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문제 정의
- 따라서 본 연구는 whey 배지에 Lactobacillus acidophilus KCCM 32820과 Propionibacterium freudenreichii KCCM 31227 로 2단계 배양시 살균방법과 yeast extract7} Propionibacterium freudenreichii KCCM 31227의 생육특성에 미치는 영향 및 살균 조건에 따른 유기산 생성을 조사하였다.
제안 방법
- 6% whey broth에 L. acidophilus KCCM 32820을 1% 접종하여 35℃에서 36시간 배양 후 5N NaOH로 pH를 6.5로 조절하여 고압증기멸균 및 저온살균한 whey broth에 P. freudenreichii KCCM 31227을 1% 접종하여 85rpm의 35℃ 인큐베이터에서 72시간 배양하면서(12시간마다 pH 6.5로 조절) 12시간 단위로 유기산 양을 HPLC(LC1100 Series, Hewlett Packard Co., Ltd., USA)로 측정하였다. 채취한 시료를 12,000 rpm의 원심분리기 (Supra2IK, Hanil Co, Korea) 에서 원심분리 후 상등액을 취하여 millipore membrane filter (pore size 0.
- 6%와 12%로 제조한 whey 배지에 yeast extract를 0, 0.5, 1.0% 첨가하고, 5 N NaOH로 pH를 6.5로 조절 후 고압증기멸균 및 저온 살균하였다. 멸균한 배지를 냉각 후 L.
- 각 단계 희석액 1 ml를 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균상태에서 취하고 배지를 분주하였다. GasPAK system(CO2 environment, BBL)에 CO2를 충진 후 351의 인큐베이터에서 72시간 배양하여 나타난 균락수를 측정하여 7? freudenreichii KCCM 31227 의 생균수를 산출하였다. 총산도는 AACC(02-31)H) 방법에 따라 배양액 10mZ를 삼각플라스크에 취하여 증류수 90 ml를 혼합 후 1.
- RCM을 40 g 취하여 증류수 1,000 m/에 10분간 용해 후 cap tube에 각각 10mZ씩 분주하였다. 각각의 배지를 고압증기멸균(12 FC, 15분) 후 냉각시켜 종균 0.5ml를 접종하였다. 35℃의 인큐베이터에서 3일간 배양하여 균수가 1-2X 107 cfu/m/ 되도록 하였다.
- 0% 접종하여 35℃에서 3일간 배양하면서 6시간 단위로 생균수와 총산도를 측정하였다. 같은 방법으로 배양하면서 6시간 단위로 whey 배지의 pH를 5N NaOH로 6.5 조절하였을 때의 총산도도 측정하였다.
- 고압증기멸균 (121℃, 15분)한 6%와 12%의 whey 배지에 L. acidophilus KCCM 32820을 351에서 36시간 배양하여 yeast extract® 0, 0.5, 1.0% 첨가 후 5N NaOH로 pH를 6.5로 조절하여 고압증기 멸균한 whey 배지에 P. freudenreichii KCCM 31227을 접종 후 72시간 배양하면서 12시간 단위로 생균수를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. Fig.
- 0% 첨가하여 동일한 방법으로 재 멸균하였다. 배지를 35℃까지 냉각 후 P. freudenreichii 31820을 1.0% 접종하여 35℃에서 3일간 배양하면서 6시간 단위로 생균수와 총산도를 측정하였다. 같은 방법으로 배양하면서 6시간 단위로 whey 배지의 pH를 5N NaOH로 6.
- 45 |im)로 여과하여 분석에 사용하였다. 분석은 Aminex HPX-87H ion exclusion type(L300 mm X 7.8 mm, USA)의 column을 사용하였으며 이동상은 351에서 5mM H2SO4 용액으로 0.6m〃min의 속도로 흘려서 215nm에서 ADC (RI Detector)로 검출하였다.
- 생균수는 표준평판법10)에 의하여 미리 준비한 0.85% 생리식염수 9mZ가 들어있는 시험관에 배양한 P. freudenreichii KCCM 31820을 Im/ 취하여 10배 단계로 희석하였다. 각 단계 희석액 1 ml를 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균상태에서 취하고 배지를 분주하였다.
- 체다 치즈를 제조하고 얻은 부산물을 분무 건조하여 만든 dry sweet whey(Calpro Co., Ltd., USA)를 6%와 12%로 제조 후 고압증기멸균 및 저온살균하여 배양배지로 하였다.
대상 데이터
- L. acidophilus KCCM 32820을 MRS에 접종하여 starter culture를 제조하였다. NRS를 55 g 취하여 증류수 1,000 mH 10분간 용해 후 cap tube에 각각 10 ml 분주하였다.
- P. freudenreichii KCCM 31227을 RCM(reinforced clostridial medium, Oxoid CM 149)에 접종하여 starter cultures- 제조하였다. RCM을 40 g 취하여 증류수 1,000 m/에 10분간 용해 후 cap tube에 각각 10mZ씩 분주하였다.
- 6)를 사용하였다. P. freudenreichii KCCM 31227의 계대배양용 배지는 RCM(yeast extract 3.0g/l, beef extract 10.0 g//, peptone 10.0 g//, soluble starch 1.0 g//, glucose 5.0 입I, cysteine hydrochloride 0.5 g/l, NaCl 5.0 g/l, sodium acetate 3.0 g/I, pH 6.8)이었고 균수 측정용으로는 RCM 에 agar를 첨가하여 사용하였다.
- 한국미생물보존센터에서 분양받은 L. acidophilus KCCM 32820과 P. freudenreichii KCCM 31227 로 L. acidophilus KCCM 32820의 계대배양용 배지는 MRS (peptone 10 g/7, beef extract lOg/Z, yeast extract 5 g/l, glucose 20 잉I, diammonium-citrate 3 잉I, sodium acetate 5 g/Z, tween 80 1 ml, K2HPO4 2 g//, MgSO4 , 7H2O 0.2 잉I, MnSO4 . 7H2O 0.2 g/l, pH 6.2-6.6)를 사용하였다. P.
이론/모형
- GasPAK system(CO2 environment, BBL)에 CO2를 충진 후 351의 인큐베이터에서 72시간 배양하여 나타난 균락수를 측정하여 7? freudenreichii KCCM 31227 의 생균수를 산출하였다. 총산도는 AACC(02-31)H) 방법에 따라 배양액 10mZ를 삼각플라스크에 취하여 증류수 90 ml를 혼합 후 1.0% phenolphthalein-50% ethanol 지시약을 수적 가하여 0.1 N NaOH(F= 1.0)(DaeJung Chemical & Metals Co., Ltd., Korea) 용액으로 적정하여 소모 ml를 총산도로 하였다.
성능/효과
- 7로 가장 높은 값을 나타냈다. 6% whey 배지에서와 동일하게 총산도 값의 증가 경향은 yeast extract를 많이 첨가한 whey 배지에서 높은 값을 나타냈다. Lee 등16)은 저온살균한 6%와 12% whey 배지에 P.
- 6으로 가장 높은 값을 나타냈다. 6% whey 배지에서와 동일하게 총산도 값의 증가 경향은 yeast extract를 많이 첨가한 whey 배지에서 높은 값을 나타냈으나 증가경향은 yeast extract의 첨가량에 따라 6% whey 배지에서보다 차이가 적었다. Yeast extract 첨가량이 많을수록 총산도 값이 높은 것은 yeast extract가 P.
- 1과 같다. Fig. 1(A)에서 6% whey 배지에 yeast extract 첨가에 관계없이 접종 후의 생균수는 2.5X 105 cfii/mZ 전후 이었으나 배양시간이 경과함에 따라 yeast extract 첨가가 많을수록 높은 균수를 나타내 배양 72시간에 yeast extract를 1% 첨가하였을 때 3.2X 107 cfii/mZ로 가장 높은 생균수를 나타냈다. 배양 24시간 까지는 균수의 증가 속도가 느렸으나, 24시간부터 60시간 까지 균수가 대수적으로 증가하였다.
- 5와 같다. L. acidophilus KCCM32820을 72시간 배양 후 P. freudenreichii KCCM 31227을 접종하였을 때의 lactic acid 양은 저온살균 시 10.2 mg/m/이었던 것이 배양 24시간에 8.2 mg/m/, 72시간에 3.8mg/mZ로 감소하였고, 고압증기멸균 시에는 균 접종 후 10.5mg/ml었던 것이 배양 24시간에 9.6mg/mZ, 72시간에 4.4mg/mZ로 감소하여 배양시간에 따라 고압증기멸균보다 저온살균한 whey broth에서 lactic acid가 낮게 검출되었다. 이는 whey 배지를 고압증기 멸균시 보다 저온살균 시에 미생물의 증식이 다소 높았던 것에 기인하는 것으로 생각된다.
- Propionic acid 생성량은 저온살균시 균 접종 후 0mg/m7, 24 시간에 L2mg/m/, 72시간에 4.2mg/nW이었고, 고압증기 멸균 시에는 균 접종 후 0mg/m/, 24시간에 1.0mg/m/, 72시간에 4.0mg/mZ로 저온살균한 whey broth에서 propionic acid의 생성이다소 높았다. Jennifer 등14)은 Propionibacteriume: 이용한 propionic acid 발효에 기질로 lactose나 이ucose보다 lactate를 선호한다고 하였고, homo lactic acid bacteria인 L.
- 34mg/mZ로 저온살균한 whey broth에서와 유사 하였다. Propionic acid와 acetic acid의 생성비율은 저온 살균한 whey broth에서 72시간에 1.75 :1이었고 고압증기멸균한 whey broth에서 L70 : 1로 저온살균한 broth에서 propionic acid 의 비율이 높았다. Wughan18)-£- lactose에 P.
- 5X 107 cfu/mZS. 가장 높은 생균수를 나타내 6% whey 배지에서의 4.2X 107 cfU/mZ보다 3.2X107 cfu/m/ 만큼 높은 균수를 보여주었다. 배양 48시간 까지는 yeast extract 첨가량에 관계없이 균수의 차이가 크지 않았으나 48시간부터 균수의 차이를 나타냈다.
- 2X 107 cfu/mZS. 가장 높은 생균수를 나타냈는데 이것은 고압증기멸균하였을 때의 3.2 X 107 cfu/m/ 보다 다소 높은 결과였다. 증식경향도 고압증기 멸균한 whey 배지와 유사하여 yeast extract의 첨가량이 많을수룩높은 균수를 나타냈다.
- 또한 Fig. 1(B)에서 12% whey 배지에 yeast extract를 첨가하지 않았을 때의 균수는 균 접종 후 3.0X 105 cfb/m/이었으나 배양 시간이 경과함에 따라 6% whey 배지에서와 같이 yeast extract 첨가가 많을수록 높은 균수를 나타내 배양 72시간에 yeast extract를 1% 첨가하였을 때 6.5X 107 cfii/mZ로 가장 높은 생균 수를 나타냈다. 균의 증식곡선은 6% whey 배지에서와 동일한 경향을 나타냈으나 동일한 배양시간대에 6% whey 배지에서보다 많은 균수를.
- shermanii B・123을 접종하여 37℃에서 발효시켰을 때 발효율이 최대였다고 하여 본 실험의 결과와 일치하였다. 또한 whey 배지에서의 R freudenreichii KCCM 31227에 의한 산 생성에 관한 실험에서 whey 배지에 P. freudenreichii KCCM 31227을 단독으로 발효시킬 때보다16) L. acidophilus KCCM 32820으로 whey 배지의 lactose를 lactate로 전환 후 yeast extract# 첨가하여 P. freudenreichii KCCM 31227을 배양하였을 때 총 산도값이 높았으며, 고압증기 멸균 시 보다 저온살균 한 12% whey 배지의 총 산도 값이 가장 높았다.
- freudenreichii KCCM 31227의 증식에 영향을 주었기 때문으로 생각되는데, Wood 등")은 Propionibacterium 의증 식과 발효에 yeast extract는 영양원을 제공하는 필수물질이라고 하였다. 이상의 결과는 고압증기멸균한 6%와 12% whey 배지에 각각 P. Freudeweichii 단독으로 72시간 배양하였을 때 총 산도가 각각 2.0 및 2.5이었다고 하여15) 2단계로 배양한 본 실험에서 높게 나타났다.
- 배양 48시간 까지는 yeast extract 첨가량에 관계없이 균수의 차이가 크지 않았으나 48시간부터 균수의 차이를 나타냈다. 이상의 실험결과는 Thomas 등7)이 고압증기멸균 및 저온살균한 whey 배지에서 Propionibacterium 배양시 살균조건이 균 증식에 미치는 효과에 관한 연구에서 저온살균이 고압증기멸균보다 균의 생육에 저해효과가 적었다고 한 연구 결과와 일치하였다. Inn 등13)은 lactate 배지의 pH를 6.
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