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문제 정의
- 본 연구에서는 腎氣丸合蒼附導痰湯의다낭성 난소 치료에 대한 효과를 실험적으로 구명하고자 흰쥐에 EV를 근육주사하여 다낭성 난소를 유발시킨 후 腎氣丸 合蒼附導痰湯을 경구 투여하여 난소와부신의 무게, 난소의 육안 및 병리조직학적 검사 그리고 NGF 발현의 정도를확인하였다.
- 이에 腎氣丸合蒼附導痰湯이 흰쥐의 PCO 발생을 억제하는 기전을 확인하고자 NGF의 발현 정도를 난소. 해마, 뇌하수체 그리고 부신에서 관찰하였고 실험 결과, EV를 투여한 처치군의 난소조직에서 정상군에 비해 NGF의 발현이상승되었으며.
- 이에 본 연구에서는 腎氣丸合蒼附導痰 湯이 다낭성 난소에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자. Estradiol Valerate(EV) 로 유발된 흰쥐의 다낭성 난소 모델을 이용하여 난소의 무게 육안 및 형태와 병리 조직학적 소견, 그리고 뇌, 부신 및 Nerve Growth Factor(NGF) 발현의 차이를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- EV 주사 60일 후에 흰쥐를 ether로 마취시킨 상태에서 전혈을 심장채혈하고 4% paraformaldehyde 액으로 관류고정하고 양측 난소 및 부신을 적출하여 무게를 측정하였다.
- 규명하고자. Estradiol Valerate(EV) 로 유발된 흰쥐의 다낭성 난소 모델을 이용하여 난소의 무게 육안 및 형태와 병리 조직학적 소견, 그리고 뇌, 부신 및 Nerve Growth Factor(NGF) 발현의 차이를 관찰하고자 하였다.
- NGF 양성반응의 정도는 NGF에 염색된 세포의 수 및 염색강도를 기준으로하였으며, 양성반응이 관찰되지 않을 경우를 -, 미약한 양성 반응을 +, 중정도의 양성반응을 ++, 강한 양성반응을 + + +로 표시하였다.
- 腎氣丸合蒼附導痰湯 4첩 분량(424 g) 을 2,000 ml 의 증류수에 1시간 동안 침지시킨 후, 2시간 30분간 전탕하였다. 전탕액을 원심하여 침천된 성분을 제거한 후감압농축기 (EYELA, NE-1001, Japan) 로 100 ml로 농축시켰다.
- 腎氣丸合蒼附導痰湯이 흰쥐의 다낭성 난소(polycystic ovary, PCO)에 미치는 영향을 확인하기 위해서 체중 180g 내외의 암컷 흰쥐에 4mg 의 Estradiol Valerate(EV)를 근육주사한 대조군, EV 주사와 더불어 腎氣丸合蒼附導痰湯 농축액을 60일간 경구 투여한 처치군으로 분류하였다. EV 주사 60일 후에 부검하여 난소 및 부신의 중량 측정.
- 개체 당 한 쪽 난소를 일반적인 조직처리 과정을 거쳐서 파라핀 포매하고 5 의 박 절편을 만들어 Hematoxylin-Eosin( H & E) 염색하여 광학현미경하에서 일반적인 병리 조직학적 소견을 관찰하였다. 또한 각 난소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다.
- EV 주사 60일 후에 부검하여 난소 및 부신의 중량 측정. 난소의 육안 및 병리조직학적 검사, nerve growth factor(NGF) 면역조직화학적 검사를 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 또한 각 난소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다. 난포의 수는 난자세포가 관찰되는 난포만을 대상으로 하였으며, 난포 막이 형성되고 과립막세포가 2 층 이상으로 증식된 2차 난포, 난포동이 형성된 성숙 난포 및 폐쇄 난포로 구분하여 계수하였다. 난자세포의 변성 또는 과립막 세포층의 고사(apoptosis)가 관찰되는 난포를 폐쇄 난포로.
- 뇌, 뇌하수체, 부신 및 난소를 적출하여 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 각 조직을 5网 두께의 박절편을 제작하였다. 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 조직을 citrate buffer(pH 6.
- 소견을 관찰하였다. 또한 각 난소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다. 난포의 수는 난자세포가 관찰되는 난포만을 대상으로 하였으며, 난포 막이 형성되고 과립막세포가 2 층 이상으로 증식된 2차 난포, 난포동이 형성된 성숙 난포 및 폐쇄 난포로 구분하여 계수하였다.
- 5)로 10분씩 3회 세척하였다. 반응이 종료된 절편을 DAB (Roche, Germany) 로 5분간 발색시키고 hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 NGF 양성반응의 정도를 확인하였다.
- 부검하여 적출된 양측 난소의 육안소견을 관찰하였다.
- 실험개시일, 실험 후 20일, 40일, 50일및 60일에 체중을 측정하였다.
- 제작하였다. 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 조직을 citrate buffer(pH 6.0) 에 넣어 500 W 출력의 microwave로 5분간 3회 처리하여 항원성을 부활시키고, 1% H2O2 용액에 30분간 처리하여 내인성 과산화 반응을 억제한 후 ABC kit( Vector Lab., USA)를 이용하여 NGF 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 일차항체인 rabbit anti-mouse nerve growth factor( Chemicon International Inc.
대상 데이터
- 다낭성 난소 증후군은 무배란과 불임증, 월경장애. 고안드로겐혈증 등을 주 증상으로 하고 가임기 여성에게서 볼 수 있는 내분비질환으로, 시상하부-뇌하수처]-난소축 및 부신에 기능적 이상이 초래되어 발생하는 복합적인 증후군이다 「3).
- 4) 낭성 난포 및 폐쇄 난포는 매우 드물게 관찰되었다. 대조군에서는 장액을 함유한 다양한 크기의 낭포가 형성되어 있었고 성숙 난포의 수는 현저히감소되었고 황체는 매우 드물게 형성되어 있었다(Fig. 5). 액을 함유한 낭포의벽은 I층 또는 2층의 얇은 세포로 둘러싸여 있었으며 강내에 변성된 탈락세포들이 산재해 있었고 기저막과 분리된 부위도 자주 관찰되었다.
- 실험에 사용한 腎氣丸合蒼附導痰湯은 《金匱要略》&과 《葉天士女科》⑸에의거하였으며, 약재는 세명대학교 한방병원에서 구입한 후 엄선하여 사용하였다. 처방의 내용과 분량은 Table 1과 같다.
- 체중 180 g 내외의 암컷 Sprague-Dawley Rat(샘타코, 한국)를구입하여 온도 23+l℃, 습도 55±5%로 조정 된 항온항습사육장치 ( 대 종기 기 상사. 한국)내에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 전 실험기간동안 사료 (제일제당, 한국)와 음수는 자유롭게 섭취케 하였다.
데이터처리
- 측정된 항목의 결과에 대한 통계는 SPSS(SPSS 10.0 for Windows, USA)를이용하여 student's t-test를 실시하여 검증하였다.
이론/모형
- 다낭성 난소(polycytic ovary, PCO)는 Brawer 등"의 방법에 준하여 유발하였다. Estradiol Valerate(EV)(Sigma, USA) 를 소량의 benzyl alcohol (Sigma, USA) 에 용해시킨 후 sesame oil(Sigma, USA) 에 20 mg/ml 의 농도로 혼합하고 이 용액 0.
성능/효과
- - 난포의 과립막세포에서의 NGF 양성반응은 처치군이 대조군에 비해서 감소되 었다.
- 수 있었다. 그러나 腎氣丸合蒼附導 痰湯을 투여한 처치군의 난소에서는 대조군에 비하여 난포 및 황체가 많이 관찰되어 본 처방이 다낭성 난소에 유효 한호 과가 있음을 알 수 있었다.
- 난소 조직내 NGF 양성 반응은 간질세포(Fig. 8), 난포막세포, 과립막세포 및 황체 세포에서 확인되었다. 각 세포에서의 NGF 양성반응의 정도는 Table 5와 같다.
- 난소의 무게는 대조군 및 처치군 모두정상군에 비해서 유의성 있게 감소하였으며, 처치군은 대조군에 비해서 유의성있게 증가되었다(Table 3).
- 대조군과 처치군 모두 정상군에 비해서 실험 20일부터 유의성 있는 체중의 감소를 보였다. 처치군은 대조군에 비해서 유의성은 없었으나 체중이 증가하는 경향을 보였다(Table 2).
- 다소 높았지만. 대조군에 비해 NGF 발현이 상당히 감소되었으며. 특히 과립 막에서 NGF의 발현을 감소시켰다.
- 본 연구에서 EV로 유발된 대조군 난소의 병리조직학적 소견에서 장액을 함유한 다양한 크기의 낭포가 확인되었고성숙 난포가 감소되고, 황체가 드물게형성된 것으로 보아 EV에 의해 유발된흰쥐의 다낭성 난소는 사람의 다낭성 난소의 병리조직학적 소견과 매우 유사함을 확인할 수 있었다. 그리고 腎氣丸合 蒼附導痰湯이 투여된 처치군에서 대조군에 비해 '이차난포.
- 본 연구에서 EV를 접종한 대조군의 난소는 육안적으로 많은 낭이 형성되어있어 다낭성 난소가 잘 유발되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 腎氣丸合蒼附導 痰湯을 투여한 처치군의 난소에서는 대조군에 비하여 난포 및 황체가 많이 관찰되어 본 처방이 다낭성 난소에 유효 한호 과가 있음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 대조군 난소의 무게가 정상군에 비해서 감소되었다. 이런 결과는 이차 난포와 황체의 수적 감소로 인한 것으로 보이며, 이 결과는 다른 연구1耶6) 와같았다.
- 본 연구에서 부신의 무게는 대조군이나 처치군이 정상군에 비해 부신의 무게가 다소 증가되었으나 모두 유의성 없는범위 내에서 증가한 것이므로, EV 및 腎 氣丸合蒼附導痰湯은 모두 부신에는 별다른 영향을 미치지, 않는 것으로 보인다.
- 실험 종료 후 EV로 다낭성 난소가 유발된 처치군과 대조군은 정상군에 비해다소 체중이 감소하는 경향을 보였다. 이는 사람의 다낭성 난소 증후군 환자의약 50% 정도에서 나타나는 비만3)과는비교되는 사항으로, EV로 유발된 다낭성 난소를 가진 흰쥐의 병태학적 증상인지 또는 실험기간동안의 스트레스에 의한 결과인지는 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 종합해 보면 다낭성 난소 증후군 환자에게 腎氣丸合蒼附導痰湯 을 초기에 투여하면 배란 능력이 회복되어 다난성 난소 증후군의 치료에 유의한효과가 있을 것으로 보인다.
- 이상의 성적을 토대로 할 때 腎氣丸合 蒼附導痰湯 EV로 유도된 흰쥐의 다낭성낭소 증후군에서 난포의 성숙을 유도하여 정상 배란을 촉진하는 효과가 있는것으로 사료된다.
- 정상군에서는 다양한 크기의 1차 난포, 2차 난포 및 성숙난포가 다수 관찰되었고 많은 수의 황체가 형성되어 있었으며(Fig. 4) 낭성 난포 및 폐쇄 난포는 매우 드물게 관찰되었다. 대조군에서는 장액을 함유한 다양한 크기의 낭포가 형성되어 있었고 성숙 난포의 수는 현저히감소되었고 황체는 매우 드물게 형성되어 있었다(Fig.
- 정상군에서는 모든 예에서 간질세포에서 미약한 양성반응이 확인되었고, 기타세포에서는 미약한 양성 또는 음성 반응이 확인되었다. 대조군에서의 양성 반응은 정상군에 비해서 강하게 나타났으며, 특히 과립막세포에서의 양성반응(Fig.
- 처치 군에서는 정상군에 비해서 낭성 난포 및 황체 수에서만 유의성 있는 감소가 있었다. 처치 군은 대조군에 비해서 2차 난포, 성숙 난포 및 황체 수가 유의성 있게 증가되었으며, 폐쇄 난포 수는 유의성 있게 감소되었다. 처치군의 낭성 난포의 수는 대조군에 비해서 감소되었으나 유의성은 없었다.
- 9) 이 정상군과 뚜렷한 차이를 나타내었다. 처치군은 대조군과 유사한 정도의 반응을 보였으나 과립막세포에서의 양성 반응은 대조군에 비해서 약하게 나타났다.
- 해마, 뇌하수체 그리고 부신에서 관찰하였고 실험 결과, EV를 투여한 처치군의 난소조직에서 정상군에 비해 NGF의 발현이상승되었으며. 특히 과립막에서 뚜렷하게 증가되었고, 부신 수질에서는 오히려다소 감소된 것으로 나타났다. 그리고부신의 피질.
- NGF의 발현 정도를 난소. 해마, 뇌하수체 그리고 부신에서 관찰하였고 실험 결과, EV를 투여한 처치군의 난소조직에서 정상군에 비해 NGF의 발현이상승되었으며. 특히 과립막에서 뚜렷하게 증가되었고, 부신 수질에서는 오히려다소 감소된 것으로 나타났다.
후속연구
- 보였다. 이는 사람의 다낭성 난소 증후군 환자의약 50% 정도에서 나타나는 비만3)과는비교되는 사항으로, EV로 유발된 다낭성 난소를 가진 흰쥐의 병태학적 증상인지 또는 실험기간동안의 스트레스에 의한 결과인지는 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그런데 다낭성 난소 질환이 있는 여성의 난소 크기는 보통 2-3배 증가되는 데3)에 비해 EV로 유발된 흰쥐의 다낭성 난소는 오히려 크기가 감소한 결과를 보였다. 이러한 원인은 EV로 유발된 동물실험은 다낭소 난소의 발현 방법이나 기전의 차이에 의한 것으로 보이며, 이에 대해서는 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 보인다. 그리고 腎氣丸合 蒼附導痰湯이 투여한 흰쥐의 난소의 무게가 정상군에 비해서는 작지만 처치 군에 비해서 유의성 있게 증가하였다.
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