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문제 정의
- 본 보에서는 桔梗을 여러가지 추출조건에 따라 추출한 후 각 추출물 중의 사포닌 함량을 각각 비교 분석하므로서가장 적합한 열수추출방법을 도출하고자 시도하였다. 그 결과 총 조사포닌의 함량 및 국내산 桔梗에 다량 존재하는 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 대표적인 saponin종들을 지표물질로 설정한 HPLC분석법에 준하여각 사포닌의 변동량을 측정하므로서 가장 적합한 桔梗 열수 추출조건을 확립하였다.
제안 방법
- 분석용 엑스로부터 조사포닌의 조제 - 각각의 분석용 엑 스 20 g을 증류수 200 mL에 현탁한 후, 동량의 ethylacetate 로 3회 추출하고 수층을 다시 동량의 수포화 부탄올 （"- butanol）로 3회 추출하였다. 부탄올 추출물을 감압 농축하여 무게를 달아 조사포닌 중량으로 하였다.
- HPLC 분석방법 - 이동상은 50 mM ammonium acetate solution(NH4Ac), acetonitrile, methanol을 사용하였으며, solvent A는 NH4Ac : acetonitrile : methanol = 85:10:5, solvent B는 NH4AC:acetonitrile:methanol=55:40:5로 하고, solvent B의 비율을 0%에서 15(2분), 38( 13분), 40(28분), 43(48분), 60(58분), 100%(66분)로 순차적으로 조절하였다. Column의 온도는 40℃로 유지하였고, 유속은 분당 0.
- 검출기로는 ELSD를 사용하였다. Spray chamber 의 온도는 25℃, drift chamber와 detection chamber의 온도는 각각 70℃로 유지하였으며, 질소gas를 55.5psi로 분사하여 검출하였다. 검액의 주입용량은 20rL로 하였고 각각 3 회 반복 실험하였다.
- 즉 건조한 시료 200 g을 각각 2, 3, 4 L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스1, 2 및 3을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 3 g 증류수에 넣고 추출온도를 각각 85, 100, 121℃(압력솥)로 하여 5 시간 동안 환류추출하고 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스4, 5 및 6을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 각각 3, 5, 7, 10시간 동안 환류 추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 7, 8, 9 및 10을 각각 조제하였다.
- 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 각각 3, 5, 7, 10시간 동안 환류 추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 7, 8, 9 및 10을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출하고 추출액을 여과한 후, 여액은 동결 건조하여 분석용 엑스 11을 조제하였으며, 추출 잔사에 다시 3 7의 증류수를 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출한 후 추출액을 여과하고 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 12를 조제하였다. 추출잔사를 다시 3 L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출한 후 추출액을 여과하고 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 13을 조제하였다.
- 다음으로 건조한 시료 200 g을 3 g 증류수에 넣고 추출온도를 각각 85, 100, 121℃(압력솥)로 하여 5 시간 동안 환류추출하고 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스4, 5 및 6을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 각각 3, 5, 7, 10시간 동안 환류 추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 7, 8, 9 및 10을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출하고 추출액을 여과한 후, 여액은 동결 건조하여 분석용 엑스 11을 조제하였으며, 추출 잔사에 다시 3 7의 증류수를 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출한 후 추출액을 여과하고 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스 12를 조제하였다.
- 마지막으로, 건조한 시료 200 g을 3L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 추출한 분석용 엑스 11, 추출잔사를 한 번 더 동일한 조건으로 추출한 분석용 엑스 12 및 동일한 조건으로 추출잔사를 3회째 추출한 분석용 엑스 13에 함유된 조 사포닌의 함량을 각각 비교하여 보았다. 그 결과 3회째 추출한 분석용 엑스 13의 경우에는 조사포닌의 함량 및 개별 사포닌의 함량이 극히 적었으며 다만 2회째 추출한 분석용 엑스 12는 처음 추출한 분석용 엑스 11에 비해 조 사포닌의 함량 및 개별 saponin의 함량이 각각 약 40% 수준에 달하였다.
- 분석용 엑스로부터 조사포닌의 조제 - 각각의 분석용 엑 스 20 g을 증류수 200 mL에 현탁한 후, 동량의 ethylacetate 로 3회 추출하고 수층을 다시 동량의 수포화 부탄올 （"- butanol）로 3회 추출하였다. 부탄올 추출물을 감압 농축하여 무게를 달아 조사포닌 중량으로 하였다.
- 분석용 엑스의 조제 - 추출용매로는 증류수를 사용하였고용매의 양, 추출온도, 추출시간, 추출횟수를 각각 다르게 하여 추출하였다. 즉 건조한 시료 200 g을 각각 2, 3, 4 L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스1, 2 및 3을 각각 조제하였다.
- 생약재 桔梗을 여러가지 추출조건에 따라 추출한 후 각 추출물 중의 조사포닌의 함량 및 HPLC분석법에 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 대표적인 saponin 종들의 함량을 각각 비교 분석함으로써 가장 적합한 열수 추출 방법을 도출하였다. 그 결과 추출물 중 조사포닌의 함량은 시료 대비 15배의 증류수를 사용하여 85~ 100℃의 추출온도에서 5시간 동안 추출하고 동일한 조건으로 2회 반복 추출할 경우 가장 양호하였다.
- 양, 추출온도, 추출시간, 추출횟수를 각각 다르게 하여 추출하였다. 즉 건조한 시료 200 g을 각각 2, 3, 4 L의 증류수에 넣고 100℃에서 5시간 동안 환류추출하고 추출액을 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스1, 2 및 3을 각각 조제하였다. 다음으로 건조한 시료 200 g을 3 g 증류수에 넣고 추출온도를 각각 85, 100, 121℃(압력솥)로 하여 5 시간 동안 환류추출하고 여과한 후, 여액을 동결 건조하여 분석용 엑스4, 5 및 6을 각각 조제하였다.
- 총 조사포닌 함량을 지표로 하여 가장 적합한 열수 추출조건을 찾아보고자 21년산 桔梗을 추출용매의 양, 추출온도, 추출시간, 추출반복횟수 등을 다르게 하여 총 13종의 길경분석용 엑스 (분석용 엑스 1 - 13)을 조제하고 각 분석용 엑스에 함유된 조사포닌의 양 (Table I) 및 3종의 사포닌(platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D) 의 함량을 HPLC를 이용하여 비교, 분석하였다(Fig. 2, Table U).
대상 데이터
- 6x250 mm 5 pm, 100 A, RSTech)를 사용하였다. 검출기로는 ELSD(Softa, USA)를 사용하였고, autosampler는 NS-6000(Futecs, 한국)을 사용하였다.
- 8 mL 로 하였다. 검출기로는 ELSD를 사용하였다. Spray chamber 의 온도는 25℃, drift chamber와 detection chamber의 온도는 각각 70℃로 유지하였으며, 질소gas를 55.
- 기기 및 시약 - 실험에 사용된 acetonitrile과 증류수는 HPLC용으로 J.T.Baker(NJ, USA)로부터 구입하였고, HPLC 장치는 Futecs NS-3000i system(Futecs, 한국)을 사용하였고, 컬럼은 Optimapak(4.6x250 mm 5 pm, 100 A, RSTech)를 사용하였다. 검출기로는 ELSD(Softa, USA)를 사용하였고, autosampler는 NS-6000(Futecs, 한국)을 사용하였다.
- 실험재료 - 실험에 사용한 桔梗은 (쥐장생도라지에서 재배한 21년생 도라지의 뿌리를 사용하였으며, 표품은 (주)장생도라지 생명과학연구소에 보관되어 있다. Platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 사포닌 표준품은 Kim 등14)의 방법에 따라 길경으로부터 분리 정제하여 사용하였으며, 각 사포닌의 구조는 Fig.
이론/모형
- 생명과학연구소에 보관되어 있다. Platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 사포닌 표준품은 Kim 등14)의 방법에 따라 길경으로부터 분리 정제하여 사용하였으며, 각 사포닌의 구조는 Fig. 1과 같다.
성능/효과
- 함량을 각각 비교하여 보았다. 그 결과 3회째 추출한 분석용 엑스 13의 경우에는 조사포닌의 함량 및 개별 사포닌의 함량이 극히 적었으며 다만 2회째 추출한 분석용 엑스 12는 처음 추출한 분석용 엑스 11에 비해 조 사포닌의 함량 및 개별 saponin의 함량이 각각 약 40% 수준에 달하였다. 따라서 길경의 열수 추출물 조제시 적합한 추출 반복회수는 2회 정도가 적합하다고 사료된다.
- 적합한 열수추출방법을 도출하고자 시도하였다. 그 결과 총 조사포닌의 함량 및 국내산 桔梗에 다량 존재하는 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 대표적인 saponin종들을 지표물질로 설정한 HPLC분석법에 준하여각 사포닌의 변동량을 측정하므로서 가장 적합한 桔梗 열수 추출조건을 확립하였다.
- 도출하였다. 그 결과 추출물 중 조사포닌의 함량은 시료 대비 15배의 증류수를 사용하여 85~ 100℃의 추출온도에서 5시간 동안 추출하고 동일한 조건으로 2회 반복 추출할 경우 가장 양호하였다.
- 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3 L의 증류수에 넣고 85℃와 100℃ 및 압력솥(121℃)에 넣어 5시간 추출하여 조 제한 분석용 엑스 4, 5 및 6의 조사포닌 함량을 비교하여 본 결과 분석용 엑스 4와 5는 조사포닌의 함량은 물론 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등 각각의 사포닌의 함량에서도 큰 차이가 관찰되지 아니하였다. 압력솥(121℃)에서 5시간 추출하여 조제한 분석용 엑스 6 에서는 조사포닌의 함량은 분석용 엑스 4와 분석용 엑스 5에 비하여 약간 더 증가하였으나 HPLC를 이용하여 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등 각 saponin의 함량 및 HPLC pattern을 분석한 결과 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3의 함량은 85℃ 및 100℃에서 추출한 분석용 엑스 4와 5에 비하여 현저히 적 었다.
- 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3 L의 증류수에 넣고, 100℃에서 각각3, 5, 7, 10시간씩 추출하여 조제한 분석용 엑스 7, 8, 9 및 10의 조사포닌 함량을 비교하여 본 결과 추출 시간이 길어질수록 조사포닌의 함량도 함께 증가하는 경향을 관찰할 수 있었다. 즉, 조사포닌의 함량은 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10에서 가장 높았고, 3시간 추출한 분석용 엑스 7에서 가장 낮았으며 7시간 추출한 분석용 엑스 9와 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10의 경우 조 사포닌의 함량 차이가 미미하였다.
- 한편 길경에 함유된 대표적인 saponin 3종 (platycoside E, deapioplaty- coside E, platycodin D3) 의 함량을 HPLC를 이용하여 각각 분석하여 본 결과 분석용 엑스 2와 분석용 엑스 3에 함유된 이들 3종의 사포닌 함량은 서로 큰 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 길경의 열수 추출물 조제시 추출용매의 양은 시료 대비 15배 이상이 적절함을 알 수 있었다.
- 즉, 조사포닌의 함량은 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10에서 가장 높았고, 3시간 추출한 분석용 엑스 7에서 가장 낮았으며 7시간 추출한 분석용 엑스 9와 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10의 경우 조 사포닌의 함량 차이가 미미하였다. 또, 개별 saponin의 함량 및 HPLC pattern분석한 결과, platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3는 분석용 엑스 8, 9 및 10에서 모두 비슷한 함량을 나타내었다. 반면 3시간 추출한 분석용 엑스 7은 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등이 5시간 추출한 분석용 엑스 8보다 20 % 정도 적게 검출되었다.
- 또, 개별 saponin의 함량 및 HPLC pattern분석한 결과, platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3는 분석용 엑스 8, 9 및 10에서 모두 비슷한 함량을 나타내었다. 반면 3시간 추출한 분석용 엑스 7은 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등이 5시간 추출한 분석용 엑스 8보다 20 % 정도 적게 검출되었다. 따라서, 길경의 열수 추출물 조제시 추출시간은 5시간 이상이 적합하다고 사료된다.
- 다음으로 건조한 시료 200 g을 각각 3 L의 증류수에 넣고 85℃와 100℃ 및 압력솥(121℃)에 넣어 5시간 추출하여 조 제한 분석용 엑스 4, 5 및 6의 조사포닌 함량을 비교하여 본 결과 분석용 엑스 4와 5는 조사포닌의 함량은 물론 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등 각각의 사포닌의 함량에서도 큰 차이가 관찰되지 아니하였다. 압력솥(121℃)에서 5시간 추출하여 조제한 분석용 엑스 6 에서는 조사포닌의 함량은 분석용 엑스 4와 분석용 엑스 5에 비하여 약간 더 증가하였으나 HPLC를 이용하여 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3 등 각 saponin의 함량 및 HPLC pattern을 분석한 결과 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3의 함량은 85℃ 및 100℃에서 추출한 분석용 엑스 4와 5에 비하여 현저히 적 었다. 또, 분석용 엑스 6의 경우 HPLC profile이 크게 변화 되는 것으로 보아 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등의 saponine 압력을 가하여 고온으로 추출 할 경우 쉽게 결합당의 일부분이 이탈되는 등 구조변화가 있는 것으로 예측된다.
- 관찰할 수 있었다. 즉, 조사포닌의 함량은 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10에서 가장 높았고, 3시간 추출한 분석용 엑스 7에서 가장 낮았으며 7시간 추출한 분석용 엑스 9와 10시간 동안 추출한 분석용 엑스 10의 경우 조 사포닌의 함량 차이가 미미하였다. 또, 개별 saponin의 함량 및 HPLC pattern분석한 결과, platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3는 분석용 엑스 8, 9 및 10에서 모두 비슷한 함량을 나타내었다.
- 추출용매의 양을 각각 시료의 중량대비 10, 15 및 20배로 다르게 하여 100℃에서 5시간동안 열수 추출하여 조제 한 분석용 엑스 1, 2 및 3에 함유된 조사포닌의 함량을 비교하여 본 결과 시료 대비 15배의 추출용매를 사용한 분석용 엑스 2와 시료 대비 20배의 추출용매를 사용한 분석용 엑스 3 의 경우 각각 조사포닌의 함량이 2.2 및 2.1%로 서로 큰 차이를 보이지 않은 반면 시료 대비 10배의 추출용매를 사용한 분석용 엑스 1의 경우에는 조사포닌의 함량이 1.48% 로 나타나 유의한 차이를 보였다(Table I). 한편 길경에 함유된 대표적인 saponin 3종 (platycoside E, deapioplaty- coside E, platycodin D3) 의 함량을 HPLC를 이용하여 각각 분석하여 본 결과 분석용 엑스 2와 분석용 엑스 3에 함유된 이들 3종의 사포닌 함량은 서로 큰 차이가 관찰되지 않았다.
- 48% 로 나타나 유의한 차이를 보였다(Table I). 한편 길경에 함유된 대표적인 saponin 3종 (platycoside E, deapioplaty- coside E, platycodin D3) 의 함량을 HPLC를 이용하여 각각 분석하여 본 결과 분석용 엑스 2와 분석용 엑스 3에 함유된 이들 3종의 사포닌 함량은 서로 큰 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 길경의 열수 추출물 조제시 추출용매의 양은 시료 대비 15배 이상이 적절함을 알 수 있었다.
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