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가설 설정
- 1)Values are expressed as number of animals with the sign/number of animals examined.
- 1)Values are mean ± SE of 10 mice per each group.
- 1)Values are mean ± SE of nine to ten mice per each group.
제안 방법
- citreum GJ7의 급성독성을 시험하기 위하여 ICR 마우스에게 1회 Leu. citreum GJ7을 복강 또는 경구투여한 후 사망률, 체중의 변화, 일반 및 임상증상, 육안적 소견 등을 관찰하였다. 복강투여 후 24시간 관찰한 결과, 일부 Leu.
- 각 용량별로 1 mL 주사기를 이용하여 복강 주사하였다. 경구급성독성 시험 에서는 투여 용량은 암수 모두 최고 용량을 5, 000 mg/kg으로 하고, 등비를 500으로 하여 체중 kg당 5, 000, 2, 500, 1, 250, 625 mg을 설정하였으며, 투여용량은 경구투여는 10 g 당 0.2 mL를, 복강투여는 0.1 mL가 넘지 않게 일정한 액량으로시료물질의 각 농도가 들어가게 조제하여 투여 액량을 결정하였다. 각 군의 동물 수는 모두 암수 각각 10마리로 하였다.
- 이를 주 사용 증류수에 투여 용량을 고려하여 각 농도별로 용해하였다. 경구투여의 경우는 경구투여용 존데를 사용하였으며, 복강투여의 경우 복강 내에 1회용 멸균주사기를 이용하여 1회 주사하였다. 주사용 증류수를 대조물질로 사용하였다.
- 급성독성시험은 복강 및 경구투여 경로에 대한 예비실험 결과 얻은 용량을 설정 하고, Litchfield오+ Wilcoxon 방법 ⑺에 의거하여 LDai을 결정하였다.
- 약리 .병리시험 표준작업지침서( I)의 일반독성시험기준(6)어I 따라 마우스에서 복강 및 경구로 1회 투여하여 급성독성시험을 실시하였다.
- 복강 혹은 경구급성독성시험에 사용된 모든 시험 동물의 체중은 복강 혹은 경구투여 직전, 투여 후 1일, 3일, 7일 및 14일째에 각각 측정하였다.
- 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중(20土2 g)에 가까운 개체를 선택하여 무작위 법을 이용, 군 분리를 실시하였다. 투여용량은 미국 환경보호청 (US Environmental Protection Agency)에서 무해물질 분류 기준에 근거하여 설정하였으며, 복강 급성독성 시험에서 투여용량은 시료의 용해도 및 예비실험결과를 토대로 암수 모두 최고 용량을 2, 500 mg/kg으로 하고, 등차를 200으로 체중 kg 당 700, 900, 1, 100, 1, 300, 1, 500, 1, 700, 1, 900, 2, 100, 2, 300 및 2, 500 mg의 10군을 설정 하였다.
- 시험기간 중 사망동물에 대해서는 발견 즉시 부검을 실시하여 육안검사를 하였으며, 시료물질 투여 후 14일째까지 생존한 동물은 에테르로 마취시킨 후 방혈 치사시킨 다음 부검하여 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- 이용, 군 분리를 실시하였다. 투여용량은 미국 환경보호청 (US Environmental Protection Agency)에서 무해물질 분류 기준에 근거하여 설정하였으며, 복강 급성독성 시험에서 투여용량은 시료의 용해도 및 예비실험결과를 토대로 암수 모두 최고 용량을 2, 500 mg/kg으로 하고, 등차를 200으로 체중 kg 당 700, 900, 1, 100, 1, 300, 1, 500, 1, 700, 1, 900, 2, 100, 2, 300 및 2, 500 mg의 10군을 설정 하였다. 각 용량별로 1 mL 주사기를 이용하여 복강 주사하였다.
대상 데이터
- -00), 조도는 300 -500 Lux의 사육환경 에서 폴리카보네이트 사육 상자(220 WX270 LX130 H mm) 케이지에 5마리씩 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육기간 동안에 임상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물이 6주령이 될 때 시험을 실시하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(제일사료주식회사)를 자유 급여하였으며, 음수는 여과된 정제수를 자유 섭취시켰다.
- 1주일간의 순화사육기간 동안에 임상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물이 6주령이 될 때 시험을 실시하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(제일사료주식회사)를 자유 급여하였으며, 음수는 여과된 정제수를 자유 섭취시켰다.
- 시험구역은 조선대학교 실험동물 센터이며 , 청정구 역에서 생산된 ICR계 마우스를 온도 23±1°C, 상대습도 55±5%, 환기회수는 시간당 10~18회, 조명은 12시간 명암주기(08.-00~ 20.-00), 조도는 300 -500 Lux의 사육환경 에서 폴리카보네이트 사육 상자(220 WX270 LX130 H mm) 케이지에 5마리씩 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육기간 동안에 임상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물이 6주령이 될 때 시험을 실시하였다.
- 경구투여의 경우는 경구투여용 존데를 사용하였으며, 복강투여의 경우 복강 내에 1회용 멸균주사기를 이용하여 1회 주사하였다. 주사용 증류수를 대조물질로 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험 에서 얻은 결과는 SPSS 12.0 P/C package를 이용하여 실험군당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원 배치 분산분석 (one way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Tukey's test에 의하여 실행하였다. 본 연구에 이용된 통계적 유의성 검증은 p<0.
성능/효과
- 2)Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Tukey's test.
- 투여와는 관련이 없는 것으로 판단되었다. 5, 000 mg/kg 투여군의 경우 전 동물에서 투여직후 약간의 활동성 감소가 나타났으며, 투여 3일째 연변이나 설사와 유사한 상태로 시료가 배설되었으나, 기타 시료에 기인한 중독증상은 관찰되지 않았으며, 대조군에서도 투여 직후 설사증상이 관찰되었으나 곧 소실되었다. 또한 투여 초기에 관찰된 사료 섭취량 감소현상은 시료 혼입에 의한 기피현상으로 판단되었고, 이러한 현상은 투여후 3일째에 소실되어 정상으로 회복되었다.
- 복강 혹은 경구투여한 후 마우스의 체중변화에 있어서도 대조군과 Leu. citreum GJ7 투여군 사이 에 유의성 있는 차이는 보이지 않았으며, 생존동물의 부검결과에서도 내부 장기의 육안적 이상이 관찰되지 않았다. 따라서 Leu.
- 따라서 Leu. citreum GJ7은 본 실험의 모든 조건에서 LD50이 복강투여 시 2, 500 mg/kg, 경구투여 시 5, 000 mg/kg 이상인 저독성의 안전한 물질로 사료된다.
- Leu. citreum GJ7이 생산하는 조항균물질의 항균 spectrum을 조사한 결과, Lactobacillus 속 및 Leuconostoc 속 등의 유산균, Bacillus 속 Streptococcus 속 Micrococcus 속 Staphylococcus 속, Listeria 속 등의 그람 양성 세균에 대해서 효과가 있을 뿐만 아니라, 그람 음성세균인 Salmonella 속, Pseudomonas 속, Escherichia 속에 대해서도 강한 항균력을 나타내는 우량 종균이다(4).
- 경구급성 독성 시 험은 시료물질을 경구투여 한 후 Table 6과 같이 산발적으로 탈모(loss of fur)가 수컷 2, 500 mg/kg 투여군에서 1례, 적 색유루(reddish tear)와 연변 (soft loss)이 5, 000 mg/kg 투여군에서 각각 1례씩 관찰되었으며, 암컷은 탈모와 연변이 5, 000 mg/kg 투여군에서 각각 1례씩, 부종(edema)이 2, 500 mg/kg 투여군에서 1려】가 관찰되었으나 시험물질의 투여와는 관련이 없는 것으로 판단되었다. 5, 000 mg/kg 투여군의 경우 전 동물에서 투여직후 약간의 활동성 감소가 나타났으며, 투여 3일째 연변이나 설사와 유사한 상태로 시료가 배설되었으나, 기타 시료에 기인한 중독증상은 관찰되지 않았으며, 대조군에서도 투여 직후 설사증상이 관찰되었으나 곧 소실되었다.
- 경구급성독성시험 동물의 경우 1일째 암수 모두 사료 섭취량 감소현상이 나타났는데 이는 시험물질 혼입에 의한 기피 현상으로 판단되었고, 이러한 현상은 투여 3일째에 소실되어 정상으로 회복되었다(자료 미제시). 최고 용량을 투여한 5, 000 mg/kg 투여군에서 투여 1일째에 유의성 있는 체중감소가 관찰되었는데, 이는 시료물질 과량 경구투여로 인한 일시적 사료섭취량 감소에 기 인한 것으로 사료되었고, 이러한 현상은 곧 회복되었으며 그 이후 대조군과 시료투여군 간에 유의성 있는 체중변화는 나타나지 않았다.
- citreum GJ7은 품질이 균일하고 보존성이 향상된 김치뿐만 아니라 종균의 발효에 의한 김치 맛이 다양한 첨단 김치의 제조를 위한 김치발효시스템에 적용하기 위하여 최적 숙성기의 김치로부터 분리한 박테리오신 생산균주이다(4). 대수 증식기 후기부터 정지기에 이르는 18시간부터 24시간까지 최대 박테리오신 활성을 나타내고 pH 6.5와 0% NaCl 배지에서 균체생성 및 박테리오신 활성이 높으며, 열과 pH에 매우 안정하다고 알려졌다.
- 경구급성독성시험의 경우, Table 2에서와 같이 암수 마우스에 시료를 1회 경구투여한 후 14일 동안 관찰한 결과 시료 투여군과 대조군에서 시험기간 내 죽은 예는 없었다. 따라서 경구투여 시 본 실험의 경우 5, 000 mg/kg까지 투여하여도 사망을 관찰할 수 없어 본 연구에서는 LDso값은 적어도 5, 000 mg/kg 이상으로 산출하였다.
- 또한 암컷 마우스에서도 동일한 양을 동일한 기간 투여하였을 때 24시간 내에 1, 700 및 2, 100 mg/kg 투여군에서 각각 1례씩 죽었을 뿐 나머지는 모두 계속 생존하여 수컷 마우스의 경우와 같이 본 실험에서 투여한 최고 용량(2, 500 mg/kg)까지는 치사량(LDso)을 나타내지 않았다. 따라서 급성독성을 나타내는 양은 매우 높을 것으로 생각되며 본 시료는 복강 내 투여 시 2, 500 mg/kg 이상에서도 특이한 독성작용을 나타내지 않는 저독성 물질로 판단된다. 일반적으로 급성독성 시험의 경우 사망 예를 관찰할 수 없는 경우에는 최고 용량을 5, 000 mg/kg까지 투여 용량으로 하여 시험을 실시하나(9) 복강투여의 경우 시료의 용해도 및 예비실험결과를 토대로 최고 용량 2, 500 mg/kg까지 투여 하였다.
- 500 mg/蛇까지는 평균치사량을 나타내지 않았다. 또한 암컷 마우스에서도 동일한 양을 동일한 기간 투여하였을 때 24시간 내에 1, 700 및 2, 100 mg/kg 투여군에서 각각 1례씩 죽었을 뿐 나머지는 모두 계속 생존하여 수컷 마우스의 경우와 같이 본 실험에서 투여한 최고 용량(2, 500 mg/kg)까지는 치사량(LDso)을 나타내지 않았다. 따라서 급성독성을 나타내는 양은 매우 높을 것으로 생각되며 본 시료는 복강 내 투여 시 2, 500 mg/kg 이상에서도 특이한 독성작용을 나타내지 않는 저독성 물질로 판단된다.
- 5, 000 mg/kg 투여군의 경우 전 동물에서 투여직후 약간의 활동성 감소가 나타났으며, 투여 3일째 연변이나 설사와 유사한 상태로 시료가 배설되었으나, 기타 시료에 기인한 중독증상은 관찰되지 않았으며, 대조군에서도 투여 직후 설사증상이 관찰되었으나 곧 소실되었다. 또한 투여 초기에 관찰된 사료 섭취량 감소현상은 시료 혼입에 의한 기피현상으로 판단되었고, 이러한 현상은 투여후 3일째에 소실되어 정상으로 회복되었다.
- 복강 혹은 경구투여 당일은 투여 후 6시간까지 매 시간마다 사망동물과 일반상태를 관찰하였고, 투여 다음날부터 14일 동안 매일 1회 이상씩 일반상태의 변화, 중독 증상발현, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 주의하여 관찰하였다⑻.
- 복강급성 독성 시험의 경우투여한 후 1 일째 2, 500 mg/kg 투여군이 다른 군들에 비하여 암수동물 모두 체중이 유의차는 없었으나 약간 저하되었으며, 3일째부터는 체중 변화가 나타나지 않았다(Table 3).
- 정상으로 회복되었다(자료 미제시). 최고 용량을 투여한 5, 000 mg/kg 투여군에서 투여 1일째에 유의성 있는 체중감소가 관찰되었는데, 이는 시료물질 과량 경구투여로 인한 일시적 사료섭취량 감소에 기 인한 것으로 사료되었고, 이러한 현상은 곧 회복되었으며 그 이후 대조군과 시료투여군 간에 유의성 있는 체중변화는 나타나지 않았다. 또한 시료투여군 사이의 체중변화에서도 용량 의존성을 찾아볼 수 없었다(Table 4).
- 한편, 복강급성독성시험의 경우 복강투여한 후 사망한 개체가 있었는데 사망한 개체의 경우 시료물질 투여 2〜3시간 후 사망하였으며, 부검 시 장출혈현상이 있는 것으로 미루어 복강 내 투여도중 장을 건드려 사망한 것으로 확인되었다.
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