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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연항산화제로써의 가능성을 알아보기 위해 뱀장어에서 추출한 carnosine을 대상으로 기능성을 검토하였다.
제안 방법
- 2 M phosphate buffer (pH 6.6) 오! 1% potassium ferricyanide# 첨가한 혼합물을 50°C에서 20분간 반응시키고 2 mL의 10% trichloroacetic acid를 각각의 반응물에 첨가한 후 반응물 2 mL에 증류수 2 mL와 0.4 mL의 0.1% ferric chloride를 시험관에 첨가하고 정확히 10분후에 700nm에서 흡광도를 측정하여 환원력을 평가하였다.
- Bussayarat et al. (2005)의 방법을 변형하여 주줄물의 분자량을 조절하였으며, Amicon 사의 stirred cell 한외여과 장치를 이용하였다. 즉, 저분자 펩타이드인 carnosine 분리를 위해서가 열 처리 및 이온교환 처리한 시료를 membrane filter (XM50, YM30, YM10, YM3, YM1, YC05)로 걸러서 분자량을 최종 500Da이하까지 조절하였으며 여과액을 -50 °C 이하로 냉동시킨 후 동결건조 하여 실험용 시료로 사용하였다.
- Camosine 추출을 위해 뱀장어 육을 이용하여 이온 교환처리와 한외여과를 통해 분자량을 조절한 시료를 대상으로 각종 기능성을 평가하였으며 각각의 처리조건에 따른 함량 변화를 Table 1에 나타내었다. 결과를 살펴보면 이온교환 처리한 추출물을 한외여과법으로 분자량을 조절하였을 때 산화 촉진제로 작용할 수 있는 단백질 및 철 함량은 각각 약 47%, 43% 정도감소되었으며, carnosine 함량은 약 6% 정도 증가하였다.
- Carnosine은 histidine과 B-alanine이 결합된 이분자 펩타이드로서 camosine의 항산화능이 둘 중 어느 것에 의해 발현되는지 확인함과 동시에 뱀장어 추출 carnosine의 항산화능을 평가하기 위하여 histidine, -alanine 및 taurine을 대조구로 하여 환원력을 측정하였다 (Table 2).
- McManus (1957)의 방법을 변형하여 뱀장어 육에 10배가량의 1% picric acid를 가해 마쇄한 뱀장어 육을 균질화한 후 8, 000銘에서 30분간 원심 분리시켜 침전물을 제거한 상등액을 Dowex-2 chloride column (2.5x30 cm)을 이용하여 단백질 잔여물과 picric acid를 제거하였다.
- (1992)의 방법에 따라 측정하였다. 공시험구의 시료로는 탈 이온수를 사용하였으며 0.5 mL의 각각의 시료에 0.4 mM DPPH 시험용액 1.0 mL를 첨가한 후 혼합물을 교반시키고 실온에서 30분간 정치시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거 능을 측정하였으며 소거능은 다음과 같은 방법으로 계산 하였다.
- 0으로 조절한다. 그리고 0.5 mL의 ferrozine solution (9 mM)을 첨가한 후 실온에서 5분간 방치 후 562nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다.
- 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.4 mL를 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하며 아질산염 소거능은 추출액을 첨가한 경우와 첨 가하지 않은 경우의 아질산염 백분율 (%)로 나타내었다.
- , 1991). 따라서 뱀장어 추줄 carnosine의 SOD 유사활성을 L-ascorbic acid 및 明丁와 함께 조사하였다 (Table 4).
- 뱀장어 carnosine이 저장육의 색도변화에 미치는 효과를 살펴보기 위해 4°C에 저장한 시료를 2.0><2.0xl.5cm의 크기로 잘라 색차계 (Color techno system Co., Japan JC801)를 이용하여 L* (명도), a* (적색도), b* (황색도) 값을 측정하였다.
- 나타내는 물질로 보고되고 있다. 본 실험에서는 pH 1.2, pH 3.0, pH 4.2롤 조절하여 아질산염에 대한 소거 능을 살펴보았는데 이들 pH 범위는 인체내 위에서의 pH 변화를 고려하였으며 합성 carnosine과 뱀장어 주줄 camosine을 동일 농도로 첨가하여 실험한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 결과를 살펴보면 합성 carnosine의 경우 pH 1.
- 2로 조절하고 부피를 10mL로 하였다. 이액을 37°C에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 초산용액 5 mL, Griess 시 약 (30% acetic acid로 각각 조제한 1% sulfanilic acid 와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것으로 사용직 전 조제) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합한 후 실온에서 15분간 방치 후 520nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염의 양을 산출 하였다.
대상 데이터
- Camosine 추출을 위해 살아있는 뱀장어를 수욕 상에서 3시간 정도 방치시킨 후 즉살시켜 껍질과 두부, 내장, 뼈를 제거한 후 camosine 추출용 시료로 사용 하였다.
- 변화를 비교한 결과를 Table 5에 나타내었다. 대조구로 탈이온수를 첨가한 구와 실험구로는 천연 항산화제 인 L-ascor- bic acid 와 합성 carnosine을 사용하였다. 결과를 살펴보면 명도 (L)는 저장기간이 증가함에 따라 3일째와 5일째를 비교하면 대조구의 경우 약 4%, L-ascorbic acid의 경우 약 0.
- 본 실험 에 사용한 뱀장어 Anguilla japonica는 부산광역시 남천동 남천해변시장에서 평균체중 300-400g, 체장 50-70cm 의 뱀장어를 구입하여 살아있는 상태로 실험실로 운반하여 실험에 사용 하였다.
- 결과를 살펴보면 이온교환 처리한 추출물을 한외여과법으로 분자량을 조절하였을 때 산화 촉진제로 작용할 수 있는 단백질 및 철 함량은 각각 약 47%, 43% 정도감소되었으며, carnosine 함량은 약 6% 정도 증가하였다. 이에 본 실험에서는 이온교환 처리와 한외여과를 통해 분자량을 조절한 시료를 항산화능 평가용 시료로 사용하였다.
- (2005)의 방법을 변형하여 주줄물의 분자량을 조절하였으며, Amicon 사의 stirred cell 한외여과 장치를 이용하였다. 즉, 저분자 펩타이드인 carnosine 분리를 위해서가 열 처리 및 이온교환 처리한 시료를 membrane filter (XM50, YM30, YM10, YM3, YM1, YC05)로 걸러서 분자량을 최종 500Da이하까지 조절하였으며 여과액을 -50 °C 이하로 냉동시킨 후 동결건조 하여 실험용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- Gray and Dugan (1975)의 방법에 따라 발암성 물질인 nitrosoamine 생성의 전구체로 작용하는 아질산염 (nitrite) 의소거능을 살펴보았다.
- Metmyoglobin 즉정은 Krzywicki, 1979의 방법에 따라 즉정하였다. 분쇄육 (5 g)을 50mL의 원심튜브에 넣은 후 25mL의 phosphate buffer (pH 6.
- SOD 유사활성측정은 Marklund and Marklund (1974) 방법에 따라 농도별로 제조한 각 시료 0.2 n止에 tris-HCl buffer (50 mM tris+10mM EDTA, pH 8.5) 3.0 mL와 7.2><10'3M pyrogallol 0.2 mL를 가하고 25°C에서 10분간 방치 후 1 N HC1 (1 mL) 로반응을 정지 시켜 420nm에서 홉광도를 측정하였으며, 대조 구는 시험용액 대신 탈이온수를 첨가하여 다음 계산식에 따라 SOD 유사활성 (%)을 계산하였다.
- 과산화물가 (POV)는 AOAC법 (1995)에 따라 유지혼탁액 1 g을 취하여 유기용매 (chlorofbrm: acetic acid =2:3) 30 mL에 녹이고, KI 포화용액 1 mL를 가하여 약 1분간 강하게 진탕한 다음 5분간 암소에 방치한 후 이 용액에 증류수 70mL를 가하여 1분간 진탕시키고, 전분 지시약 1 mL를 가한 다음 0.01 N Na2S2O3 용액으로 적정하여 다음의 식에 의하여 산출하였다. 유지 혼탁액은 Choi (1999)의 방법에 따라 Linoleic acid 10, 증류수 9, 유화제 1 (Tween80:Span60=l:l)의 비율로 혼합한 다음 여기에 각 비교 항산화제를 첨가하여 균질기 (Homogeni zer AM-7)로 7분 동안 균질화 시켜 유지혼탁액을 제조하였으며 60°C에서 14일 동안 저장하면서 과산화 물가를 측정하였다.
- 뱀장어 주줄 camosine 의 2, 2-diphenyl-1 -picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 시험은 Shimada et al. (1992)의 방법에 따라 측정하였다. 공시험구의 시료로는 탈 이온수를 사용하였으며 0.
- 뱀장어 추출 carnosine의 환원력은 Oyaizu (1988)의 방법에 따라 측정하였다. 대조구로는 탈이온수를 사용하였으며 실험 방법은 다음과 같다.
- 01 N Na2S2O3 용액으로 적정하여 다음의 식에 의하여 산출하였다. 유지 혼탁액은 Choi (1999)의 방법에 따라 Linoleic acid 10, 증류수 9, 유화제 1 (Tween80:Span60=l:l)의 비율로 혼합한 다음 여기에 각 비교 항산화제를 첨가하여 균질기 (Homogeni zer AM-7)로 7분 동안 균질화 시켜 유지혼탁액을 제조하였으며 60°C에서 14일 동안 저장하면서 과산화 물가를 측정하였다.
- 철 함량 측정은 Stookey (1970)의 방법에 따라 추출물 1.0 mL에 0.2 mL의 sulfuric acid를 가해 용해시킨 후 0.4 mL의 30% hydrogen peroxide를 첨가하여 110 °C 에서 2시간 동안 가열하고 1.0 mL의 10% hydroxyl amine hydrochloride# 첨 가하여 37°C에서 30분간 반응 시킨 후 1.0mL의 ammonium acetate buffer를 첨가하고 1 M NaOH를 가해 pH를 6.0으로 조절한다. 그리고 0.
- 추출조건에 따른 단백질 함량의 변화를 살펴보기 위해 Lowiy et al. (1951)의 방법에 의거하여 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하여 주줄 조건에 따른 단백질의 함량변화를 살펴보았다.
성능/효과
- 13%를 나타내 가장 높았다. L-ascorbic acid의 라디칼 소거 능은 농도별로 각각 28.59%, 29.29%, 29.51% 및 29, 73%로 나타났으며, 기타 유리아미노산 중에서 histidine은 4.41± 0.77%, 9.11±0.15%, 17.65±0.99% 및 2L69±L09%로 나타났다. 기타 연구결과에 의하면 carnosine0] superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical 등과 반응하는 능력을 가지고 있다는 것이 확인 되었으며, carnosine의 이러한 기능은 histidine 잔기 의 수소 공여 에 의 한 것으로 추정 되고 있다 (Diez and Baran, 2003; Boldrev et al.
- 1에 나타내었다. 결과를 살펴보면 이온교환 처리한 추출물을 한외여과법으로 분자량을 조절하였을 때 산화 촉진제로 작용할 수 있는 단백질 및 철 함량은 각각 약 47%, 43% 정도감소되었으며, carnosine 함량은 약 6% 정도 증가하였다. 이에 본 실험에서는 이온교환 처리와 한외여과를 통해 분자량을 조절한 시료를 항산화능 평가용 시료로 사용하였다.
- 2에 나타내었다. 결과를 살펴보면 합성 carnosine의 경우 pH 1.2, pH 3.0, pH 4.2에서 각각 37.3%, 23.8%, 14.6%의 아질산염 소거능을 나타낸 반면 뱀장어 추출 camosine의 경우 65.3%, 57.4%, 55.28%의 소거 능을 나타내었으며 두 첨가구 모두 pH가 낮아질수록 높은 소거 능을 나타내 었는데 이 와 유사한 결과로 Kang et al. (1975)에의하면 아질산염 소거능을 여러 pH조건에서 측정한 결과 pH 1.2에서 가장 높게 나타났다고 보고하였다. 특히 아질산염은 식품 중에 존재하는 amine류와 반응해 생성되는 발암물질인 nitrosamine은 pH가 낮은 조건에서 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있는데 뱀장어 주출 carnosine과 합성 camosine 모두 pH 1.
- 과산화물가를 측정한 결과 (Fig. 1), 저장 기간 중 linoleic acid의 과산화물가는 큰 폭으로 증가한 반면 뱀장어 추출 carnosine과 L-ascorbic acid를 첨가한 경우 과산화물가의 증가가 억제되는 경향이 나타났으며, 그 효과는 비슷하였다. 특히 曲丁를 첨가한 경우에는 잘 알려진 바와 같이 시험기간 중에과산화물가의 증가가 나타나지 않았다.
- 3에 나타내었다. 대조구로 histidine과 yS-alanine, taurine 및 L-ascorbic acid를 사용한 결과 실험구와 대조구 모두 라디칼 소거능을 나타내었는데 B-alnine, taurine 및 L-ascorbic acid 의 경우 농도 증가에 따른 라디칼 소거능 증가는 없었다. 그러나 뱀장어 추출 carnosine과 histidine은 농도 증가에 따라 라디칼 소거능도 증가하였다.
- 3에 나타내었다. 대조구로는 탈이온수를 첨가한 구와 실험구로는 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 합성 carnosine을 사용한 결과, 대조구의 경우 5일째 약 42% 정도의 메트미오글로빈이 생성되었으나 항산화제 첨가구의 경우 대조구에 비해 낮은 결과를 나타내었으나 뱀장어 주줄 camosine 첨가구의 경우에는 합성 carnosine 첨가구에 비해서 약 3% 정도 높게 측정되었는데 이는 합성 carnosine에 비해 뱀장어 carnosine의 경우 천연상태에서 분리, 정제하였기 때문에 극소량 남아있는 잔여물에 의한 영향인 것으로 사료되어지나 천연항산화제인 L-ascorbic acid를 첨가한 경우와도 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. Lee et al.
- 뱀장어 추줄 carnosine의 활성은 L-ascorbic acid와 BHT에 비해 조금 낮았지만 농도가 증가함에 따라 22.59±0.94%, 30.71±2.07%, 34.11±1.09% 및 42.17±1.25%의 SOD 유 사활 성도 증가하는 경향을 나타내었다. Kim (2003)에 의하면 camosine, anserine, homocamosine은 BHT1--]' 아스코르빈산 보다 SOD 유사활성이 낮지만 알파~토코페놀 보다는 9-14배, 에리스로 빈산 (erythrobic acid) 보다는 1.
후속연구
- , 1999). 그러나 carnosine의 효과에 대해서 그 가능성만을 제시하는 수준에서 그치고 있어 향후 이와 관련하여 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- (1999) 에 의하면 쇠고기 패티에 carnosine과 ascorbic acid를 첨가하여 저장 실험한 결과 육색의 안정성은 높이면서 메트미오글로빈 형성은 억제 되었다고 보고 하였으며 축산 산업에 사용할 수 있는 유용성 있는 새로운 천연항산화라고 보고하였다. 뱀장어 추출 camosine을 첨가한 우육의 냉장 저장에 따른 변화를 살펴본 결과 육색을 지속시키면서 메트미오글로빈의 생성은 억제할 수 있는 천연항산화제로서의 가능성을 가지고 있으며 향후 분리, 정제도를 조금 더 개선할 경우 유용한 천연항산화제로 사료된다
- , 2003). 이상의 결과에 서 뱀 장어 추출 camosine이 L-ascorbic acid와 비슷한 산화억제능을 가진 것으로 나타나 향후 천연항산화제로서의 이용가능성이 높다고 판단된다.
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