Our research objective was to examine the in vitro biological activity of deer antler(Nogyong in Korean) extract, including the antioxidative, nitrite scavenging, and tyrosinase inhibitory effects, as well as the antithrombotic, and angiotensin I converting enzyme(ACE) inhibitory activities. The car...
Our research objective was to examine the in vitro biological activity of deer antler(Nogyong in Korean) extract, including the antioxidative, nitrite scavenging, and tyrosinase inhibitory effects, as well as the antithrombotic, and angiotensin I converting enzyme(ACE) inhibitory activities. The carbohydrate, protein, fat, and mineral contents of the deer antler were 7.6%, 65.3%, 3.2% and 23.9%, respectively. The electron donating ability(EDA) by the reduction of 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) was 67.1%, and the inhibition rate of lipid peroxidation by the thiocyanate method using linoleic acid was 92.1% in 100 mg/ml of extract. The nitrite scavenging effects were pH dependent, and were highest at pH 1.2 and lowest at pH 6.0. The sample inhibition rate against tyrosinase was above 64.0%. The platelet aggregation induced by ADP(adenosine-5'diphosphate) was inhibited up to 51.7%, and the inhibitory effect was dependent on the sample concentration. Lastly, the inhibition rate of ACE was 47.5% in 100 mg/ml of deer antler extract.
Our research objective was to examine the in vitro biological activity of deer antler(Nogyong in Korean) extract, including the antioxidative, nitrite scavenging, and tyrosinase inhibitory effects, as well as the antithrombotic, and angiotensin I converting enzyme(ACE) inhibitory activities. The carbohydrate, protein, fat, and mineral contents of the deer antler were 7.6%, 65.3%, 3.2% and 23.9%, respectively. The electron donating ability(EDA) by the reduction of 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) was 67.1%, and the inhibition rate of lipid peroxidation by the thiocyanate method using linoleic acid was 92.1% in 100 mg/ml of extract. The nitrite scavenging effects were pH dependent, and were highest at pH 1.2 and lowest at pH 6.0. The sample inhibition rate against tyrosinase was above 64.0%. The platelet aggregation induced by ADP(adenosine-5'diphosphate) was inhibited up to 51.7%, and the inhibitory effect was dependent on the sample concentration. Lastly, the inhibition rate of ACE was 47.5% in 100 mg/ml of deer antler extract.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 한약제인 순수한 녹용의 생체 내 생리 활성 효과에 대한 기초 자료를 얻어 객관적인 평가 자료를 마련하고자 in 에 의한 전자 공여 작용과 지질 과산화 억제 효과의 항산화 활성, 아질산염 소거 효과, tyrosinase 저해효과, 혈소판 응집 억제 활성 및 ACE 저해 활성 등을 측정하여 분석하였다.
제안 방법
ACE(angiotensin I converting enzyme) 저해 활성 측정은 Chu- shman과 의 방법으로 NaCl 0.3 M을 함유한 0.1 M sodium borate buffer(pH 83)에 녹인 기 질 Hip-His-Leu(2.14 mg/㎖) 200 ㎕에 ACE 저해용액 75 ㎕를 첨가한 후, 37℃에서 5분간 preincubation시켰다. 여기에 증류수에 녹인 ACE 조효소액 (0.
Gray와 Dugan의 방법31)에 따라 1 mM NaNOa 용액 1 mE에 일정 농도의 메탄올 추출물 시료(2 ㎖)를 첨가하고, 0.1N HC1 (pH 1.2) 과 0.2 M 구연산 완충액(pH 3.0, 4.2 및 6.0)를 사용하여 반응 용액의 pH를 1.2, 3.0, 4.2, 6.0으로 조정한 다음 최종부피를 10 ㎖로 하였다. 이 혼합 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액을 1 씩 취하여 2% 초산 용액 5 Griess시 약 0.
2 U/mQ 20 ㎕를 가하여 37 ℃ 에서 30분간 반응시킨 후 1 N HC1 250 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 다시 여기에 ethylacetate 2 ㎖를 가하여 15초간 교반하고 원심 분리시킨 상징 액 1 ㎖를 가하여 용해시킨 다음 228 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 ACE 저해율을 계산하였다.
시중에서 구입하여 사용하였다. 세절된 녹용을 analytical mill(A10 IKA, Selangor, Malaysia) 로 갈아서 10 mesh를 통과하게 한 후 round flask에 넣고 증류수 3, 000 ㎖를 넣은 후 약 4시간 열탕하고 여과한 여액을 rotaiy evaporator로 감압 농축한 후 동결 건조하여 녹용 추출물을 얻었다.
전자 공여 작용(electron donating ability, EDA)은 Kang 등의 방법29)을 변형한 실험 방법으로 각 녹용 추출물 0.2 ㎖ 4xl0-4 M DPPH 용액(2, 2, -diphenyl-l-piciylhydrazyl)을 첨가하여 vortex mixer로 10초 동안 진탕하고 10분 후 분광 광도계 (UV/VIS spectrophotometer, Jasco, Japan)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여 효과는 Lee와 Chung27)의 연구에 나타난 바와 같이 첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하였다.
2 ㎖ 4xl0-4 M DPPH 용액(2, 2, -diphenyl-l-piciylhydrazyl)을 첨가하여 vortex mixer로 10초 동안 진탕하고 10분 후 분광 광도계 (UV/VIS spectrophotometer, Jasco, Japan)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여 효과는 Lee와 Chung27)의 연구에 나타난 바와 같이 첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하였다.
전통 한약탕제의 원료로 사용되는 녹용의 추출물에 대하여 in vitro에 의한 전자 공여 작용과 지질 과산화 억제 효과의 항산화 활성, 아질산염 소거 효과, tyrosinase 저해 효과, 혈소판 응집 억제 활성 및 ACE 저해 작용 등을 측정하였다. 본 실험에서 사용한 녹용의 탄수화물, 단백질, 조지방 및 조회분 함량은 각각 7.
2 ㎖를 가하여 40℃에서 은박 포장한 후 incubation하면서 일정 간격으로 측정하였다. 측정 방법은 혼합 용액에서 0.1 ㎖를 취하여 시험관에 넣고 70% 에탄올 3 ㎖와 ammonium thiocyanate 용액 0.1 ㎖ 염화철분 용액 0.1 ㎖를 혼합한 다음 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백은 semi micro Kjeldahl 법, 조회분은 550℃ 회화법으로 정 량하였다. 탄수화물은 조지방과 조단백, 조회분을 뺀 값으로 하였다.
항산화 활성의 효과를 측정하기 위하여 녹용 추출물의 2, 10, 20, 100 mg/㎖ 농도별에 따른 DPPH(2, 2'-diphenyl-l-pic- tylhydrazyl)에 대한 전자 공여 효과를 측정하였다. 그 결과 본시료를 100 mg/㎖ 조제하여 활성을 측정한 경우 가장 높은 67.
0)을 조제하여 이들을 stock solution 으로 사용하였다. 혼합 용액은 각 시료 용액 0.2 <6.0 mg/㎖ 또는 0.6 mg/㎖)에 리놀레산 0.2 ㎖를 시험관에 넣고 혼합한 후 인산 완충액 0.4 ㎖와 증류수 0.2 ㎖를 가하여 40℃에서 은박 포장한 후 incubation하면서 일정 간격으로 측정하였다. 측정 방법은 혼합 용액에서 0.
0)에 용해하여 조효소액으로 하였다. 효소 활성의 측정은 10 mM catechol 용액 2.8 에 tyrosinase 조효소액 0.2 ㎖, 추출액 0.5 m2를 가하고 분광광도계로 420 nm에서 흡광도 변화를 측정하였으며, 효소 1 ㎖가 1분간에 0.001의 흡광도를 변화시키는 것을 효소 1 unit로 나타내었다. Tyrosinase에 대한 각 추출물의 효소 활성 저해 효과는 추출물을 넣지 않은 무첨가구와 활성 unit 대비를 저해 백분율로 나타내었다.
대상 데이터
녹용(antler, Cornu cervi parvum)은 뉴질랜드산 녹용 상대를 시중에서 구입하여 사용하였다. 세절된 녹용을 analytical mill(A10 IKA, Selangor, Malaysia) 로 갈아서 10 mesh를 통과하게 한 후 round flask에 넣고 증류수 3, 000 ㎖를 넣은 후 약 4시간 열탕하고 여과한 여액을 rotaiy evaporator로 감압 농축한 후 동결 건조하여 녹용 추출물을 얻었다.
이론/모형
ADP(adenosine-5*-diphosphate) 유도 혈소판 웅집 억제 활성은 Shon 등의 방법33)에 따라 Sprague Dawley(SD) male rat의 혈소판을 분리 한 후 Aggregometer(Qirono-log, Model No. 490- 2D, Havertown, PA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 시험물질의 억제율(inhibition rate)은 Lee와 Chung"y] 연구에서 설명한 계산식으로 나타내었다.
AOAC법28)에 따라 녹용의 일반성분 분석을 하였다. 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백은 semi micro Kjeldahl 법, 조회분은 550℃ 회화법으로 정 량하였다.
Tyrosinase 저해 효과 측정은 Wong 등의 방법32)으로 측정하였으며, tyrosinasee; 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 7.0)에 용해하여 조효소액으로 하였다. 효소 활성의 측정은 10 mM catechol 용액 2.
조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백은 semi micro Kjeldahl 법, 조회분은 550℃ 회화법으로 정 량하였다. 탄수화물은 조지방과 조단백, 조회분을 뺀 값으로 하였다.
지질 과산화 억제 활성의 측정은 Osawa의 방법30)에 따라 먼저 리놀레산(25 mg/㎖ in Et-OH), 염화 철분(2.45 mg/㎖ in 3.5% hydrochloride), ammonium thiocyanate(0.3 g/㎖ in H2O), 0.2 M 인산 완충액(pH 7.0)을 조제하여 이들을 stock solution 으로 사용하였다. 혼합 용액은 각 시료 용액 0.
성능/효과
6). ACE 저해 작용은 녹용 추출물 농도가 증가할수록 그 작용이 증가하였고, 2 mg/mg 추출물과 비교하였을 때 100 mg/㎖ 추출물에서 그 값이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 Kim과 Rhyu23)의 보고에서와 같이 녹용 중의 아미노산인 glycine과 glutamic acid 등의 각종 필수아미노산과 수종의 미량 원소들에 의한 것으로 보이나 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
0에서 가장 낮은 소거 효과를 나타내어 pH가 높아질수록 그 활성이 낮았다. tyrosinase 억제 효과는 64.0%, SD rat의 혈소판을 ADP로 자극하였을 때 일어나는 혈소판 응집에 대한 저해 활성은 51.7% 로 이들 억제 효과는 농도 의존적으로 일어남을 알 수 있었다. ACE의 저해 효과는 녹용 추출물 100 mg/㎖의 농도에서 47.
대한 전자 공여 효과를 측정하였다. 그 결과 본시료를 100 mg/㎖ 조제하여 활성을 측정한 경우 가장 높은 67.1%의 전자 공여 효과를 나타냈으며, 항산화 활성은 농도의존적으로 나타나는 것으로 확인되었다(Fig. 1). 녹용 함량이 약 70 mg/㎖ 정도 함유되는 녹용대보탕의 항산화 활성이 80.
9%로 확인되었다. 녹용 추출물 100 mg/㎖의 농도에서 DPPH에 의한 전자 공여 효과는 67.1%로 나타났으며, 리놀레산을 이용한 지질 과산화 억제 효과는 92.1%로 매우 높은 활성을 보였다. 여러가지 pH 에서 아질산염 소거 효과를 비교 검토한 결과, 시료의 아질산염 소거 효과는 pH 1.
녹용 추출물 농도별에 따라 SD rat의 혈소판을 ADP로 자극하였을 때 일어나는 혈소판 응집 저해 활성을 측정한 결과, 100 mg/㎖의 경우 51.7%로(Fig. 5), 혈전의 예방 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 이들 억제 효과는 농도 의존적으로 일어남을 알 수 있었다. 녹용에는 불포화 지 방산이 포화 지 방산보다 많이 함유되었으며 혈소판 응집 억제 효과가 있는 do- cosahexaenoic acid(DHA)가 43.
녹용 추출물 농도별에 따른 tyrosinase 저 해 작용을 측정 한결 과는 Fig. 4에 나타난 바와 같고, 녹용 추출물 100 mg/M에서 64.0%의 활성을 보였다. 또한, 화장품에 많이 사용되는 미백제 성분인 아스코르브산을 대조구로 사용하였을 때, 0.
녹용 추출물의 pH 조건별 아질산염 소거 효과를 비교 검토한 결과, Fig. 3에 나타난 바와 같이 100 mg/㎖의 녹용 추출물은 pH 1.2 산성에서 64.0%의 활성을 나타냈으며, pH 6.0에서는 38.0%의 활성을 보였다. 이는 pH가" 감소함에 따라 아질산염 소거 작용이 증가함을 알 수 있었다.
리놀레산을 이용한 지 질 과산화 억제 효과는 Fig. 2와 같이 녹용 추출물 100 mg/㎖의 경우 92.1%를 보였으며, 이 결과로 녹용 추출물의 과산화 지질의 생성을 억제하는 효과가 큰 것으로 확인되었다. 현재 많이 사용되고 있는 합성 항산화제인 BHT(0.
이러한 ace의 작용을 저해함 으로써 고혈압의 치료가 가능하다고 알려져 있으며, 단백질효소 분해물 유래의 peptide가 40여종이 있다고 보고되고 있다42). 본 실험에 사용된 녹용 추출물 ACE 저해 작용은 100 mg/㎖에서 47.5%의 활성을 나타내었다(Fig. 6). ACE 저해 작용은 녹용 추출물 농도가 증가할수록 그 작용이 증가하였고, 2 mg/mg 추출물과 비교하였을 때 100 mg/㎖ 추출물에서 그 값이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다.
본 실험에서 사용한 녹용의 탄수화물, 단백질, 조지방 및 조회분 함량은 각각 7.6%, 65.3%, 3.2%와 23.9%로 확인되었다. 녹용 추출물 100 mg/㎖의 농도에서 DPPH에 의한 전자 공여 효과는 67.
본 연구에서 사용된 녹용의 일반성분 분석의 결과는 탄수화물이 7.6%, 조단백질이 65.3%, 조지방이 3.2%, 그리고 조회분이 23.9%였다(Table 1). Kim과 Rhyu23)의 무기질 조성에 대한 연구에 의하면 녹용 전체의 회분 함량이 21.
1%로 매우 높은 활성을 보였다. 여러가지 pH 에서 아질산염 소거 효과를 비교 검토한 결과, 시료의 아질산염 소거 효과는 pH 1.2에서 가장 높았고, pH 6.0에서 가장 낮은 소거 효과를 나타내어 pH가 높아질수록 그 활성이 낮았다. tyrosinase 억제 효과는 64.
후속연구
ACE 저해 작용은 녹용 추출물 농도가 증가할수록 그 작용이 증가하였고, 2 mg/mg 추출물과 비교하였을 때 100 mg/㎖ 추출물에서 그 값이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 Kim과 Rhyu23)의 보고에서와 같이 녹용 중의 아미노산인 glycine과 glutamic acid 등의 각종 필수아미노산과 수종의 미량 원소들에 의한 것으로 보이나 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
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