환경호르몬에 의해 유도된 인체 유방암세포의 증식에 대한 당귀로부터 분리한 Decursin 억제효과 Anti-Proliferation Effects of Decursin from Angelica gigas Nakai in the MCF-7 Cells Treated with Environmental Hormones원문보기
당귀로부터 분리한 decursin을 환경호르몬에 의해 증식을 유도한 인체 유방암세포(MCF-7)에 처리한 후 그 억제효과를 조사하였다. 인체 유방암세포주인 MCF-7은 20, 40, 60, 80 및 100 ${\mu}g/mL$ 농도로 decursin의 처리 시 20 ${\mu}g/mL$ 이상에서 농도 의존적으로 그 증식이 억제되었다. 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 0, 0.01, 0.1 및 1 ${\mu}M$의 농도로 환경 호르몬 $17{\beta}$-estradiol과 bisphenol을 처리한 결과 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 비해 세포의 증식을 유도하였으며, Yamada(21)와 본 실험 결과가 유사한 세포성장을 보여 암세포의 성장억제 효과를 측정하기 위한 환경호르몬의 농도를 0.1 ${\mu}M$로 하였다. 환경호르몬에 의해 증식이 유도된 MCF-7 세포에 당귀 메탄올추출물 및 decursin을 1, 3, 10 및 30 ${\mu}g/mL$ 농도로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포의 증식을 억제하였으며, 10 ${\mu}g/mL$의 농도 이상에서는 대조구의 증식보다도 낮은 생존율을 나타내어 강한 세포독성을 나타내었다. 또한 hoechst 염색을 통하여 세포 핵의 변화를 알아본 결과 decursin 처리군에서 핵의 응축과 apoptic body가 관찰되어 decursin은 apoptosis를 유도함으로써 환경호르몬이 처리된 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 판단된다. 이들 결과는 decursin이 환경호르몬에 의해 증식이 유도되는 MCF-7 세포의 성장을 apoptosis에 의해 억제한다는 것을 나타낸다.
당귀로부터 분리한 decursin을 환경호르몬에 의해 증식을 유도한 인체 유방암세포(MCF-7)에 처리한 후 그 억제효과를 조사하였다. 인체 유방암세포주인 MCF-7은 20, 40, 60, 80 및 100 ${\mu}g/mL$ 농도로 decursin의 처리 시 20 ${\mu}g/mL$ 이상에서 농도 의존적으로 그 증식이 억제되었다. 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 0, 0.01, 0.1 및 1 ${\mu}M$의 농도로 환경 호르몬 $17{\beta}$-estradiol과 bisphenol을 처리한 결과 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 비해 세포의 증식을 유도하였으며, Yamada(21)와 본 실험 결과가 유사한 세포성장을 보여 암세포의 성장억제 효과를 측정하기 위한 환경호르몬의 농도를 0.1 ${\mu}M$로 하였다. 환경호르몬에 의해 증식이 유도된 MCF-7 세포에 당귀 메탄올추출물 및 decursin을 1, 3, 10 및 30 ${\mu}g/mL$ 농도로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포의 증식을 억제하였으며, 10 ${\mu}g/mL$의 농도 이상에서는 대조구의 증식보다도 낮은 생존율을 나타내어 강한 세포독성을 나타내었다. 또한 hoechst 염색을 통하여 세포 핵의 변화를 알아본 결과 decursin 처리군에서 핵의 응축과 apoptic body가 관찰되어 decursin은 apoptosis를 유도함으로써 환경호르몬이 처리된 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 판단된다. 이들 결과는 decursin이 환경호르몬에 의해 증식이 유도되는 MCF-7 세포의 성장을 apoptosis에 의해 억제한다는 것을 나타낸다.
Anti-proliferation effects of decursin from Angelica gigas Nakai were investigated in the MCF-7 cells treated with environmental hormones. The proliferation was decreased in a dose-dependent manner at the concentration over 20 ${\mu}g/mL$ in the MCF-7 cells treated with decursin of variou...
Anti-proliferation effects of decursin from Angelica gigas Nakai were investigated in the MCF-7 cells treated with environmental hormones. The proliferation was decreased in a dose-dependent manner at the concentration over 20 ${\mu}g/mL$ in the MCF-7 cells treated with decursin of various concentrations. The environmental hormones such as $17{\beta}$-estradiol and bisphenol increased the growth of MCF-7 cells in the charcoal-treated FBS (cFBS) medium and the proliferation was the highest at 0.1 ${\mu}M$ among the tested hormone concentration. Decursin was predicted to inhibit the proliferation in a dose-dependent fashion at tested concentrations (1, 3, 10 or 30 ${\mu}g/mL$) in the MCF-7 cells added environmental hormones; however, the survival rate of the cells was lower than that of control cells that were not treated with decursin at 30 ${\mu}g/mL$ concentration. The chromatin condensation and apoptotic body were examined in the decursin treated cells cultured with the cFBS medium added environmental hormones. These results suggest that decursin decreased the proliferation through apoptosis in the MCF-7 cells added environmental hormones.
Anti-proliferation effects of decursin from Angelica gigas Nakai were investigated in the MCF-7 cells treated with environmental hormones. The proliferation was decreased in a dose-dependent manner at the concentration over 20 ${\mu}g/mL$ in the MCF-7 cells treated with decursin of various concentrations. The environmental hormones such as $17{\beta}$-estradiol and bisphenol increased the growth of MCF-7 cells in the charcoal-treated FBS (cFBS) medium and the proliferation was the highest at 0.1 ${\mu}M$ among the tested hormone concentration. Decursin was predicted to inhibit the proliferation in a dose-dependent fashion at tested concentrations (1, 3, 10 or 30 ${\mu}g/mL$) in the MCF-7 cells added environmental hormones; however, the survival rate of the cells was lower than that of control cells that were not treated with decursin at 30 ${\mu}g/mL$ concentration. The chromatin condensation and apoptotic body were examined in the decursin treated cells cultured with the cFBS medium added environmental hormones. These results suggest that decursin decreased the proliferation through apoptosis in the MCF-7 cells added environmental hormones.
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문제 정의
그 약효에 관한 것이 많다. 그 주요 약효성분으로는 참당귀의 건조 근 및 과실에서 분리된 coumarin유도체인 de- cursin, decursinol 등이 보고되고 있으나(15, 16), 환경호르몬과 관련된 연구에 대하여는 아직까지 보고된 바가 없다, 따라서 본 연구에서는 estrogen 수용체 양성 인 MCF-7 세포를 사용하여 체내에서 estrogen과 유사하게 작용하는 환경호르몬인 170-estradiol과 bisphenol을 처리하여 환경호르몬에 의해 유도되어진 유방암세포의 증식 에 대한 de- cursin 및 decursin 함유 당귀 추출물의 억제 효과를 조사하고자 하였다.
제안 방법
관찰하였다. MCF-7 세포에 각각의 환경호르몬과 decursin을 농도별로 처 리하고 72시간 동안 반응시 킨 후 hoechst 용액 (5 iig/mL)으로 염색하고 형광현미경 (BH2- BH2-RPL-T3, Olympus optical Co. Ltd., Japan)을 이용하여 핵의 형태변화를 정상군과 비교하였다.
5% methanol 4 L와 혼합하여 80℃ 환류냉각 추출을 3시간 동안 3회 반복한 후 그 여 액을 감압 농축하였다. 그 다음 HaO와 methylene chloride(l:3)를 각각 300대 1, 200 m丄씩 분획여두에 넣고 실온에서 3시간, 3회 반복하여 분획한 후 methylene chloride 층을 취하혀 농축하였다. 이를 S1O2 column chromatog- raphy하여 hexane : ethyl acetate(30:l, 25:1, 20: 1, 15:1, 10:l, 5:1, 1:1)로 순차적으로 fraction 5번을 취한 후, 匸+시 column chromatography하여 fraction 30번에서 decursin을 분리하였다 (Fig.
당귀로부터 분리한 decursin을 환경호르몬에 의해 증식을 유도한 인체 유방암세포(MCF-7)에 처리한 후 그 억제 효과를 조사하였다. 인체 유방암세포주인 MCF-7은 20, 40, 60, 80 및 100 pg/mL 농도로 decursin의 처리 시 20 pg/rnL 이상에서 농도 의존적으로 그 증식이 억제되었다.
1 11M의 농도에서 세포의 성장을 상당히 증가시켰다. 따라서 본 실험결과를 바탕으로 환경호르몬에 의한 암세포의 성장억제 효과를 측정하기 위해 bis- phenol과 170-estradiol 각각 환경호르몬의 농도를 0.1 pM 로 하였다.
이를 SiO? open column chromatography흐卜여 fraction 5번을 취한 후, 다시 open column chromatography하여 fraction 30번 에서 분리 하였다. 분리된 단일 화합물의 구조분석은 NMR spectrometer (Bruker, AW500)를 사용하여 'H, 13C-NMR 스펙트럼과 Mass spectrometer(JMS, DX300)을 이용하여 EI-MS를 측정 하였고, 기존 문헌(18)의 측정값과 비교하여 구조를 분석하였다.
유방암 세포주인 MCF-7에 대한 당귀의 추출물 및 분리정제물질의 억제효과를 조사하기 위해 각각 20, 40, 60, 80 Ug/mL 농도로 처리하고 24시간 배양한 후 암세포 성장억제 효과를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 당귀의 추출물 및 분리정제 물질은 처리 농도에 의 존적 으로 암세 포의 성 장을 억 제하는 경향을 나타내었다.
유방암(MCF-7) 세포에 환경호르몬과 각 시료를 다양한 농도로 처리하고 72시간 반응시킨 후 위상차 현미경 (Diaphot 300, Nikon, Japan)을 이용하여 대조군과 시료처리군의 형태학적 변화를 비교 관찰하였다.
그 다음 HaO와 methylene chloride(l:3)를 각각 300대 1, 200 m丄씩 분획여두에 넣고 실온에서 3시간, 3회 반복하여 분획한 후 methylene chloride 층을 취하혀 농축하였다. 이를 S1O2 column chromatog- raphy하여 hexane : ethyl acetate(30:l, 25:1, 20: 1, 15:1, 10:l, 5:1, 1:1)로 순차적으로 fraction 5번을 취한 후, 匸+시 column chromatography하여 fraction 30번에서 decursin을 분리하였다 (Fig. 1).
5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 혈청에 함유된 세포증식인자를 제거한 charcoal 처리 FBS를 1% 함유한 phenol free RPMI1640 배지를 well에 가하고 세포를 37℃, 5.5% COz incubator에서 10분간안정화시켰다.
환경호르몬에 의해 유도된 인체 유방암세포주의 세포증식 억제에 있어 decursin의 활성과 세포사멸의 관련성을 알아보기 위해 bis-benzimide(Hoechst 33258) 염색 후 핵의 형태 변화를 관찰하였다. MCF-7 세포에 각각의 환경호르몬과 decursin을 농도별로 처 리하고 72시간 동안 반응시 킨 후 hoechst 용액 (5 iig/mL)으로 염색하고 형광현미경 (BH2- BH2-RPL-T3, Olympus optical Co.
대상 데이터
사용된 배지는 RPMI1640 배양액으로-1。% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 후 37℃, 5.5% CO2 incubator에서계대 배양하여 실험에 사용하였다. Monolayer로 자란 암세포 주를 0.
본 실험에 사용된 당귀 (Angelica gigas Nakai)는 경북 영천에서 수확한 것을 순천 지역의 한약 도매 건재상에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
Data values are expressed as mean ± SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at **p<0.01 by Student t-test.
Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at *, p<0.01 by Student t-test.
각 실험군을 대조군에 대한 백분율에 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증(17)은 Students t-test를 이용하였다.
실험결과는 3반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율에 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증(17)은 Students t-test를 이용하였다.
성능/효과
10에 나타내었다. 1% cFBS control에 비해 환경호르몬인 0.1 pM bisphenol과 17P-estradiol control의 경우 세포증식이 이루어짐을 알 수 있었다. 당귀 추출물인 decursin을농도별 처리했을 때 1과 3 uM의 농도에서는 세포사멸 없이 세포증식을 억제함을 확인할 수 있었으며 10과 30 uM의 고농도에서는 세포사멸을 유도하여 세포의 증식을 억제하였다.
3에 나타내었다. FBS 첨가군은 농도와 시간에 비례하여 MCF-7 세포의 증식이 증가하는 반면 charcoal 처리된 FBS의 경우는 1%보다 5%와 10%가 MCF-7 세포의 증식을 증가시켰으나 유의적인 변화가 없었다.
환경호르몬을 첨가하지 않은 1% cFBS controle 세포의 성장이 거의 이루어지지 않았지만 환경호르몬이 첨가된 호르몬 control군의 경우는 1% cFBS control 군의 2배 정도의 세포 증식을 보였다. 농도별로 처리한 당귀추출물의 경우는 methanol 추출물, fraction 5, decursin 모두에서 1, 3 ug/mL의 농도에서 환경호르몬에 의해 유도된 암세포의 증식을 억제하였으며 10, 30 iig/mL의 고농도에서는 세포사멸을 통해 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 광학현미경을 통한 세포의 형태학적 관찰(Fig.
1 pM bisphenol과 17P-estradiol control의 경우 세포증식이 이루어짐을 알 수 있었다. 당귀 추출물인 decursin을농도별 처리했을 때 1과 3 uM의 농도에서는 세포사멸 없이 세포증식을 억제함을 확인할 수 있었으며 10과 30 uM의 고농도에서는 세포사멸을 유도하여 세포의 증식을 억제하였다. 이는 환경호르몬에 의해 유도된 유방암세포의 증식에 있어 당귀로부터 정제된 화합물의 암세포 증식억제 효과를 확인한 상기의 실험들과 일치하는 것으로 보인다.
2와 같다. 당귀의 추출물 및 분리정제 물질은 처리 농도에 의 존적 으로 암세 포의 성 장을 억 제하는 경향을 나타내었다. 특히 정제된 화합물 decursine 추출물에 비하여 월등히 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며 60 ug/mL의 농도로 처리시 90% 이상의 암세포 성장억제 효과를 나타냈다.
환경호르몬에 의해 증식 이 유도된 MCF-7 세포에 당귀 메탄올추출물 및 decursin을 1, 3, 10 및 30 pg/mL 농도로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포의 증식을 억제하였으며, 10 ug/mL의 농도 이상에서는 대조 구의 증식보다도 낮은 생존율을 나타내어 강한 세포독성을 나타내었다. 또한 hoechst 염색을 통하여 세포 핵의 변화를 알아본 결과 decursin 처리군에서 핵의 응축과 apoptic body 가 관찰되어 decursine apoptosis를 유도함으로써 환경 호르몬이 처리된 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 판단된다. 이들 결과는 decursin이 환경호르몬에 의해 증식이 유도되는 MCF-7 세포의 성장을 apoptosis에 의해 억제한다는 것을 나타낸다.
농도별로 처리한 당귀추출물의 경우는 methanol 추출물, fraction 5, decursin 모두에서 1, 3 ug/mL의 농도에서 환경호르몬에 의해 유도된 암세포의 증식을 억제하였으며 10, 30 iig/mL의 고농도에서는 세포사멸을 통해 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 광학현미경을 통한 세포의 형태학적 관찰(Fig. 8과 Fig. 9)에서도 당귀추출물이 환경호르몬에 의해 유도된 암세포의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.
9~72%의 억제율을 보고하였다. 이는 이전의 연구 결과 및 본 실험결과를 종합하여 볼 때 decursin이 암세포의 성장을 억제하는 것으로 사료된다.
또한 hoechst 염색을 통하여 세포 핵의 변화를 알아본 결과 decursin 처리군에서 핵의 응축과 apoptic body 가 관찰되어 decursine apoptosis를 유도함으로써 환경 호르몬이 처리된 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 판단된다. 이들 결과는 decursin이 환경호르몬에 의해 증식이 유도되는 MCF-7 세포의 성장을 apoptosis에 의해 억제한다는 것을 나타낸다.
유의적인 변화가 없었다. 이상의 결과를 종합하여 charcoal 처리 FBS의 농도는 1%로 하였다.
당귀의 추출물 및 분리정제 물질은 처리 농도에 의 존적 으로 암세 포의 성 장을 억 제하는 경향을 나타내었다. 특히 정제된 화합물 decursine 추출물에 비하여 월등히 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며 60 ug/mL의 농도로 처리시 90% 이상의 암세포 성장억제 효과를 나타냈다.
인체 유방암세포주인 MCF-7은 20, 40, 60, 80 및 100 pg/mL 농도로 decursin의 처리 시 20 pg/rnL 이상에서 농도 의존적으로 그 증식이 억제되었다. 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 0, 0.01, 0.1 및 1 pM의 농도로 환경호르몬 170-estradiol과 bisphenol을 처리한 결과 호르몬이 제거된 배지로 배양한 세포에 비해 세포의 증식을 유도하였으며, Yamada(21)와 본 실험 결과가 유사한 세포성장을 보여 암세포의 성장억제 효과를 측정하기 위한 환경호르몬의 농도를 0.1 uM로 하였다. 환경호르몬에 의해 증식 이 유도된 MCF-7 세포에 당귀 메탄올추출물 및 decursin을 1, 3, 10 및 30 pg/mL 농도로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포의 증식을 억제하였으며, 10 ug/mL의 농도 이상에서는 대조 구의 증식보다도 낮은 생존율을 나타내어 강한 세포독성을 나타내었다.
1 uM로 하였다. 환경호르몬에 의해 증식 이 유도된 MCF-7 세포에 당귀 메탄올추출물 및 decursin을 1, 3, 10 및 30 pg/mL 농도로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포의 증식을 억제하였으며, 10 ug/mL의 농도 이상에서는 대조 구의 증식보다도 낮은 생존율을 나타내어 강한 세포독성을 나타내었다. 또한 hoechst 염색을 통하여 세포 핵의 변화를 알아본 결과 decursin 처리군에서 핵의 응축과 apoptic body 가 관찰되어 decursine apoptosis를 유도함으로써 환경 호르몬이 처리된 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 판단된다.
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