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문제 정의
- 본 연구에서는 면역증강작용이 예전부터 알려져 있어 사용되어온 약용식물 중의 하나인 가시오가피 (Acanthopanax/cosus)로부터 항암치료시의 항암제 부작용을 경감효과에 대한 유의한 결과를 얻었다. 본 연구자의 가시오가피에 대한 최근의 연구보고로는 가시오가피의 껍질로부터 추출 및 분리정제를 통하여 분리한 단백다당류의 알코올에 의한 간 손상의 회복에 관한 연구와 bovine serum albumin (BSA) 와.
가설 설정
- 2)이 밖에는 Mensa, Disulfiram 및 ICRF-187 등이 있다.2) 그러나 이러한 화학물질은 항암제와 마찬가지로 부작용을 갖는 것이 일반적이다. Amifbstine(WR2721)의 경우는 cisplatin과 같은 독성이 강한 항암제나 방사선치료 시 종종 사용되는 독성 경감제이나 저혈압, 구토, 오한 등의 부작용을 가지고 있다.
제안 방법
- 적혈구를 제거한 후, RPMI 1640 배지로 2~3회 정도 세척하여 림프구 세포를 얻었다. 림프구 세포는 Ixl" cell/ml씩 96-well plate에 접종하였고, 양성대조군을 위한 림프구 세포 자극인자로는 phytohemagglutinin(PHA, Sigma)과 Lipopolysacharide (LPS, Sigma)을 각각 2 μg/ml과 10 μg/ml을 사용하였고, 단백 다당체는 50 ug/ml을 각각 48시간 동안 노출시켜 림프구증식 정도를 MTT assay를 이용하여 측정하였다.
- assay를 이용하여 측정하였다.18,19) Cisplatin의 투여는 체중측정에 의한 독성경감효과 측정 시와 같이 동일 농도인 6㎎/㎏으로 2회 투여하였다. 항암제를 투여 받은 마우스를 1주, 2회 및 4주째에 마우스로부터 비장세포를 분리하여 in vitro에서 비장으로부터 분리한 lymphocyte의 증식 정도와 IL-2 분비능을 측정하였다.
- 2) 최근에는 Melatonin이 adriamycin과 함께 투여될 경우, adriamycin의 부작용을 감소시킬 수 있다는 동물시험연구와 임상연구가 있으며, 이러한 물질의 개발에도 연구가 시행되고 있다.20,21) 본 연구에서는 가시오가피로부터 분리한 면역 증강효과있는 단백다당체를 이용하여 항암제 투여에 의한 부 작용을 감소시킬 수 있는 독성경감효과를 측정하였다. Cisplatin의 세포 독성에 의한 체중감량에 대하여 단백다당체 투여가 마우스의 체중 변화에 미치는 영향을 조사한 결과, cisplatin 6㎎/㎏을 3일째와 5일째에 각각 처리한 군은 시험 최종관찰 시점까지 계속적으로 체중이 감소되었으나, 단백다 당체 0.
- 항암제를 투여 받은 마우스를 1주, 2회 및 4주째에 마우스로부터 비장세포를 분리하여 in vitro에서 비장으로부터 분리한 lymphocyte의 증식 정도와 IL-2 분비능을 측정하였다. Cisplatin 6㎎/㎏의 농도로 1일과 3일째에 각각 1회 투여한 Balb/C 마우스로부터 비장을 멸균적으로 분리한 후, 비장을 PBS buffere. 세척하고 멸균 가위로 비장조직을 잘게 자른 후, RPMI 1640 배지가 담겨있는 petri dish에서 nylon mesh와 22 G 주사기를 이용하여 비장조직 안에 있는 림프구 세포를 분리하였다.
- Cytokine IL-2 측정은 ELISA kit(BioSource International, Camarillo, CA)으로 측정하였다.
- 모든 시험구에 대한 체중의 변화는 15일 동안 관찰하였으며, 체중의 측정은 2일 간격으로 측정하였다. 단백 다당체의 투여는 시험개시 일(0 일), 2일 및 4일째에 총 3회 실시하였고, cisplatin의 투여는 시험 3일째와 5일째 총 2회 실시하였다. Cisplatin의 농도는 Blab/C 마우스에 대한 LDe 값을 구하여 그 값의 1/2값으로 하였다.
- 독성경감 효과를 위한 가시오가피로부터의 단백 다당체로 하였다. 즉, 가시오가피의 껍질로부터 4℃에서 24시간 물로 추출한 후, 추출물을 여과하고 여액을 70% 농도의 ammonium sulfhte로부터 단백다당체를 침전시켰다.
- 독성경감의 척도로 체중의 변화를 보았다. 모든 시험구에 대한 체중의 변화는 15일 동안 관찰하였으며, 체중의 측정은 2일 간격으로 측정하였다.
- Cisplatin의 농도는 Blab/C 마우스에 대한 LDe 값을 구하여 그 값의 1/2값으로 하였다. 모든 시험개체는 시험 15일째에 CO2마취를 하여 모든 장기에 변화 이상 유무를 육안으로 관찰하였다. 각 시험에 사용한 동물 수는 군당 10마리로 하였다.
- 모든 시험구에 대한 체중의 변화는 15일 동안 관찰하였으며, 체중의 측정은 2일 간격으로 측정하였다. 단백 다당체의 투여는 시험개시 일(0 일), 2일 및 4일째에 총 3회 실시하였고, cisplatin의 투여는 시험 3일째와 5일째 총 2회 실시하였다.
- 분리하여 얻은 단백다당체의 총당, 단백질 정량, 구성당 및 아미노산서열은 각각 페놀-황산법, Bradford법, Bio-LC 및 N-terminal amino acid sequencing을 통하여 물질을 분석하였다. 분리한 단백다당체는 분자량 30.5 kDa, 단백질과 당의 비율은 6:4 이며 구성당은 galactose 와 glucose, 단백질의 아미노산 서열은 NH2-Val-Ala-lyr-Pro- Trp -Ala-Gly-Phe-Ala-Leu-Ser-Leu-Glx-Pro-Pro-Ala-Tyr- Gly-Tyr-X-Glu-Iie-Asn-Asp-Lys-의 서열을 갖는 단백 다당체로 확인하였다(Table 1), 15> 단백다당체의 투여경로는 정맥으로 하였으며, 투여농도는 0.2㎎/㎏과 2㎎/㎏으로 하였다.
- Cisplatin 6㎎/㎏의 농도로 1일과 3일째에 각각 1회 투여한 Balb/C 마우스로부터 비장을 멸균적으로 분리한 후, 비장을 PBS buffere. 세척하고 멸균 가위로 비장조직을 잘게 자른 후, RPMI 1640 배지가 담겨있는 petri dish에서 nylon mesh와 22 G 주사기를 이용하여 비장조직 안에 있는 림프구 세포를 분리하였다. 분리한 림프구 세포들을 원심분리 tube에 옮겨 800xg에 가겹게원심분리하여 얻은 세포 pellet를 ACK lysis buffer로 상온에서 10분간 방치하여 적혈구를 제거하였다.
- 변화를 관찰한 결과는 Table HI와 같다. 시험 종료일에 채혈하여 변화가 의심되는 혈액학적인 변화를 측정하였다. 약물을 처리하지 않은 대조군의 모든 혈액학적 수치는 정상 마우스의 수준으로 나타났다.
- 시험종료일에 마우스의 심장으로부터 채혈하여 EDTA가 들어있는 시험관(Sherwood medical) 에 취 하고 roll mixer로 온화한 후, hematology system (Bayer)을 사용하여 cisplatin 투여로 변화가 예상될 수 있는 호중구(neutrophil), 백혈구(leucocyte), 혈소판(thrombocyte), 적혈구 (erythrocyte) 및 적혈구용적 (hematocyte)의 변화를 측정하였다.'7)
- 하였다. 즉, 가시오가피의 껍질로부터 4℃에서 24시간 물로 추출한 후, 추출물을 여과하고 여액을 70% 농도의 ammonium sulfhte로부터 단백다당체를 침전시켰다. 침전시켜 얻은 조단백다당체는 sepharose S gel filtra- tion(2.
- 항암제를 투여 받은 마우스로부터 단백다당체의 독성경감효과를 비장의 면역세 포의 기능의 회복여부로 확인하였다(Table IV). Cisplatin 6 ㎎/㎏을 투여한 마우스를 1주째에 정상 마우스에 비하여 1.
- 18,19) Cisplatin의 투여는 체중측정에 의한 독성경감효과 측정 시와 같이 동일 농도인 6㎎/㎏으로 2회 투여하였다. 항암제를 투여 받은 마우스를 1주, 2회 및 4주째에 마우스로부터 비장세포를 분리하여 in vitro에서 비장으로부터 분리한 lymphocyte의 증식 정도와 IL-2 분비능을 측정하였다. Cisplatin 6㎎/㎏의 농도로 1일과 3일째에 각각 1회 투여한 Balb/C 마우스로부터 비장을 멸균적으로 분리한 후, 비장을 PBS buffere.
대상 데이터
- 5주령의 Blab/C 마우스를 중앙실험로부터 공급받아 동물사육실(온도 23±3℃, 습도 50±10%, 12시간 조명주기)에서 일반 고형사료와 물을 자유롭게 공급하면서 2 주간 적응시킨 후 실험에 이용하였다.
- 모든 시험개체는 시험 15일째에 CO2마취를 하여 모든 장기에 변화 이상 유무를 육안으로 관찰하였다. 각 시험에 사용한 동물 수는 군당 10마리로 하였다.
이론/모형
- 5x90 cm, FPLC system Pharmacia Biotech, Sweden)을 이용하여 분리하였다. 분리하여 얻은 단백다당체의 총당, 단백질 정량, 구성당 및 아미노산서열은 각각 페놀-황산법, Bradford법, Bio-LC 및 N-terminal amino acid sequencing을 통하여 물질을 분석하였다. 분리한 단백다당체는 분자량 30.
- 비장으로부터의 림프구증식 효과는 MIT assay를 이용하여 측정하였다.18,19) Cisplatin의 투여는 체중측정에 의한 독성경감효과 측정 시와 같이 동일 농도인 6㎎/㎏으로 2회 투여하였다.
성능/효과
- 2mgkg 및 2 ㎎/㎏ 처리군의 혈액학적 수치 역시 대조군과 차이를 보이지 못하였다. Cisplatin 6m0kg 처리군의 호중구의 수치는 0.06±0.01로 대조군 및 단백다당체 단독 투여군의 수치에 비하여 50% 정도 감소가 되었고, 백혈구 수치는 0.57±0.09로 대조군 및 단백다당체 단독 투여군 대비 47% 수준을 나타내었다. 적혈구의 경우는 10.
- Cisplatin 투여에 의한 체중 감소는 투여 5일째부터 관찰되기 시작하였으며, 단백다당체만 처리한 시험군에 대비하여 약 1 g 이상의 체중 감소를 나타내었다. Cisplatin 단독 처리군은 시험 마지막 일인 15일째에 시험시작일의 체중 100% 대비 64% 의 체중을 나타내어 36% 정도의 체중 감소율을 나타내었다.
- 따라서 단백 다당체의 투여에 의한 시험군의 개체의 사망은 없어 독성 및 부작용은 없는 것으로 판단되며, 오히려 cisplatin 투여에 의한 체중감소에 대한 회복능력을 가지고 있는 것으로 나타났다. Cisplatin 단독 투여에 의한 개체 사망 수는 투여 완료 시점인 7일째에 2마리, 11일째에 1마리가 사망하여 30%의 사망률을 나타내었다. Cisplatin과 단백다당체 0.
- 이는 L2생산에도 영향을 주어 정상 마우스에 비하여 6배 정도 IL-2생산량이 감소되었다. Cisplatin 단독투여에 대한 림프구의 감소 및 IL-2생산량의 감소는 4주 동안 서서히 증가하기는 하였으나 정상마우스 정도로 회복되지는 않았다. 단백다당체 처리군의 경우, 1주째에서는 단백다당체를 처리 하지 않은 구에 비하여 림프구세포의 증식은 25%, IL-2생산 량은 28%정도 증가하였고, 2주째에는 림프구세포 증식 26%, L2생산량 38%, 4주째에는 각각 25%와 48%로 단백다당체 의 처리에 의한 림프구 세포의 증식율은 일정하였고, IL-2의 생산은 시간이 증가함에 따라서 약간씩 증가추세를 보여 4주 째에는 1주째 대비 약 20% 정도가 증가되었다.
- 9g 으로 시험 개시일 대비 32%의 체중증가율을 나타내었다. Cisplatin 처리에 대한 단백 다당체 2㎎/㎏ 처리군의 경우는 cisplatin이 투여되는 시점인 3 일째와 5일째에도 시험 개시일의 체중에 비하여 감소되는경향은 나타내지 않았으며, 7일째부터는 서서히 체중 증가가 회복되어 시험 종료일 인 15일째에는 32.9±1.3 g으로 시험 개시일 대비 42%의 체중증가 회복율을 나타내었다. 이에 반하여 단백다당체 0.
- Cisplatin 처리에 대한 단백다당체 0.2 ㎎/㎏ 처리군의 경우는 cisplatin 투여 시점부터 체중감소를 보였으나, 시험 9 일째부터 체중 감소에 대한 회복능력을 나타내었다. 즉, 시험 9일째의 체중은 26.
- 20,21) 본 연구에서는 가시오가피로부터 분리한 면역 증강효과있는 단백다당체를 이용하여 항암제 투여에 의한 부 작용을 감소시킬 수 있는 독성경감효과를 측정하였다. Cisplatin의 세포 독성에 의한 체중감량에 대하여 단백다당체 투여가 마우스의 체중 변화에 미치는 영향을 조사한 결과, cisplatin 6㎎/㎏을 3일째와 5일째에 각각 처리한 군은 시험 최종관찰 시점까지 계속적으로 체중이 감소되었으나, 단백다 당체 0.2 ㎎/㎏과 2 ㎎/㎏ 단독 투여군은 마우스 개체 모두 이상적인 체중 증가를 나타내었고, 개체의 사망 역시 없어 항암제의 세포독성 및 면역계에 심각한 부작용은 없는 것으로 판단되었다. Cisplatin의 투여는 심각한 골수 부작용을 초래하여 혈액세포의 구성성분이나 비율에 영향을 준다.
- Cisplatin 단독투여에 대한 림프구의 감소 및 IL-2생산량의 감소는 4주 동안 서서히 증가하기는 하였으나 정상마우스 정도로 회복되지는 않았다. 단백다당체 처리군의 경우, 1주째에서는 단백다당체를 처리 하지 않은 구에 비하여 림프구세포의 증식은 25%, IL-2생산 량은 28%정도 증가하였고, 2주째에는 림프구세포 증식 26%, L2생산량 38%, 4주째에는 각각 25%와 48%로 단백다당체 의 처리에 의한 림프구 세포의 증식율은 일정하였고, IL-2의 생산은 시간이 증가함에 따라서 약간씩 증가추세를 보여 4주 째에는 1주째 대비 약 20% 정도가 증가되었다. 이러한 결과는 항암제 투여에 의한 독성의 회복에 있어서 단백다당체의 면역증강에 의하여 많은 영향을 준다고 할 수 있겠다.
- 3%로 87% 수준을 나타내었다. 따라서 cisplatin 처리로 인하여 호중구 및 백혈구를 비롯하여 전 반적으로 혈액학적 수치가 정상 마우스군에 비하여 회복되지 않는 것으로 판단되었다.
- 2 ㎎/㎏과 2 ㎎/㎏ 단독 투여군은 마우스 개체 모두 이상적인 체중 증가를 나타내었으며, 투여 농도에 따른 차이도 발생하지 않았다. 따라서 단백 다당체의 투여에 의한 시험군의 개체의 사망은 없어 독성 및 부작용은 없는 것으로 판단되며, 오히려 cisplatin 투여에 의한 체중감소에 대한 회복능력을 가지고 있는 것으로 나타났다. Cisplatin 단독 투여에 의한 개체 사망 수는 투여 완료 시점인 7일째에 2마리, 11일째에 1마리가 사망하여 30%의 사망률을 나타내었다.
- 항암 면역계의 중요한 기관 중의 하나는 비장이라 할 수 있다. 본 연구에서 cisplatin의 투여는 비장의 면역세포의 생존율과 IL-2의 생산에 영향을 주는 것으로 나타났다. 정상 마우스에 비하여 cisplatin 투여군은 1주째에 면역세포 및 IL-2생산량이 많이 감소하였으나 시간이 지남에 따라서 회복되는 것으로 나타나 생존율과 IL-2의 생산량이 급격하지는 않으나 서서히 증가하는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 단백다당체가 cisplatin 투여에 의한 체중감소 는 2주 정도(15일)만에 정상 마우스와 동일한 수준으로 회 복능력을 보여 주었으며, 혈액세포의 변화에 있어서도 비슷한 양상을 보여 주어 단백다당체의 투여에 의한 cisplatin의 독성경감효과는 2주정도면 회복할 수 있는 효능을 나타내었다.
- 시험 종료일에 채혈하여 변화가 의심되는 혈액학적인 변화를 측정하였다. 약물을 처리하지 않은 대조군의 모든 혈액학적 수치는 정상 마우스의 수준으로 나타났다. 단백다당체 0.
- 본 연구에서 cisplatin의 투여는 비장의 면역세포의 생존율과 IL-2의 생산에 영향을 주는 것으로 나타났다. 정상 마우스에 비하여 cisplatin 투여군은 1주째에 면역세포 및 IL-2생산량이 많이 감소하였으나 시간이 지남에 따라서 회복되는 것으로 나타나 생존율과 IL-2의 생산량이 급격하지는 않으나 서서히 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 증가에 단백 다당체의 투여는 급격한 상승효과를 나타내어 4주째에는 정상 마우스에 가까운 면역세포 생존율과 IL-2 생산량을 나타내었다.
- 2 ㎎/㎏ 처리군의 경우는 cisplatin 투여 시점부터 체중감소를 보였으나, 시험 9 일째부터 체중 감소에 대한 회복능력을 나타내었다. 즉, 시험 9일째의 체중은 26.7±1.1 g으로 투여 완료 시점인 7일째에 비하여 19%의 체중 증가율을 나타내었고, 시험 종료일인 15일째에는 29.7±0.9g 으로 시험 개시일 대비 32%의 체중증가율을 나타내었다. Cisplatin 처리에 대한 단백 다당체 2㎎/㎏ 처리군의 경우는 cisplatin이 투여되는 시점인 3 일째와 5일째에도 시험 개시일의 체중에 비하여 감소되는경향은 나타내지 않았으며, 7일째부터는 서서히 체중 증가가 회복되어 시험 종료일 인 15일째에는 32.
후속연구
- 향후, 추가적으로는 골수에 미치는 영향에 대한 조사와 함께 병용투여 할 때 cisplatin과 같은 독성을 갖는 항암제의 기능에 방해를 하는가에 대한 조사도 이루어져야 할 것이다.
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