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문제 정의
- 따라서 본 연구는 식물세포배양으로부터 얻은 식물세포와 식물세포조각 (debris)에 포함되어 있는 paclitaxel을 효율적으로 대량회수하기 위한 추출물의 여과 및 농축 조건에 대한 이해와 이를 토대로 한 최적화에 그 목적이 있다.
- 유기용매를 이용한 biomass 추출 공정에서 추출 후 여과가 필수적인데 대량생산의 경우 여과에 많은 시간이 소요되므로 이를 개선하는 것이 매우 중요하다. 본 연구에서는 식물세포 배양으로부터 paclitaxel를 회수하기 위한 biomass 추출 후 추출물의 여과 과정에서 여과보조제인 규조토 사용에 의한 여과 시간 단축 효과를 조사하였다. Fig.
제안 방법
- HPLC (Waters)를 사용하여 paclitaxel의 함량을 분석하였으며 모든 분석 시료는 3개씩 취하여 분석 후 평균값으로 함량을 결정하였다. 분석에 사용한 cohmme Capcell Pak Cis UG 120 (250 nun x 4.
- 농축액의 비중을 달리하여 각각의 비중 값에서 농축을 정지하고 다음 공정인 액-액 추출을 수행하여 paclitaxel의 순도와 수율을 확인함으로써 최적의 여과액 농축 완료 시점을 결정하였다. Fig.
- 농축온도의 영향을 확인하기 위하여 bath 온도를 각각 35, 40, 45, 50℃ 조건에서 농축을 수행하였다. 또한 농축액의 온도를 확인하기 위해 thermcouple을 이용하여 농축과정 동안 농축액의 온도를 측정하였다.
- 필수적이다. 농축온도의 영향을 확인하기 위하여 rotary evaporatore bath 온도를 35~50笆로 변화시켜 농축온도의 영향을 확인하였다. 주어진 온도 범위 내에서는 온도 변화에 따른 paclitaxel의 순도와 수율은 거의 변화가 없었다(data not shown).
- 3에 나타내었다. 농축은 감압 상태 (760 mmHg)에서 진행되고 thermcouple을 사용하여 농축 도중에 농축되고 있는 용액의 온도를 측정하였다. Fig.
- 농축온도의 영향을 확인하기 위하여 bath 온도를 각각 35, 40, 45, 50℃ 조건에서 농축을 수행하였다. 또한 농축액의 온도를 확인하기 위해 thermcouple을 이용하여 농축과정 동안 농축액의 온도를 측정하였다. 농축 시 진공도는 760 mmHg 이었다.
- 회분식으로 4회 추출하였다(6). 메탄올과 biomass 혼합비는 1/1 (250 g biomass/250 mL methanol)로 하였으며 추출 시간은 1회 10분으로 하였다. Biomass 주줄 후 주줄 물을 여과보조제 (filter aid) 첨가에 의한 여과 효율 확인 실험에 사용하였다
- 액-액 추출은 농축된 메탄올 용액에 methylene chloride 을 첨가하고 (concentrated methanol:methylene chloride = 5:1, v/v), 혼합하여 정체 시켜 상 분리를 유도하였다. 상 분리로부터 paclitaxel이 포함되어 있는 하층 (methylene chloride 용액 층)을 회수하고 rotary evaporator (760 mmHg, 30℃)에서 농축/건조한 후 paclitaxel 순도와 수율을 측정하였다';
- 식물세포 배양으로부터 식물세포를 회수하기 위하여 데칸터 원심분리기 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)를 사용하였으며, 세포조각 (cell debris)은 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하여 회수하였다, 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 biomass라 하였다. 본 연구에 사용된 biomass는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.
- 식물세포배양액으로부터 회수한 biomass를 메탄올을 이용하여 회분식으로 4회 추출하였다(6). 메탄올과 biomass 혼합비는 1/1 (250 g biomass/250 mL methanol)로 하였으며 추출 시간은 1회 10분으로 하였다.
- 여과액의 농축 정도에 따른 영향을 확인하기 위하여 biomass 추출 다음 공정으로 액-액 추출 (liquid-liquid extraction)을 수행하였다(10). 액-액 추출은 농축된 메탄올 용액에 methylene chloride 을 첨가하고 (concentrated methanol:methylene chloride = 5:1, v/v), 혼합하여 정체 시켜 상 분리를 유도하였다.
- 여과가 완료되면 biomass 부분을 걷어내어 다시 추출하고 이를 3회 반복하였다. 총 4회의 추출 및 각각의 추출물 여과에 소요되는 시간을 측정하여 첨가 여과 보조제의 양에 따른 여과 효율을 확인하였다.
- 추출물에 여과보조제인 규조토 (Sigma-Aldrich, 90% diatomaceous earth)를 첨가하여 여과 효율을 확인하였다. 직경 10 cm Buchner funnel에 먼저 filter paper (Whatman No.
- 5 g diatomaceous earth/250 g biomass) 의 규조토 (Sigma-Aldrich, 90% diatomaceous earth)를 덮는다. 회분식으로 추출한 biomass 추출물을 부어 여과하고 여과에 소요되는 시간을 측정하였다. 여과가 완료되면 biomass 부분을 걷어내어 다시 추출하고 이를 3회 반복하였다.
대상 데이터
- 메탄올과 biomass 혼합비는 1/1 (250 g biomass/250 mL methanol)로 하였으며 추출 시간은 1회 10분으로 하였다. Biomass 주줄 후 주줄 물을 여과보조제 (filter aid) 첨가에 의한 여과 효율 확인 실험에 사용하였다
- 0 mL/min, 시료 주입량은 10 “L이 며, UV (227 nm) detects를 사용하였다(6). Paclitaxel 표준물질은 Sigma-Aldrich 제품 (순도 95%)을 사용하였다';
- 식물세포 배양으로부터 식물세포를 회수하기 위하여 데칸터 원심분리기 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)를 사용하였으며, 세포조각 (cell debris)은 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하여 회수하였다, 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 biomass라 하였다. 본 연구에 사용된 biomass는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.
- 본 연구에서는 Taxus c舫㎛sis의 잎으로부터 얻은 세포주 (cell line)를 이용한 세포배양액을 이용하였다(4). 식물세포 배양으로부터 식물세포를 회수하기 위하여 데칸터 원심분리기 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)를 사용하였으며, 세포조각 (cell debris)은 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하여 회수하였다, 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 biomass라 하였다.
- 결정하였다. 분석에 사용한 cohmme Capcell Pak Cis UG 120 (250 nun x 4.6 mm, Shiseido, Japan), column 온도는 40℃, 이동상은 acetonitrile/water (20-100% gradient), 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 10 “L이 며, UV (227 nm) detects를 사용하였다(6). Paclitaxel 표준물질은 Sigma-Aldrich 제품 (순도 95%)을 사용하였다'
성능/효과
- 4에 나타내었다. Bath의 온도가 증가할수록 여과액 500 mL를 농축하는데 걸리는 농축 시간은 감소하였으며 bath의 온도가 50℃인 경우는 35℃인 경우에 비해 두 배 정도의 농축 시간이 단축됨을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 식물세포 배양으로부터 paclitaxel를 회수하기 위한 biomass 추출 후 추출물의 여과 과정에서 여과보조제인 규조토 사용에 의한 여과 시간 단축 효과를 조사하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 추출에 사용된 biomass 대비 6% (w/w) 규조토를 첨가하여 여과 할 경우 여과시간 단축 효과가 가장 좋음을 알 수 있었다. 규조토 6% (w/w)을 첨가하여 여과할 경우, 1회 추출물 여과 시 4.
- 단축에 가장 효과적임을 알 수 있었다. 규조토 6% (w/w) 첨가를 통하여 1회 biomass 추출물 여과 시 4.2%, 2 회 추출물 여과 시 30.3%, 3회 추출물 여과 시 22.8%, 4회 추출물 여과 시 19.0%의 여과시간 단축 효과를 각각 얻을 수 있었다. 여과액의 농축은 paclitaxel 순도 및 수율을 고려할 때 rotary evaporator의 bath 온도를 50℃ 이하로 운전하는 것이 바람직하였으며, 이때 농축액의 온도는 증발 잠열 때문에 실제 bath의 온도보다는 상당히 낮음을 알 수 있었다.
- 2에서 보는 바와 같이 추출에 사용된 biomass 대비 6% (w/w) 규조토를 첨가하여 여과 할 경우 여과시간 단축 효과가 가장 좋음을 알 수 있었다. 규조토 6% (w/w)을 첨가하여 여과할 경우, 1회 추출물 여과 시 4.2%, 2회 추출물 여과 시 30.3%, 3회 추출물 여과 시 22.8%, 4회 추출물 여과 시 19.0%의 여과 시간 단축 효과가 각각 있음을 알 수 있었다. 첨가되는 규조토의 양이 6% (w/w) 이상에서는 규조토 양이 증가할수록 오히려 여과시간이 증가함을 알 수 있었으며 이는 규조토가 새로운 여과 저항으로 작용하기 때문으로 판단된다.
- 6에 나타내었다. 농축 및 액액 분리에 소요되는 시간은 비중 증가에 따라 증가함을 알 수 있었다. 특히, 액-액 추출 시 상 분리에 소요되는 시간의 경우 비중이 L0에서부터 급격히 증가함을 알 수 있었다.
- 여과액의 농축은 paclitaxel 순도 및 수율을 고려할 때 rotary evaporator의 bath 온도를 50℃ 이하로 운전하는 것이 바람직하였으며, 이때 농축액의 온도는 증발 잠열 때문에 실제 bath의 온도보다는 상당히 낮음을 알 수 있었다. 또한 여과액의 농축 완료 시점은 paclitaxel 순도, 수율, 농축시간, 액-액 추출에서의 상 분리 시간 등을 고려할 때 농축액의 비중이 0, 95에서 종료하는 것이 가장 적당함을 알 수 있었다.
- 식물세포배 양으로부터 paclitaxel을 효율적으로 대 량추출하기 위한 추출액의 여과 및 농축 조건을 최적화하였다, 메탄올을 이용한 biomass 추출물을 여과할 경우, biomass 대비 6% (w/w) 여과보조제인 규조토를 첨가할 경우 여과 시간 단축에 가장 효과적임을 알 수 있었다. 규조토 6% (w/w) 첨가를 통하여 1회 biomass 추출물 여과 시 4.
- 0%의 여과시간 단축 효과를 각각 얻을 수 있었다. 여과액의 농축은 paclitaxel 순도 및 수율을 고려할 때 rotary evaporator의 bath 온도를 50℃ 이하로 운전하는 것이 바람직하였으며, 이때 농축액의 온도는 증발 잠열 때문에 실제 bath의 온도보다는 상당히 낮음을 알 수 있었다. 또한 여과액의 농축 완료 시점은 paclitaxel 순도, 수율, 농축시간, 액-액 추출에서의 상 분리 시간 등을 고려할 때 농축액의 비중이 0, 95에서 종료하는 것이 가장 적당함을 알 수 있었다.
- 특히, 액-액 추출 시 상 분리에 소요되는 시간의 경우 비중이 L0에서부터 급격히 증가함을 알 수 있었다. 이러한 현상은 농축 시간 경과에 따른 농축액의 조성 변화, 즉 메탄올 함량은 감소하고 물의 함량이 상대적으로 증가함에 기인하는 것으로 판단된다' 이상의 결과로부터 추출물 여과액의 농축 완료 시점은 농축액의 비중이 0.95일 때가장 적당함을 알 수 있었다.
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