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문제 정의
- 천연물질과 구강 관련 선행연구로는 고삼9), 소목10), 오이풀11), 호장근12)등의 보고들이 있었으나, 마(Dioscorea batatas)와 꿀풀(Prunella vulgaris)을 이용한 구강세균에 대한 연구는 미흡 하여 이에 본 연구는 S. mutans의 성장억제, 산 생성억제, GTase의 활성저해 시험을 통해 항균, 항우식 효과의 잠재성을 연구하였다.
제안 방법
- mutans를 1×106 CFU/ml가 되게 접종하였다. 37℃의 CO2배양기에서 24시간 배양한 후 BHI broth의 pH를 측정하여 산 생성 억제효과를 관찰하였다. 대조군은 추출물을 넣지 않고 시행하였다.
- BHI broth에 마, 꿀풀 헥산 추출물을 0.1, 0.5, 1, 2 mg/ml 로 첨가한 후 미리 배양한 S. mutans를 1×106 CFU/ml가 되게 접종하였다.
- 004 mg/ml까지 단계 희석한 시료를 첨가하였다. 균 배양액을 McFarland No. 0.5 농도가 되게 희석한 후, 다시 100배 희석한 균액을 각 well에 분주하여 박테리아는 37℃ 배양기에서 24시간 배양 한 다음 ELISA reader를 사용 하여 625 nm에서 흡광도를 측정하여 성장억제능을 관찰하였다.
- 분쇄한 각 시료에 10 배량 (w/v)의 80% methanol을 가하여 24시간씩 3회 정치하여 추출하고, 추출액은 여과지 (Adventec Toyo 2, Japan)를 사용하여 2회 감압 여과하고 rotary vacuum evaporator로 농축하였다. 이를 동결건조 후 dry keeper에 보관 하여 사용하였다.
대상 데이터
- incubator (Sanyo, MCO-17 AIC, Japan), ELISA reader (Molecular Device, SpecTRA MAX 340, Austria), high speed centrifuge, pH meter 등 을 사용하였다. 시료의 추출 및 분획에 사용된 용매로써 methanol, nhexane 등은 특급시약을 사용하였으며, potassium tellurite, bacitracin 등은 Sigma사(U.S.A) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 균주는 Streptococcus mutans KCTC 5316을 한국생명공학연구소로부터 분양받아 사용하였다.
- 실험에 사용한 기기로는 rotary vacuum evaporator, 동결건조 장치, CO2 incubator (Sanyo, MCO-17 AIC, Japan), ELISA reader (Molecular Device, SpecTRA MAX 340, Austria), high speed centrifuge, pH meter 등 을 사용하였다. 시료의 추출 및 분획에 사용된 용매로써 methanol, nhexane 등은 특급시약을 사용하였으며, potassium tellurite, bacitracin 등은 Sigma사(U.
- 이 실험에서 사용한 마와 꿀풀은 대구 약령시 한약재상에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다(Table 1).
데이터처리
- Values with different superscripts in the same column are significant different by Duncan's multiple range test(p<0.05).
- 또한 분산분석결과 군간 유의한 차이가 있을 경우 유의수준은 α = 0.05에서 Duncan's multiple range test로 사후검정하였다.
- 모든 실험은 3회 반복하였으며, 자료의 분석과 통계처리는 SAS 8.01을 사용하여 Levene통계량을 이용하여 등분산에 대한 검정 한 다음, 등분산이 인정되면 각 실험군에 대한 다중 검증을 위해 일원분산분석법(one-way ANOVA)으로 검정하였다. 또한 분산분석결과 군간 유의한 차이가 있을 경우 유의수준은 α = 0.
이론/모형
- GTase의 분리는 이 등13)의 방법을 사용하여 분리하였다. S.
성능/효과
- 따라서 농도가 증가함에 따라 성장이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 2.0 mg/ml 농도에서 마가 pH 7.2, 꿀풀이 pH 7.0로 나타나 pH 5.6, pH 5.2인 대조군과 비교하여 볼 때 마, 꿀풀 헥산 추출물을 첨가물이 산 생성을 억제하여 중성으로 보여주고 있으며, GTase 활성 저해효과는 마와 꿀풀의 헥산 추출물의 2.0 mg/ml농도에서 35%, 25%로 각각 활성을 저해하였다.
- 마, 꿀풀 추출물의 용매 분획별 구강병인균에 대한 항균 및 항우식 효과를 알아본 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. S. mutans에 대한 마, 꿀풀 헥산 추출물의 상대성장률과 산 생성 억제 및 GTase 활성 저해효과을 알아본 결과, 마 헥산 추출물의 0.25 mg/ml 농도에서 100%, 꿀풀 헥산 추출물의 0.5 mg/ ml 농도에서 100% 성장을 억제하였다. 따라서 농도가 증가함에 따라 성장이 억제되는 것을 볼 수 있었다.
- S. mutans에 대해 꿀풀 용매 분획별 항균성을 측정한 결과 헥산추출물이 가장 우수하였다. S.
- S. mutans에 대해 마 용매 분획별 항균성을 측정한 결과 헥산추출물이 가장 우수하였다. S.
- S. mutans의 상대성장률 (Relative Growth Ratio, RGR)은 0.004와 0.008 mg/ml 농도에서 뚜렷한 억제를 보이지 않았으나, 0.016 mg/ml 농도에서는 33%, 0.031 mg/ml 농도에서 54%, 0.063 mg/ml 농도에서는 67%, 0.125 mg/ml 농도에서80%, 0.25 mg/ml 농도에서는 86%, 0.5 mg/ml 농도 이상에서는 100%까지 억제하여추출물의 농도가 증가함에 따라 통계적으로 유의하게 성장이 억제되었다 (p < 0.05)(Fig. 2).
- S. mutans의 상대성장률(Relative Growth Ratio, RGR)을 본 결과 0.004와 0.008 mg/ml 농도에서 뚜렷한 억제력을 보이지 않았으나, 0.016 mg/ml 농도에서 9.27%, 0.031 mg/ml 농도에서 43.5%, 0.063 mg/ml 농도에서는 82%, 0.125 mg/ml 농도에서는 93%, 0.25 mg/ml 농도 이상에서는 100%까지 억제하여, 추출물의 농도가 증가함에 따라 통계적으로 유의하게 성장이 억제되었다(p < 0.05)(Fig. 1).
- 그러나 0.5 mg/ml를 첨가하였을 때 pH는 6.4±0.1, 1.0 mg/ml에서는 pH가 6.7 ±0.2, 2.0 mg/ml에서는 pH가 7.2 ±0.1로 대조 군과 비교하여 통계적으로 유의하게 산 생성을 억제함을 보였다(p < 0.05).
- 그리고 배양 전 추출물을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지 모두 pH는 7.02±0.01이었으나 24시간 이후 대조군에서는 pH가 5.2±0.03로 나타났으며 마 헥산 추출물 2.0 mg/ml 을 첨가시 pH는 7.0±0.06로 나타나 헥산 추출물이 산 생성을 억제함을 보여주고 있다.
- 그리고 배양 전 추출물을 첨가한 배지와 추출물을 첨가하지 않은 배지 모두 pH는 7.02 ±0.01이였는데 24시간 이후 대조군에서는 pH가 5.6±0.1로 나타났으며 마 헥산 추출물 2.0 mg/ml을 첨가하였을 때 pH는 7.2 ±0.1로 나타나헥산 추출물이 산 생성을 억제하였음을 알 수 있었다.
- 마 헥산 추출물의 첨가량이 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml 일 때, 흡광도는 각각 0.057, 0.052, 0.047, 0.041, 0.037로 나타났고, GTase 활성 저해율은 농도에 따라 각각 0, 9, 18, 28, 35%였으며, 통계적으로 유의하게 활성이 저해되었다(p < 0.05).
- 마와 꿀풀 두 물질을 비교하였을 때 마 헥산 추출물에서 산생성 억제력이 높았다.
- 05). 사후검정결과, 대조군과 비교시 0.1 mg/ml를 제외한 0.5 mg/ml이상의 농도에서는 농도 의존적으로 유의하게 활성을 저해시킴을 확인할 수 있었다.
- 05). 사후검정결과, 모든 군에서 대조군과 비교시 마 헥산 추출물에 대해 농도 의존적으로 유의하게 활성이 저해되었다.
후속연구
- 8%의 높은 억제율을 보였다. 선행연구와 비교한 결과 마 헥산 추출물의 GTase 활성 저해율이 꿀풀 헥산 추출물에 비해 높게 나타났지만 선행연구자들의 결과에 비해 효과가 낮은 것으로 보아 유효 성분을 분리, 정제하여 실험할 필요성이 대두된다.
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