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문제 정의
- 최근의 면역능에 관한 연구로 느타리버섯 물 추출물 50~500 ug/mL에서 활성효과가 높게 나타난 보고가 있다(Ryu HS 2014). 따라서 본 연구는 식품으로 널리 이용 되고 있는 가시오가피를 이용하여 농도를 달리한 가시오가 피 물 추출물이 마우스 비장세포에 직접 작용하여 면역세포 를 증식시키는 활성이 있는지 검색하고, 활성화된 복강 대식 세포에서 분비되는 대표적인 사이토카인(IL-2, IFN-y, TNFa) 생성량을 측정하여 면역세포의 활성화에 관여함을 조사 함으로서 면역 증진 효과를 갖는 식품소재로서의 가시오가 피의 면역 증진 식품으로서의 활용가능성을 확인하고자 하 였다.
제안 방법
- 세 포수를 1x106 cell/mL의 농도로 희석하여 24-well plate에 분주 한 다음 37C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 2시간 경과 후 각 well의 상층액을 걷어내어 비부착 세포(non-adherent cells) 는 제거하고 부착 세포(adherent cells)만을 이용하였다 사이 토카인(IL-2, IFN-y, TNF-a) 분비량의 측정은 비부착성 세 포는 제거하고, 부착성 마우스 복강 대식세포에 10%의 불활 성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 900 yL 넣고, 최종 농도가 0 yg/mL와 1,000 yg/mL가 되도록 하여 가시오가피 추 출물을 각 100 yL씩 분주한 다음, 37C, 5% C6 인큐베이터 (Sanyo, St. Louis, MO, USA)에서 48시간 배양 과정을 진행하 였다. 48시간 후 배양액을 분리하여 IL-2, IFN-y, TNF-a 의 분비량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이 용하여 분비량을 측정하였다.
- Louis, MO, USA)에서 48시간 배양 과정을 진행하 였다. 48시간 후 배양액을 분리하여 IL-2, IFN-y, TNF-a 의 분비량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이 용하여 분비량을 측정하였다.
- 가시오가피 물 추출물의 첨가가 비장세포 증식능에 미치는 영향에 대한 검색 결과는 Table 1과 같다. 가시오가피 물 추출물 0, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 ug/mL의 농도로 첨가 하여 배양하였고, 음의 대조군(negative control)으로는 가시오 가피 시료의 추출물 대신 배양액(10% FBS-RPMI 1640)을 첨 가하고, 양의 대조군(positive control)으로는 ConA(5 ug/mL)를 첨가하여 배양하였다. ConA를 첨가하여 배양한 경우, 가시오 가피 물 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 세포 증식능 이 각각 6.
- TNF-a, IL-1, IL-2, IL-6과 같은 여러 가지 사이토카인과 nitric oxide(NO) 등이 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 물 질로 알려져 왔으며(Kim 등 2004), 그 중에서도 특히, IFN- Y, IL-2, TNF-a 는 세포 간 신호전달을 수행함으로써 초기염증 반응에서 면역작용에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 왔 다(Barnes 등 1995; Ryu HS 2010). 본 실험에서는 IL-2, IFNY, TNF-a 의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양의 대조군 LPS(15 mg/mL)로 자극한 대식세포로부터 분비된 사이토카 인을 측정함으로써 대식세포의 활성화에 대한 지표 기준으 로 삼았다.
- 1에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대 조군으로 마크로파지에 LPS를 처리하여 배양한 후 상층액을 사용하였다. IL-2 분비량에 있어 두 가지의 양의 대조군과 음 의 대조10 ug/mL)을 비교하였을 때 100~500 ug/mL 농도에 서 유의적인 차이를 나타내었다 마크로파지 세포에서 음의 대 조군에서 12.
- 3에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대조군 으로 마그로파지에 LPS를 처리한 후 배양액의 상층액을 이 용하였다. 음의 대조군은 490.
- 1에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대 조군으로 마크로파지에 LPS를 처리하여 배양한 후 상층액을 사용하였다. IL-2 분비량에 있어 두 가지의 양의 대조군과 음 의 대조10 ug/mL)을 비교하였을 때 100~500 ug/mL 농도에 서 유의적인 차이를 나타내었다 마크로파지 세포에서 음의 대 조군에서 12.
- 2)에 현탁시켜 5분간 처리한 후 적혈구를 제거하 고, RPMI 1640 용액으로 2회 원심 세척하였다. 이러한 과정 을 통해 모아진 대식세포를 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액에 분산시킨 다음, trypan blue solution으로 염 색한 후 hemacytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 세 포수를 1x106 cell/mL의 농도로 희석하여 24-well plate에 분주 한 다음 37C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 2)와 증 류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈 구를 제거한 비장세포는 RPMI 1640 medium 용액에 분산시 켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemacytometer를 이용 하여 세포수를 측정하였다 세포농도 5.0x106 cell/mL로 분산 시킨 후 96-well plate에 90 yL씩 분주하고, 각 군당 mitogen으 로 ConA(5 yg/mL), LPS(15 yg/mL)를 10 yL씩 분주하고, 대조 군에는 배지를 동량으로 분주한 다음 세포 증식능 측정에 이 용하였다 마우스 비장세포의 증식능은 다음의 공식으로 계 산하였다.
대상 데이터
- 마우스는 경추 탈골법 방법으로 처리한 후 복부를 절개한 다음, RPMI 1640 용액으로 복강을 흔들어 마사지한 후 세척 액을 취하여 멸균 시험관에 수집하였다. 세척액을 4C, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 침전시킨 다음 cell pellet을 얻었다.
- 본 실험에 사용된 가시오가피는 건조된 줄기부분을 경동시장에서 구입하여 분쇄 후 시료로 사용하였다 가시오가피를 증류수로 환류 냉각시키면서 80 °C 수욕상에서 3시간씩 3 회 반복 추출한 후, 감압 농축하여 가시오가피 물 추출물을 얻었다. 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 구입하여 물과 고형 사료를 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다 실험에 사용된 동물실 온도는 22±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle) 는 12 시간 단위로 조절하여 관리하였다.
- 반복 추출한 후, 감압 농축하여 가시오가피 물 추출물을 얻었다. 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 구입하여 물과 고형 사료를 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다 실험에 사용된 동물실 온도는 22±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle) 는 12 시간 단위로 조절하여 관리하였다.
- 본 연구에는 배지로 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품의 RPMI medium 1640를 사용하였고, fetal bovine serum (FBS), thioglycollate, sodium bicarbonate, 3-(4, 5-dimethylth-iazol- 2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), DMSO(di-methyl sulfide), lipopolysaccharide(LPS), ammonium chloride 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품이 사용되었다.
데이터처리
- a~c Means with different superscript (a, b, c) within a column significantly different from each other (p<0.05) as determined by Duncan's multiple range test (a<b<c).
- 본 연구 결과의 자료는 통계 프로그램 인 SAS package(ver. 12.0)를 이용하여 평균 및 표준편차를 계산하였고, 군간의 비 교에서 각각의 요인은 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 을 사용하였으며, Duncan's multiple range test로 p=0.05 수준 에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 이러한 결과에 의하면 가시오가피 물 추출물은 면역세포에 하나인 마크로파지를 활성화시켜 초기 염증반응을 유도할 것으로 사료된다. 따라서 연구결과를 종합해보면 가시오가피 물 추출물을 첨가한 50~1, 000 ug/mL 농도 모두에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었고, 따라서 가시오가피 물 추출물이 외부의 항원에 민감하게 반응하여 면역세포의 활성을 자극할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 양의 대조군으로 마크로파지에 LPS 를 처리하여 배양한 후 상층 액을 사용하였다. 마크로파지 세포에서 분비된 IFN-y 분비량은 음의 대조군에서 22.44±5.28 pg/mL, 양의 대조군 LPS 에서 82.25±10.67 pg/mL로 유의 적으로 양의 대조군에서 높은 IFN- Y 분비량이 나타났다. 가시오가피 물 추출물 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1, 000 ug/mL 첨가 농도에서 각각 15.
- 05). 이러한 결과에 의하면 가시오가피 물 추출물은 면역세포에 하나인 마크로파지를 활성화시켜 초기 염증반응을 유도할 것으로 사료된다. 따라서 연구결과를 종합해보면 가시오가피 물 추출물을 첨가한 50~1, 000 ug/mL 농도 모두에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었고, 따라서 가시오가피 물 추출물이 외부의 항원에 민감하게 반응하여 면역세포의 활성을 자극할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 78 pg/mL의 IFN- y 분비량이 나타나 유의성은 보이지 않았다. IFN- y 분비량의 실험에서는 모든 시료가 음성대조군보다 낮게 관찰되어 추가적인 실험 등을 통한 고찰이 필요할 것으로 사료된다.
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