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문제 정의
- 특히 전기융합법(electrofiision)은 세포가 전기장내에 있을 때 인접한 세포막 사이에 전자기적 에너지에 의하여 일시적인 간극이 생겨 세포막 병합과 세포 융합과정을 촉진시키는 원리를 이용하는 원형질체의 융합기술이다.(2) 따라서 본 연구는 전기 융합법을 이용하여 phytase를 생성하는 내염성 효모 균주를 개발하고자 내염성 효모인 Zygosaccharomyces rouxiie phytase를 분비 하는 비내염성 Saccharomyces cerevisiae 사이에 전기융합을 실시하였으며, 융합된 세포가 높은 염농도에서 생육하면서 phytase를 생성함을 확인하였다.
- 본 연구는 장류 식품과 같은 염장 식품 중에서 phytaseS 생성하는 내염성 효모 균주를 개발하고자 수행되었다. 여러 가지 균주 개량법이 있으나 본 연구에 사용된 세포 융합법은 과정이 비교적 간단하고, 균주 개량의 확률이 높으며, 안전하고 간편하게 이용된다는 장점이 있다.
제안 방법
- 배양은 30℃의 인큐베이터에서 150rpm으로 진탕하면서 CY 균주는 24 시간, Y-80 균주는 36시간 동안 배양하였다. Phytase를 생성하는 내염성 융합균주를 위한 선별배지는 Lambrechts 등의 방법 15)을 변형한 PSM(phytase screening medium) 배지''에 NaCl을 10% 첨가하여 사용하였다.
- 균주의 생육은 600 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, phytase 활성은 Quan 등의 방법17)을 변형하여 다음과 같이 세포외로 분비된 phytase의 활성을 측정하였다.18) 배양액을 4℃에서 15분간 원심분리 (10, 000Xg)하여 얻은 상등액 0.1 m/를 2 mM sodium phytate 용액 (pH 3.60) 0.9 m/와 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 10% TCA용액 Iml를 가하여 효소 반응을 정지시키고 발색시약(5.5% 황산에 용해한 1.5% ammonium molybdate용액과 증류수에 용해한 2.7% ferrous sulfhte용액을 4:1로 혼합하여 제조한 용액) 1.5 ml를 첨가하여 10분간 발색시킨 다음 700nm에서 흡광도를 측정하여 유리된 인산의 양을 계산하였다. 효소활성 1 unit는 1분 동안 1 μmol의 phosphate를 유리시키는 효소량으로 정의하였다.
- 2 M의 sorbitol을 사용하였으며, 첨가된 Ca2+ 이온은 세포간 응집을 방해하는 원형질체 표면의 음전하를 제거하여 융합을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.21) Electrofusion chamber0]] AC 13 V의 전류를 30초간 흘려주어 원형질체을 일직선으로 배열시킨 후 DC 200V(pulse length 15 μsec) 혹은 DC 500 V(pulse length 10 μsec)를 2회가 하여 세포융합을 실시하였다. 융합 반응액을 10% NaCl을 함유한 PSM사면배지에 도말하여 7-10일간 배양한 결과 200 V의 전압에서 생성된 융합균주는 680 cells/nV이었으며, 500V 경우는 60cells/m/의 융합균주가 생성되었다.
- YM broth에서 24-36시간 동안 배양한 각 균주의 배양액을 4P에서 6, 000Xg로 5분간 원심분리한 후 균체를 회수하고 멸균된 생리식염수와 증류수로 3회 세척한 다음 균수를 IX IO8 cells/m/ 농도로 조절하였다. 여기에 2-mercapto-ethanol을 1.
- 비교하였다. 균주의 생육은 600 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, phytase 활성은 Quan 등의 방법17)을 변형하여 다음과 같이 세포외로 분비된 phytase의 활성을 측정하였다.18) 배양액을 4℃에서 15분간 원심분리 (10, 000Xg)하여 얻은 상등액 0.
- 균주의 융합을 위하여 효소(Tunicase)로 효모의 cell wall을 제거하고 S. cerevisiae CY 균주와 Z rouxii Y-80 균주의 원형질체를 제조하였다. 균체에 2-mercaptoethanol을 처리하고 원형질체를 제조한 결과 원형질체의 형성수율이 크게 증가하였다.
- 비교 실험균주로 친주인 S. cerevisiae CY 균주와 Z rouxii Y80 균주를 동일한 조건으로 배양하여 생육도와 phytase 효소활성도를 비교하였다. 그 결과(Fig.
- 0)2로 2회 세척하고 각각의 원형질체를 1 : 1의 비율로 혼합한 혼합용액 80μl를 electrofusion chamber에 넣은 다음 AC 13 V로 pearl chain을 형성시킨 후 고전압 펄스(DC 200-500 V pulse length 10-15 jisec)를 2회 가하여 세포융합을 실시하였다. 융합 반응액을 10% NaCl을 함유한 PSM배지에 도말하고, 30℃에서 배양하여 투명환을 생성하는 융합균주를 선별하였다. 선별된 융합균주는 10% NaCl을 함유한 PSM사면배지에 옮겨 4℃에서 보관하였다.
- 융합균주를 10% NaCl 을 함유한 YM broth에 접종하고 301에서 배양하면서 균주의 생육과 phytase 활성을 측정하여 친주인 Y80 균주 및 CY 균주와 비교하였다. 균주의 생육은 600 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, phytase 활성은 Quan 등의 방법17)을 변형하여 다음과 같이 세포외로 분비된 phytase의 활성을 측정하였다.
- '6)효소 처리 후 원심분리로 균체를 회수한 후 증류수에 현탁시켜 생성된 원형질체를 용균시킨 다음 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 효소처리 전 효모 현탁액의 흡광도와 비교하여 원형질체 형성 수율을 계산하였다.
- 최종적으로 선별된 융합 균주는 10% NaCl이 첨가된 YM 액체배지 접종하고 3(FC에서 진탕 배양한 후 phytase를 생성하는 내염성 균주 여부를 확인하였다. 비교 실험균주로 친주인 S.
- 형성된 원형질체를 electrofusion 완충용액 (1.2 M sorbitol, 0.1 mM Ca-acetate, pH 6.0)2로 2회 세척하고 각각의 원형질체를 1 : 1의 비율로 혼합한 혼합용액 80μl를 electrofusion chamber에 넣은 다음 AC 13 V로 pearl chain을 형성시킨 후 고전압 펄스(DC 200-500 V pulse length 10-15 jisec)를 2회 가하여 세포융합을 실시하였다. 융합 반응액을 10% NaCl을 함유한 PSM배지에 도말하고, 30℃에서 배양하여 투명환을 생성하는 융합균주를 선별하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 미생물은 공주대학교 식품공학과에 보관 중인 효모로서 민속주에서 분리한 phytase를 분비하는 Saccharomyces cerevisiae CY 균주''와 고 주장에서 분리한 내염성의 Zygosaccharomyces rouxii Y80 균주14)를 사용하였다. 효모의 세포벽 분해효소는 Tunicase FN(Daiwa Kasei K.
- S. cerevisiae CY 균주와 Z. rouxii Y-80 균주는 YM broth(Difco, Detroit, MI) 배지에서 배양하였다. 배양은 30℃의 인큐베이터에서 150rpm으로 진탕하면서 CY 균주는 24 시간, Y-80 균주는 36시간 동안 배양하였다.
- 효모의 세포벽 분해효소는 Tunicase FN(Daiwa Kasei K. K., Tokyo, Japan)를 사용하였으며, 전기적 세포융합은 Electro Cell Manipulator ECM2001(Harvard Apparatus, Holliston, MA)을 이용하였다.
성능/효과
- 그러나 융합 균주의 phytase 활성은 48시간 배양 후 124mU/mZ까지 증가하였다. S. cerevisiae CY 균주를 무염의 YM 액체배지에서 배양한 경우 세포외로 분비된 phytase 활성이 236mU/ml까지 생산된다는 본 연구진의 이전 보고13)와 비교하면 phytase 활성은 친 주와 비교할 때 약 53% 수준이었으며, NaCl 농도가 10%라는 배지 환경을 고려하면 비교적 우수한 활성을 보이는 것으로 판단된다. 따라서 선별된 융합균주는 NaCl이 10% 첨가된 배지 조건에서 생육이 우수하며, 이와 동시에 phytase 활성도가 친주대비 약 50% 이상 생성됨을 확인하였다.
- 즉, CY 균주의 원형질체 형성수율을 높이기 위하여 2-mercaptoethan이의 처리가 필수적이었으며, 원형질체의 형성수율은 Tunicase의 사용량에 비례하여 증가하는 경향을 보였다. Y-80 균주의 원형질체 형성 수율은 TunicaseS 3U/m/ 농도로 60분간 반응시킬 때 90% 이상을 나타냈으나, CY 균주의 원형질체 형성수율은 24U/rW의 농도에서 90분간 처리할 때 약 90%의 수율을 보여(Fig. 1) Y-80 균주가 CY 균주보다 Tunicase 효소의 농도에 더 민감하게 반웅하는 것으로 판단되었다. 원형질체 형성을 위한 효과적인 Tunicase 효소의 반응시간은 60-90분으로 기존의 결과'%와 유사하였다.
- cerevisiae CY 균주와 Z rouxii Y-80 균주의 원형질체를 제조하였다. 균체에 2-mercaptoethanol을 처리하고 원형질체를 제조한 결과 원형질체의 형성수율이 크게 증가하였다. CY 균주에서 Tunicase 효소를 24U/m/의 농도로 하여 원형질체를 제조할 때 2- mercaptoethanol로 세포를 전처리하는 경우 형성수율이 48%에서 90%로 약 2배 가량 증가하였다.
- cerevisiae CY 균주와 Z rouxii Y80 균주를 동일한 조건으로 배양하여 생육도와 phytase 효소활성도를 비교하였다. 그 결과(Fig. 2) 융합균주의 생육은 Z. rouxii Y-80 균주보다 우수하였으며 stationary phase에서 25% 이상 생육이 증가하였다. 반면에 S.
- CY 균주에서 Tunicase 효소를 24U/m/의 농도로 하여 원형질체를 제조할 때 2- mercaptoethanol로 세포를 전처리하는 경우 형성수율이 48%에서 90%로 약 2배 가량 증가하였다. 그러나 Y80 균주에서는 동일 효소 반응 조건에서 2-mercaptoethanol의 처리와 무관하게 형성 수율이 95% 수준으로 측정되었다. 즉, CY 균주의 원형질체 형성수율을 높이기 위하여 2-mercaptoethan이의 처리가 필수적이었으며, 원형질체의 형성수율은 Tunicase의 사용량에 비례하여 증가하는 경향을 보였다.
- cerevisiae CY 균주를 무염의 YM 액체배지에서 배양한 경우 세포외로 분비된 phytase 활성이 236mU/ml까지 생산된다는 본 연구진의 이전 보고13)와 비교하면 phytase 활성은 친 주와 비교할 때 약 53% 수준이었으며, NaCl 농도가 10%라는 배지 환경을 고려하면 비교적 우수한 활성을 보이는 것으로 판단된다. 따라서 선별된 융합균주는 NaCl이 10% 첨가된 배지 조건에서 생육이 우수하며, 이와 동시에 phytase 활성도가 친주대비 약 50% 이상 생성됨을 확인하였다. 향후 융합균주의 안정성을 확인함과 더불어 장류 제조에 융합균주를 이용함으로써 발효 과정에서 장류의 숙성과 항영자인자인 phytat*의 변화를 추적하는 연구를 수행하고자 한다.
- 내염성 효모 균주를 개발하고자 수행되었다. 여러 가지 균주 개량법이 있으나 본 연구에 사용된 세포 융합법은 과정이 비교적 간단하고, 균주 개량의 확률이 높으며, 안전하고 간편하게 이용된다는 장점이 있다. 특히 전기융합법(electrofiision)은 세포가 전기장내에 있을 때 인접한 세포막 사이에 전자기적 에너지에 의하여 일시적인 간극이 생겨 세포막 병합과 세포 융합과정을 촉진시키는 원리를 이용하는 원형질체의 융합기술이다.
- 21) Electrofusion chamber0]] AC 13 V의 전류를 30초간 흘려주어 원형질체을 일직선으로 배열시킨 후 DC 200V(pulse length 15 μsec) 혹은 DC 500 V(pulse length 10 μsec)를 2회가 하여 세포융합을 실시하였다. 융합 반응액을 10% NaCl을 함유한 PSM사면배지에 도말하여 7-10일간 배양한 결과 200 V의 전압에서 생성된 융합균주는 680 cells/nV이었으며, 500V 경우는 60cells/m/의 융합균주가 생성되었다. 이들 융합균주들 중 PSM 평판배지(NaCl 10% 함유)중에서 투명환의 크기가 가장 큰 융합균주를 최종적으로 선별하였다.
- 융합 반응액을 10% NaCl을 함유한 PSM사면배지에 도말하여 7-10일간 배양한 결과 200 V의 전압에서 생성된 융합균주는 680 cells/nV이었으며, 500V 경우는 60cells/m/의 융합균주가 생성되었다. 이들 융합균주들 중 PSM 평판배지(NaCl 10% 함유)중에서 투명환의 크기가 가장 큰 융합균주를 최종적으로 선별하였다.
- 그러나 Y80 균주에서는 동일 효소 반응 조건에서 2-mercaptoethanol의 처리와 무관하게 형성 수율이 95% 수준으로 측정되었다. 즉, CY 균주의 원형질체 형성수율을 높이기 위하여 2-mercaptoethan이의 처리가 필수적이었으며, 원형질체의 형성수율은 Tunicase의 사용량에 비례하여 증가하는 경향을 보였다. Y-80 균주의 원형질체 형성 수율은 TunicaseS 3U/m/ 농도로 60분간 반응시킬 때 90% 이상을 나타냈으나, CY 균주의 원형질체 형성수율은 24U/rW의 농도에서 90분간 처리할 때 약 90%의 수율을 보여(Fig.
후속연구
- 따라서 선별된 융합균주는 NaCl이 10% 첨가된 배지 조건에서 생육이 우수하며, 이와 동시에 phytase 활성도가 친주대비 약 50% 이상 생성됨을 확인하였다. 향후 융합균주의 안정성을 확인함과 더불어 장류 제조에 융합균주를 이용함으로써 발효 과정에서 장류의 숙성과 항영자인자인 phytat*의 변화를 추적하는 연구를 수행하고자 한다.
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