서는 소규모배양 방법의 확립이 필수적이라 할 수 있는데 이를 위하여 배양 초기단계인 포자형성 단계와 성장 배양 단계의 조건을 다양하게 변화시켜 최적 조건을 탐색하였다.
- 또한 같은 면적에서 형성한 포자를 회수하여 성장 배양에 같은 양 접종할 경우 성장 배지 부피가 적을수록 포자가 농축되므로 더 많은 수의 포자를 접종한 효과를 나타낼 것으로 생각할 수 있었다. 따라서 기존에는 5 ml의 배지를 최대로 기울여 건조한 agar slant를 이용하였는데 포자형성 배지면적을 늘리고자 포자 형성 배지의 부피를 7 ml, 10 ml로 증가시키고 성장 배지 부피는 기존의 10 ml에서 7 ml, 5 ml로 감소 시켜 각 조합에 따른 배양 형태와 monacolin-K 생산성을 확인하였다 (Fig. 4). 결과 성장 배양에서의 filamentous 배양형태와 생산 배양의 compact pellet 배양 형태는 모든 조합의 조건에서 유사하게 나타났으며 monacolin-K 생산성은 slant 7 ml, 성장 배지 7 ml의 조건에서 비교적 안정적으로 가장 높게 나타났다.
- 이러한 결과는 소규모배양 방법을 확립하기 위해 새로이 개발한 포자형성 배지와 성장 배지의 조성변화로 인해 기존에 확립된 생산 배지에서는 생산균주의 monacolin-K 생합성 능력이 최대로 발휘되지 않았기 때문에 발생한 것으로 판단되었다. 따라서 본연구를 통해 확립된 소규모 성장 배양에 적합한 최적의 생산 배지 조성을 확립하고자 통계적 방법인 Plackett-Burman design을 적용하여 monacolin-K 생산성 향상에 영향을 주는 glycerol, malt extract, yeast extract, brown rice의 47)-^] 성분들을 최종 선별하였고, 또한 이들의 최적농도 결정을 위해 반응표면분석 실험을 수행하였다. 이와 같이 결정된 최적 생산 배지를 사용하여 생산 배양을 수행한 결과, monacolin- K의 생산성이 2배 이상 증가하고, 배양 형태 또한 용존산소와 영양분의 전달이 매우 용이한 직경 1mm 이하의 pellet 모양을 유지함을 확인할 수 있었다.
- 결과 현미를 20 g/L 이상 첨가했을 때 filamentous 성장 배양 형태와 pellet 생산 배양 형태를 형성하고 비교적 안정적인 monacolin-K 생산성을 나타냈다. 따라서 소규모 성장 배양을 위한 성장 배지로 Cy 배지에 현미를 20 g/L 농도로 첨가하기로 결정하고 이름을 CyB 배지로 명명하였다.
- 성장 배양은 7일간 PDA에서 배양한 spore 들을 20% glycerol이 포함된 증류수로 수거하여 성장 배지 (glucose 30 g/1, (NHQ2SO4 10 g/1, KH2PO4 0.75 g/1, MgSO4 7H2O 0.5 g/1, CaCh 0.1 g/1, trace element solution 1 ml/1) 50 皿에 접종하였으며 이를 진탕 배양기에서 28℃, 120 rpm으로 5일간 배양하였다. 생산배양은 성장 배지에서 자란 myc이ium을 생산 배지 (glycerol 60 g/1, lactose 20 g/1, yeast extract 16 g/1, KH2PO4 5 g/1) 30 ml에 10% (v/v)으로 접종하여 28 ℃, 230 rpm에서 10일간 배양하였다' 성장 배양은 250 ml baffled flask를 이용하였고, 생산 배양은 250 ml 일반 플라스크를 이용하였다'
- 기존 생산 배지 성분인 glycerol, lactose, yeast extract, KH2PO4와 monacolin-K 생산성 증가에 효율적이라고 판단되는 brown rice, glucose, dextrin, malt extract, ammonium sulfate, 그리고 monacolin-K의 전구물질로 밝혀진 acetate와 관련된 sodium acetate, 그리고 생산균주의 분화 (differentiation)에 관여할 것으로 예상되는 y-butyrolactone을 조사하였다' 총 11가지 성분을 이용하여 Plackett-Burman design을 수행하였고 이를 통해 monacolin-K 생산에 effect 를 보이는 성분을 탐색한 결과 대부분의 조합에서는 monacolin-K 생산성이 실험 균주가 본래 가지고 있는 생산성보다 낮게 나타났지만, 8번 조합의 경우 주목할 만하게도 기존 배지에서보다 생산성이 증가하여 300 mg/L의 monacolin-K 가 생산되는 것으로 나타났다. 실험결과를 Design expert program에 적용시켜 각 성분의 main effect와 실험의 유의성을 확인하는 P값을 확인하였다(Table 4). ANOVA 분석결과 P값이 0.
- 여러 문헌을 참고로 하여 monacolin-K 생산에 사용되는 배지 성분과 기존 생산 배지 성분을 중점적으로 조사하였다. 기존 생산 배지 성분인 glycerol, lactose, yeast extract, KH2PO4와 monacolin-K 생산성 증가에 효율적이라고 판단되는 brown rice, glucose, dextrin, malt extract, ammonium sulfate, 그리고 monacolin-K의 전구물질로 밝혀진 acetate와 관련된 sodium acetate, 그리고 생산균주의 분화 (differentiation)에 관여할 것으로 예상되는 y-butyrolactone을 조사하였다' 총 11가지 성분을 이용하여 Plackett-Burman design을 수행하였고 이를 통해 monacolin-K 생산에 effect 를 보이는 성분을 탐색한 결과 대부분의 조합에서는 monacolin-K 생산성이 실험 균주가 본래 가지고 있는 생산성보다 낮게 나타났지만, 8번 조합의 경우 주목할 만하게도 기존 배지에서보다 생산성이 증가하여 300 mg/L의 monacolin-K 가 생산되는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 Monacolin-K 생산 균주로써 자낭균에 속하는 Monascus 地ber의 돌연변이 주를 모균주로 사용하였다. 포자형성배지인 PDA (potato dextrose agar) plate에 균주를 접종하여 28笆에서 7일간 배양한 후 20% glycerol이 포함된 증류수로 spore를 수거하여 여과한 후 잔여물을 제거한 포자들로 liquid stock을 만들고 -80℃ deep Hezei에 보관하였다.
데이터처리
- 선정된 4가지 성분을 이용하여 중심합성계획법에 따라 6개의 중점을 포함하는 30가지 농도조합으로 실험을 수행한 결과 각 조합의 생산성은 Table 5와 같다. DESIGN EXPERT 6.0 프로그램을 이용하여 분석한 결과 다음과 같은 반웅표면 2차 회귀모형 식을 얻을 수 있었다.
- 통계적 최적화 실험은 DESIGN EXPERT 6.0 software에 따라 계획되었고 Plackett-Bunnan design과 반응표면분석법을 위한 각 성분과 농도는 Table 1과 같다.
이론/모형
- °] 방법이 Plackett-Burman design 으로 통계적 조합을 통해 적은 수의 실험을 수행함으로써 시간과 경비를 상당히 절약할 수 있으나 변수들 간의 상호작용에 대한 정보를 얻을 수 없으며, 단지 중요한 변수만을 선별하는데 중점을 두고 있다. 따라서 1차적으로 여러 변수들 중에서 효과가 탁월한 3~4개의 변수를 선택한 후 이들 중요변수들의 상호작용 여부를 조사하기 위하여 반응표면분석법 (Response Surface Methodology, RSM)을 수행한다. 반응표면분석법은 여러 가지 실험 인자들, 즉 독립 변수의 상호작용에 따른 종속변수의 변화에 대하여 최대 반응치를 나타내는 최적 조건을 찾아내기 위해 이용되는 통계적인 분석 방법이다(9).
성능/효과
- 문헌 조사를 통해 쌀에서 생산 균주를 배양할 경우 다량의 포자를 획득할 수 있다는 결과를 토대로(11) 기본 배지 성분으로 rice powder 와 agar powder를 이 용하고 Plackett-Burman design에 따라 11가지 성분을 high value (+1)와 low value (-1)의 12가지 조합으로 혼합하여 첨가한 후 peE-dish에 부어 건조시키고 생산 균주의 포자를 약 1 X 106 spores로 접종하여 배양한 결과 각 조합에서 Table 2와 같은 결과를 확인하였다 이를 통계프로그램을 이용해 분석한 결과 각성분들이 생산균주의 포자형성에 미치는 영향을 나타내는 main effect와 실험의 유의성을 확인하는 P값은 Table 3과 같다' 실험 결과 대부분의 조합에서는 실험 균주가 본래 가지고 있는 포자형성 능력보다 낮거나 비슷하게 나타났지만, 6번 조합의 경우 주목할 만하게도 기존 배지에서보다 약 200배가량 많은 수의 포자를 형성하는 것으로 나타났다. ANOVA 분석 결과 P값이 0.05 이하로 유의성을 갖는 성분은 없었지만, 가장 포자형성이 잘 되는 6번 조합에서 main effect가 높은 성분들을 선택하여 새로운 포자형성 배지를 조성하였고, 이를 PB1 배지라고 명명하였다. 본 실험의 재현성을 확인하기 위하여 기존의 포자형성 배지인 PDA와 새로운 포자형성 배지인 PB1 배지에서 생산 균주의 포자형성과 성장 배양 형태, 생산성에 미치는 영향을 확인한 결과 포자형성이 100배 이상 증가한 것을 관찰하였다(Fig.
- 5). 결과 기존의 배양 방법에 비해 비교적 안정적으로 높은 생산성을 보이는 것을 확인하여(Fig. 6) miniature 성장 배양 시 tube를 기울여 shaking하기로 결정하였다.
- 4). 결과 성장 배양에서의 filamentous 배양형태와 생산 배양의 compact pellet 배양 형태는 모든 조합의 조건에서 유사하게 나타났으며 monacolin-K 생산성은 slant 7 ml, 성장 배지 7 ml의 조건에서 비교적 안정적으로 가장 높게 나타났다. 따라서 배양조건을 포자형성은 7 ml agar slant, 성장 배양은 7 而로 결정하였다.
- 3). 결과 현미를 20 g/L 이상 첨가했을 때 filamentous 성장 배양 형태와 pellet 생산 배양 형태를 형성하고 비교적 안정적인 monacolin-K 생산성을 나타냈다. 따라서 소규모 성장 배양을 위한 성장 배지로 Cy 배지에 현미를 20 g/L 농도로 첨가하기로 결정하고 이름을 CyB 배지로 명명하였다.
- 기존 생산 배지 성분인 glycerol, lactose, yeast extract, KH2PO4와 monacolin-K 생산성 증가에 효율적이라고 판단되는 brown rice, glucose, dextrin, malt extract, ammonium sulfate, 그리고 monacolin-K의 전구물질로 밝혀진 acetate와 관련된 sodium acetate, 그리고 생산균주의 분화 (differentiation)에 관여할 것으로 예상되는 y-butyrolactone을 조사하였다' 총 11가지 성분을 이용하여 Plackett-Burman design을 수행하였고 이를 통해 monacolin-K 생산에 effect 를 보이는 성분을 탐색한 결과 대부분의 조합에서는 monacolin-K 생산성이 실험 균주가 본래 가지고 있는 생산성보다 낮게 나타났지만, 8번 조합의 경우 주목할 만하게도 기존 배지에서보다 생산성이 증가하여 300 mg/L의 monacolin-K 가 생산되는 것으로 나타났다. 실험결과를 Design expert program에 적용시켜 각 성분의 main effect와 실험의 유의성을 확인하는 P값을 확인하였다(Table 4).
- 면적이 달라질 수 있다. 또한 같은 면적에서 형성한 포자를 회수하여 성장 배양에 같은 양 접종할 경우 성장 배지 부피가 적을수록 포자가 농축되므로 더 많은 수의 포자를 접종한 효과를 나타낼 것으로 생각할 수 있었다. 따라서 기존에는 5 ml의 배지를 최대로 기울여 건조한 agar slant를 이용하였는데 포자형성 배지면적을 늘리고자 포자 형성 배지의 부피를 7 ml, 10 ml로 증가시키고 성장 배지 부피는 기존의 10 ml에서 7 ml, 5 ml로 감소 시켜 각 조합에 따른 배양 형태와 monacolin-K 생산성을 확인하였다 (Fig.
- 05 이하로 유의성을 갖는 성분은 없었지만, 가장 포자형성이 잘 되는 6번 조합에서 main effect가 높은 성분들을 선택하여 새로운 포자형성 배지를 조성하였고, 이를 PB1 배지라고 명명하였다. 본 실험의 재현성을 확인하기 위하여 기존의 포자형성 배지인 PDA와 새로운 포자형성 배지인 PB1 배지에서 생산 균주의 포자형성과 성장 배양 형태, 생산성에 미치는 영향을 확인한 결과 포자형성이 100배 이상 증가한 것을 관찰하였다(Fig. 1). 기존에 baffled flask에서 수행하였던 50 ml flask 성장 배양은 많은 양의 spores를 필요로 하므로 plate에서 spore seed를 배양해야 했기 때문에 배지 성분이나 접종 시간의 많은 소모가 있었다.
- 본 연구에서는 소규모 성장 배양 방법을 확립하여 사용 배지와 배양 공간, 배양 시간의 소모를 줄이면서 균주의 mass screening이 가능하도록 하였고 이를 이용하여 고생산 균주를 선별하였으며 통계적 방법을 이용하여 균주의 생리적 특성에 맞는 생산 배지의 조성을 최적화하였다' 그 결과 균주의 배양형태를 pellet 형태로 유도할 수 있었으며 그로 인하여 생산성을 2배가량 향상시키는 고무적인 결과를 얻을 수 있었다.
- 8과 같고 ANOVA 분석결과는 Table 6에 요약하였다. 분석결과를 바탕으로 Monacolin-K 생산을 위한 최적 배지조성은 glycerol 90 g/1, malt extract 13.6 g/1, yeast extract 12.12 임, brown rice 16.87 g/1로 결정되었다. 이와 같은 배지조성을 균주 screening에 이용한 결과 기존의 배지 조성에 비해 생산성이 2배가량 향상된 결과를 확인할 수 있었고 배양형태 또한 기존 배지에서의 filamentous 형태와 달리 compact한 pellet 형태를 보이는 것을 관찰하였다(Fig.
- 하였다. 실험 결과 miniature 배양 방법의 경우 여전히 monacolin-K 생산성이 다소 불안정하기는 하지만 같은 조건에서 monacolin-K의 안정적인 형태인 lactone form 이 flask 성장배양의 경우보다 많이 생산되는 것을 확인할 수 있었고 같은 균주로 miniature 배양 방법과 flask 배양 방법을 동시에 수행하였을 때의 monacolin-K 생산성을 비교하였을 때 대부분의 균주가 배양과정에서의 오차범위를 포함하는 최대 생산성의 ±20% 내에 존재하는 것을 확인하였으므로 (Fig. 7) 성장 배양 단계까지의 miniature 배양이 가능하다고 볼 수 있었다. 성장 배양에 이어 생산 배양까지 miniature 배양 방법이 확립된다면 진정한 miniature 배양이 완성되는 것이므로 생산배양의 miniature를 위해 다양한 조건에서 실험을 수행해 보았으나 일정한 조건을 확립할 수 없었고 따라서 계속적인 배양조건의 탐색이 필요하다.
- 본 연구에서는 monacolin-K 고생산성 균주개량의 효율성을 큰 폭으로 증가시키고자, 기존의 플라스크 액상배양 방법을 소규모화시킨 tube 배양 방법을 개발함으로써 단기간에보다 많은 양의 균주를 테스트하고자 하였다. 이 차대 사산 물인 monacolin-K의 생합성은 각각의 배양단계에서의 생산 균주의 배양형태가 중요한더】, 특별히 최종 생산 배양에서 생산성 증가에 심각한 영향을 미치는 배양 형태인 직경 1 mm 이하의 pellet 모양을 유도하기 위해서는 성장배양 시에 반드시 고농도의 균사 모양이 유도되어야 하는 것으로 관찰되었다' 50 ml tube (7 ml의 조업 부피)를 이용하는 소 计모 액상 성장 배양의 경우 solid seed 배양 단계에서의 포자형성 배지의 조성을 통계적 방법을 통해 최적화하고, 또한 성장배지 성분에 brown rice 가루 20 g/L를 첨가할 때, 원하는 균사모양의 배양 형태가 유도됨을 확인할 수 있었다. 한편 7 ml의 조업 부피의 tube를 이용한 소규모 성장 배양 방법의 개발로 인해, 기존의 flask 배양을 이용할 때보다 단기간에 훨씬 많은 변이주의 생산성을 조사하게 되어 균주개량 속도를 큰 폭으로 향상시킬 수는 있었으나, 선별된 개별 균주의 monacolin-K의 생산성은 오히려 전체적으로 감소하는 경향을 보여 주었다.
- 87 g/1로 결정되었다. 이와 같은 배지조성을 균주 screening에 이용한 결과 기존의 배지 조성에 비해 생산성이 2배가량 향상된 결과를 확인할 수 있었고 배양형태 또한 기존 배지에서의 filamentous 형태와 달리 compact한 pellet 형태를 보이는 것을 관찰하였다(Fig. 9). 이는 생산 배지의 최적화를 통해 생산 배양의 배양 형태를 pellet 형태로 유도함으로써 배양액의 점도가 낮아져 배양액으로부터 세포 내로의 산소전달이 용이해짐에 따라 생산균주의 monacolin-K 생산성이 향상된 것으로 볼 수 있다.
- 따라서 본연구를 통해 확립된 소규모 성장 배양에 적합한 최적의 생산 배지 조성을 확립하고자 통계적 방법인 Plackett-Burman design을 적용하여 monacolin-K 생산성 향상에 영향을 주는 glycerol, malt extract, yeast extract, brown rice의 47)-^] 성분들을 최종 선별하였고, 또한 이들의 최적농도 결정을 위해 반응표면분석 실험을 수행하였다. 이와 같이 결정된 최적 생산 배지를 사용하여 생산 배양을 수행한 결과, monacolin- K의 생산성이 2배 이상 증가하고, 배양 형태 또한 용존산소와 영양분의 전달이 매우 용이한 직경 1mm 이하의 pellet 모양을 유지함을 확인할 수 있었다.
- 이 차대 사산 물인 monacolin-K의 생합성은 각각의 배양단계에서의 생산 균주의 배양형태가 중요한더】, 특별히 최종 생산 배양에서 생산성 증가에 심각한 영향을 미치는 배양 형태인 직경 1 mm 이하의 pellet 모양을 유도하기 위해서는 성장배양 시에 반드시 고농도의 균사 모양이 유도되어야 하는 것으로 관찰되었다' 50 ml tube (7 ml의 조업 부피)를 이용하는 소 计모 액상 성장 배양의 경우 solid seed 배양 단계에서의 포자형성 배지의 조성을 통계적 방법을 통해 최적화하고, 또한 성장배지 성분에 brown rice 가루 20 g/L를 첨가할 때, 원하는 균사모양의 배양 형태가 유도됨을 확인할 수 있었다. 한편 7 ml의 조업 부피의 tube를 이용한 소규모 성장 배양 방법의 개발로 인해, 기존의 flask 배양을 이용할 때보다 단기간에 훨씬 많은 변이주의 생산성을 조사하게 되어 균주개량 속도를 큰 폭으로 향상시킬 수는 있었으나, 선별된 개별 균주의 monacolin-K의 생산성은 오히려 전체적으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 이러한 결과는 소규모배양 방법을 확립하기 위해 새로이 개발한 포자형성 배지와 성장 배지의 조성변화로 인해 기존에 확립된 생산 배지에서는 생산균주의 monacolin-K 생합성 능력이 최대로 발휘되지 않았기 때문에 발생한 것으로 판단되었다.
후속연구
- 7) 성장 배양 단계까지의 miniature 배양이 가능하다고 볼 수 있었다. 성장 배양에 이어 생산 배양까지 miniature 배양 방법이 확립된다면 진정한 miniature 배양이 완성되는 것이므로 생산배양의 miniature를 위해 다양한 조건에서 실험을 수행해 보았으나 일정한 조건을 확립할 수 없었고 따라서 계속적인 배양조건의 탐색이 필요하다.
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