The capability of the solvents for extracting the bioactive saponins from the roots of Platycodon grandiflorum (Campanulaceae) was investigated to obtain an ideal extract which contained bioactive saponins with high quality and high quantity. The content of eight representative saponins in extracts,...
The capability of the solvents for extracting the bioactive saponins from the roots of Platycodon grandiflorum (Campanulaceae) was investigated to obtain an ideal extract which contained bioactive saponins with high quality and high quantity. The content of eight representative saponins in extracts, such as deapioplatycoside E, platycoside E, platyconic acid A and platycodin D, platycodin $D_3$, platycodin $D_2$, polygalacin $D_2$, polygalacin D were analyzed simultaneousely by the modified HPLC analytical method. The validation test of the modified qualitative and quantitative analytical method employing the ELSD equipped HPLC for eight representative saponins in the roots extract of P. grandiflorum showed a good linearity, precision and accuracy. the correlation coefficient ($r^2$) values of the calbration curves for each saponins were observed to be over 0.9990. LOD and LOQ of each saponin was calculated as $0.10{\mu}g{\sim}0.40{\mu}g$ (LOD) and $0.40{\mu}g{\sim}0.80{\mu}g$ (LOQ), respectively. Recovery rates of each saponin were also calculated as over 98%, respectively. With exception of two saponins, platyconic acid A and platycodin D, The content of eight saponins in extracts was decreased proportionally to the increment of the water ratio of solvent for extraction. Consequently, as aquous alcohol was used as a solvent for extracting the saponin components from powdered roots of P. grandiflorum, the water content in the aquous alcohol was seemed to be a critical factor for extracting efficacy. The 60-80% ratio of alcohol in the aquous alcohol were deduced to be suitable and recommendable for the preparation of roots extract of P. grandiflorum which contained saponins with high quality and high quantity.
The capability of the solvents for extracting the bioactive saponins from the roots of Platycodon grandiflorum (Campanulaceae) was investigated to obtain an ideal extract which contained bioactive saponins with high quality and high quantity. The content of eight representative saponins in extracts, such as deapioplatycoside E, platycoside E, platyconic acid A and platycodin D, platycodin $D_3$, platycodin $D_2$, polygalacin $D_2$, polygalacin D were analyzed simultaneousely by the modified HPLC analytical method. The validation test of the modified qualitative and quantitative analytical method employing the ELSD equipped HPLC for eight representative saponins in the roots extract of P. grandiflorum showed a good linearity, precision and accuracy. the correlation coefficient ($r^2$) values of the calbration curves for each saponins were observed to be over 0.9990. LOD and LOQ of each saponin was calculated as $0.10{\mu}g{\sim}0.40{\mu}g$ (LOD) and $0.40{\mu}g{\sim}0.80{\mu}g$ (LOQ), respectively. Recovery rates of each saponin were also calculated as over 98%, respectively. With exception of two saponins, platyconic acid A and platycodin D, The content of eight saponins in extracts was decreased proportionally to the increment of the water ratio of solvent for extraction. Consequently, as aquous alcohol was used as a solvent for extracting the saponin components from powdered roots of P. grandiflorum, the water content in the aquous alcohol was seemed to be a critical factor for extracting efficacy. The 60-80% ratio of alcohol in the aquous alcohol were deduced to be suitable and recommendable for the preparation of roots extract of P. grandiflorum which contained saponins with high quality and high quantity.
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문제 정의
따라서 전보의 연구는 주정 등 유기용매를 추출용매로 사용하고자 할 경우 혹은 제품 중의 사포닌 함량을 보다 더 구체적으로 측정할 필요가 있을 경우에는 만족할 만한 결과를 얻을 수 없었다. 이러한 단점들을 보완하고자 본보에서는 이미 저자 등에 의해 제시된 바있는 HPLC-ELSD 분석법12)을 수정 보완하여 deapioplatycoside E, platycoside E, platycodin D3, platyconic acid A, platycodin D2, platycodin D, polygalacin D2, polygalacin D등 총 8종의 사포닌을 지표물질로 한 길경 saponin의 동시분석법을 확립하고 확립된 분석방법에 따라 methanol, ethanol 및 물을 추출용매로 사용할 경우 saponin 성분들이 가장 잘 추출될 수 있는 최적의 추출조건을 비교 연구하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
11) 그러나 전보에서는 식품제조업체에 기 설치된 생약추출물 제조라인을 감안하여 추출방법을 열수 추출법 한가지로 고정하고 추출시간 및 추출온도에 따른 최종추출물의 수득량 및 사포닌의 함량을 비교 검토하였다. 또 총 사포닌의 정량분석도 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 3종의 사포닌의 합으로 한정하여 실시하였다.
UV 검출기와 같은 spectroscopic 검출기와는 달리 Beer's law에 의한 측정농도와 검출응답량의 비례관계식이 잘 성립되지 않는 ELSD 검출기의 특성상 검량곡선의 직선 성(linearity)을 높이기 위하여 검출응답량 (응답면적)과 측정농도의 관계를 log 값으로 환산하여 8종 지표성분의 검량선 (calibration curve)을 각각 작성하였다.
검액 조제 및 검증 방법 - 길경사포닌 deapioplatycoside E, platycoside E, platycodin D3, platyconic acid A, platycodin D2, platycodin D, polygalacin D2 및 polygalacin D 을 각각 2.0 mg을 측량하여 1 ml의 증류수에 녹인 후 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml의 농도로 희석하여 측정하였으며 측정농도와 검량선을 작성하였다.
0 mg을 측량하여 1 ml의 증류수에 녹인 후 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml의 농도로 희석하여 측정하였으며 측정농도와 검량선을 작성하였다. 검출한계 (limit of detection)와 검량한계 (limit of quantification)는 signal 대 noise 比 (S/N ratio) 가 각각 3배 (LOD)와 10배 (LOQ) 되는 농도로 정하였다. 일내, 일간 정밀도 및 회수율은 한국식품의약품안전청에서 제시하는 기준13)에 따라 측정하였다.
기기 및 시약 - 실험에 사용한 methanol, acetonitrile과 증류수는 HPLC ( Burdick & Jackson, MI, USA)용으로 구입 하였고, HPLC는 Futecs NS-4000i system (Futecs, 한국) 과 NS-6000 (Futecs, 한국) autosampler, ELSD (Softa, USA) 검출기를 연결하여 사용하였다.
다음으로 추출용매 조건의 변화에 따른 8종의 지표성분 들의 추출효율을 검토하여 보았다. 우선 platycoside E 의 경우를 살펴보면 추출용매로 methanol을 사용한 경우 추출량이 0.
11) 그러나 전보에서는 식품제조업체에 기 설치된 생약추출물 제조라인을 감안하여 추출방법을 열수 추출법 한가지로 고정하고 추출시간 및 추출온도에 따른 최종추출물의 수득량 및 사포닌의 함량을 비교 검토하였다. 또 총 사포닌의 정량분석도 platycoside E, deapioplatycoside E, platycodin D3등 3종의 사포닌의 합으로 한정하여 실시하였다. 따라서 전보의 연구는 주정 등 유기용매를 추출용매로 사용하고자 할 경우 혹은 제품 중의 사포닌 함량을 보다 더 구체적으로 측정할 필요가 있을 경우에는 만족할 만한 결과를 얻을 수 없었다.
9 µg의 값을 나타내었다. 분석법의 정밀성 평가를 위해 각 지표물질들의 일 간(inter-day)정밀도와 일내(intra-day) 정밀도를 측정하였다. 일간(inter-day)정밀도는 각 지표물질의 표준용액을 각각 3가지 농도로 희석한 시료를 하루 간격으로 1일, 3일, 5일째 되는 날에 3회 반복 측정하였다.
분석법의 정밀성 평가를 위해 각 지표물질들의 일 간(inter-day)정밀도와 일내(intra-day) 정밀도를 측정하였다. 일간(inter-day)정밀도는 각 지표물질의 표준용액을 각각 3가지 농도로 희석한 시료를 하루 간격으로 1일, 3일, 5일째 되는 날에 3회 반복 측정하였다. 일내정밀도는 일간(interday)정밀도 측정시 사용한 3가지 농도의 시료를 동일한 날에 3회 반복 실험하여 측정하였으며 각 지표물질들의 일간 (inter-day) 정밀도와 일내(intra-day) 정밀도는 각각 0.
일간(inter-day)정밀도는 각 지표물질의 표준용액을 각각 3가지 농도로 희석한 시료를 하루 간격으로 1일, 3일, 5일째 되는 날에 3회 반복 측정하였다. 일내정밀도는 일간(interday)정밀도 측정시 사용한 3가지 농도의 시료를 동일한 날에 3회 반복 실험하여 측정하였으며 각 지표물질들의 일간 (inter-day) 정밀도와 일내(intra-day) 정밀도는 각각 0.1-1.1%와 0.8-1.5%의 상대표준편차 (RSD %)값을 보여주었다. 한편 분석법의 정확성을 평가를 위하여 실시한 회수율실험 (recovery test) 을 실시하여 본 결과 지표물질의 종류에 따라 약간의 편차는 있었으나 각 지표물질들은 모두 97% 이상의 회수율을 나타내었다.
즉 이미 제조한 A 용매 (50 mM ammonium acetate : acetonitrile : methanol = 75 : 20 : 5) 및 B 용매 (50 mM ammonium acetate 수용액 : acetonitrile: methanol = 69 : 26 : 5)를 HPLC running 시 단계구배 방식(stepwise gradient manner)으로 혼합하여 사용하였다. 즉 HPLC running time에 따라 혼합용매 중 B용매의 비율을 최초 15 분간은 0%, 이후 28 분까지는 48%, 33 분까지는 50%, 60분까지는 50%, 73 분까지는 60%, 88 분이후로는 B 용매로 고정하였다. HPLC running 중 column의 온도는 40℃, 유속은 분당 0.
HPLC 분석 - 이동상으로 50 mM ammonium acetate 수용액, acetonitrile 및 methanol의 혼합용액을 사용하였다. 즉 이미 제조한 A 용매 (50 mM ammonium acetate : acetonitrile : methanol = 75 : 20 : 5) 및 B 용매 (50 mM ammonium acetate 수용액 : acetonitrile: methanol = 69 : 26 : 5)를 HPLC running 시 단계구배 방식(stepwise gradient manner)으로 혼합하여 사용하였다. 즉 HPLC running time에 따라 혼합용매 중 B용매의 비율을 최초 15 분간은 0%, 이후 28 분까지는 48%, 33 분까지는 50%, 60분까지는 50%, 73 분까지는 60%, 88 분이후로는 B 용매로 고정하였다.
추출물의 조제 및 방법 - 동결 건조된 2년생 길경을 분쇄하여 10 g 씩 測量하여 11 개의 플라스크에 나누어 넣은 후, 증류수, methanol, ethanol, 20% methanol, 40% methanol, 60% methanol, 80% methanol, 20% ethanol, 40% ethanol, 60% ethanol, 80% ethanol를 100 ml 씩 채워 넣은 후 밀봉하여 암소에서 24시간 추출하였다.
대상 데이터
HPLC 분석 - 이동상으로 50 mM ammonium acetate 수용액, acetonitrile 및 methanol의 혼합용액을 사용하였다.
실험재료 - 실험에 사용한 길경은 무안, 안동 지역에서 재배한 2년생 근을 구입하여 사용하였으며, 표품은 한국화학 연구원 바이오소재연구센터에 보관되어 있다. 실험에 사용한 deapioplatycoside E, platycoside E, platycodin D3, platyconic acid A, platycodin D2, platycodin D, polygalacin D2 및 polygalacin D 등 사포닌 표준품은 Kim 등6)의 방법에 따라 길경으로부터 분리 정제하여 사용하였으며, 각 사포닌 종의 화학구조는 Fig. 1과 같다.
실험재료 - 실험에 사용한 길경은 무안, 안동 지역에서 재배한 2년생 근을 구입하여 사용하였으며, 표품은 한국화학 연구원 바이오소재연구센터에 보관되어 있다.
이론/모형
HPLC 분석법의 validation - HPLC 분석법의 validation 을 위하여 한국식품의약품안전청의 guideline에 따라 직선성, 정밀성 (precision) 및 정확성 (accuracy) 실험을 실시하였다.
검출한계 (limit of detection)와 검량한계 (limit of quantification)는 signal 대 noise 比 (S/N ratio) 가 각각 3배 (LOD)와 10배 (LOQ) 되는 농도로 정하였다. 일내, 일간 정밀도 및 회수율은 한국식품의약품안전청에서 제시하는 기준13)에 따라 측정하였다.
성능/효과
89 mg/g으로 증가함을 관찰할 수 있었다. platycodin D의 경우에 있어서도 platyconic acid A의 경우와 같이 추출용매 중 함수율이 증가함에 따라 추출량이 점차적으로 증가하는 경향이 나타났다.
결론적으로 platyconic acid A와 platycodin D 등 일부 사포닌종의 예외는 있지만 alcohol과 물을 혼합한 혼합용매를 사용하여 길경으로부터 사포닌 성분들을 추출하고자 할 경우 혼합용매 중 함수율은 20-40%가 가장 적합하리라 사료 된다.
또, 물과 함께 혼합되는 alcohol의 종류로는 큰 차이는 없지만 ethanol에 비하여 methanol 을 사용할 경우 추출효율이 조금 향상되었지만 큰 차이는 관찰되지 않았으며 추출물을 식품 및 의약품으로 직접 활용하고자 하는 상황를 감안할 경우에는 60-80% 주정이 더욱 적합하리라 사료된다.
01 mg/g으로 줄어들어 큰 편차를 나타내었다 (Table II). 또, 추출용매의 함수율이 커질수록 추출효율이 점차적으로 떨어지는 현상이 관찰되었다. 이와 같은 현상은 각 추출용매에 대한 platycoside E 의 용해도에 기인한 결과라고 사료된다.
그러나 platyconic acid A와 platycodin D 의 경우를 제외한 나머지 6종의 지표성분들은 모두 추출용매로 methanol, ethanol 등 단일용매를 사용한 경우보다는 적당량의 물을 포함하는 혼합용매를 사용한 경우 추출효율이 더 우수하였다. 또, 혼합용매 중 함수율이 증가함에 따라 추출 효율은 점차적으로 감소하는 경향이 관찰되었으며 함수율이 20-40%인 경우 즉 가장 양호한 추출효율을 나타내었다.
추출 용매의 조성에 따른 추출량 및 개별 사포닌 함량 변화 - 추출용매 조건의 변화에 따른 추출효율을 알아보기 위하여 동일 시료를 각각 증류수, methanol, ethanol, 20% methanol, 40% methanol, 60% methanol, 80% methanol, 20% ethanol, 40% ethanol, 60% ethanol 및 80% ethanol을 추출용매로 하여 24시간 상온에서 추출한 후 각 추출물의 수득 양을 비교하여 본 결과 증류수, methanol 혹은 ethanol 등 단일용매를 추출용매로 사용한 경우에 비하여 단일용매에 일정비율의 증류수를 섞은 혼합용매를 추출용매로 사용한 경우 추출물의 양이 다소 증가 하였다. 즉 methanol 및 ethanol 등 단일용매를 추출용매로 사용한 경우 추출물의 양은 각각 2.33 g 및 2.21 g으로 나타난 반면 40% methanol과 40% ethanol 용액을 추출용매로 사용한 경우 추출물의 양이 각각 4.57 g 및 3.91 g으로 증가하는 경향을 보여주었다. 그러나 혼합용매를 사용한 경우 추출물의 양은 증가하였으나 지표물질로 사용한 8 종의 saponin 성분들의 양은 추출용매로 단일용매를 사용한 경우에 비하여 큰 변화를 나타내지 못하였다.
한편, 지표물질 platyconic acid A 와 platycodin D 의 경우에는 platycoside E 의 경우와는 상반되는 현상이 관찰되었다. 즉 platyconic acid A의 경우, 추출용매로 methanol 및 ethanol을 사용한 경우 추출량이 0.07 mg/g, 0.06 mg/g에 머무른 반면 추출용매의 함수율이 증가함에 따라 platyconic acid A의 추출량도 점차적으로 증가하는 경향을 발견할 수 있었으며 추출용매로 증류수를 사용한 경우에는 platyconic acid A의 추출량이 0.89 mg/g으로 증가함을 관찰할 수 있었다. platycodin D의 경우에 있어서도 platyconic acid A의 경우와 같이 추출용매 중 함수율이 증가함에 따라 추출량이 점차적으로 증가하는 경향이 나타났다.
추출 용매의 조성에 따른 추출량 및 개별 사포닌 함량 변화 - 추출용매 조건의 변화에 따른 추출효율을 알아보기 위하여 동일 시료를 각각 증류수, methanol, ethanol, 20% methanol, 40% methanol, 60% methanol, 80% methanol, 20% ethanol, 40% ethanol, 60% ethanol 및 80% ethanol을 추출용매로 하여 24시간 상온에서 추출한 후 각 추출물의 수득 양을 비교하여 본 결과 증류수, methanol 혹은 ethanol 등 단일용매를 추출용매로 사용한 경우에 비하여 단일용매에 일정비율의 증류수를 섞은 혼합용매를 추출용매로 사용한 경우 추출물의 양이 다소 증가 하였다.
5%의 상대표준편차 (RSD %)값을 보여주었다. 한편 분석법의 정확성을 평가를 위하여 실시한 회수율실험 (recovery test) 을 실시하여 본 결과 지표물질의 종류에 따라 약간의 편차는 있었으나 각 지표물질들은 모두 97% 이상의 회수율을 나타내었다.
한편, polygalacin D2 와 polygalacin D의 경우에 있어서도 platycoside E 의 경우와 마찬가지로 추출용매 중 함수율이 증가함에 따라 추출량이 점차적으로 감소하는 경향이 관찰되었다. 그러나 platyconic acid A와 platycodin D 의 경우를 제외한 나머지 6종의 지표성분들은 모두 추출용매로 methanol, ethanol 등 단일용매를 사용한 경우보다는 적당량의 물을 포함하는 혼합용매를 사용한 경우 추출효율이 더 우수하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
길경의 효능은 무엇이 있는가?
길경의 효능으로는 항염증작용,1) 항천식효능2) 및 간손상 억제작용,3,4) 면역활성 증가,5) 항암활성6) 등 다양한 활성이 보고되어 있다.
길경의 함유성분 중 사포닌 성분은 어떤 성분으로 주목받고 있는가?
桔梗의 함유성분으로는 inulin 및 fructo-oligosaccharide 등 탄수화물이 전체 추출물의 95% 이상을 차지하고 있으며7) 이 외에 platycodigenin, polygalacic acid 등 oleanane 계 triterpene을 aglycone으로 한 20 여종의 사포닌 종들이 1-4% 정도 함유되어 있다고 알려져 있다. 또 이들 사포닌 성분들은 약리작용의 활성성분으로 주목 받고 있다.8-10)
길경이란?
길경(桔梗)은 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생식물 도라지(balloon flower, Platycodon grandiflorum)의 뿌리로서 방약합편, 수재처방 등 각종 의학고서에 기재된 한약재 중 17번째로 活用빈도수가 많은 생약재이다. 국내 도라지 소비량은 연간 4,000 여 톤에 이르고 있으면 이중 약 10%가 생약재로 사용되고 있으며 나머지 90%는 식용으로 소비되고 있는 실정이다.
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