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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 패류의 설사성 패류독소 함량에 관한 기초 자료를 얻을 목적으로 최신 분석 방법인 LC-MS/侦S에 의하여 국내 유통중인 일부 패류를 분석하였으며, 기존의 마우스 법 에 의하여서도 독성을 조사하여 설사성패류독 함유 여부를 검토하였다.
제안 방법
- LC-MS/MS법에 의하여 설사성 패류독소 7종(okadaic acid, dinophysistoxin-1, -3, pectebotoxin-1, -2, -6, yessotoxin)의 동시 분석 조건을 확립하였고, 2006년 3월부터 9월까지 매월 5종의 이매패(굴, 진주담치, 반지락, 가리비, 개조개, 6월부터 9월까지는 가리비 대신 피조개)를 정기적으로 통영시장에서 구입하여 분석하였으며, 기존의 마우스 검사법과 비교하였다. 마우스 검사법으로는 총 35종 시료 중 3월의 굴과 진주담치에서 0.
- LC/MS/MS 조건: 독소 분리를 위한 LC systeme Agilent 1100 series(AgiIent Tech., Palo Alto, CA, USA)에 Hypersil BDS~C8(50 mm x 2.1 mm I.D., Keystone Scientific, Bellefonte, PA, USA) 칼럼을, 7월부터 9월까지 시료는 Shodex RSpak DE413 2B(50 mm x 2.0 mm, I.D., Showa Denko., Tokyo, Japan) 칼럼을 사용하였고, 칼럼 온도는 35℃, autosampler 온도는 5℃로 유지하였다.
- MS/MS 장치는 Linear Ion Trap (LIT) Quadrupole 을 이용한 Applied Biosystems/MDS Q TRAP LC/MS/MS sys-tem(AB Sciex Ins., CA, USA)을 사용하였으며, ion source 로는 Turbo Ion Spray interface를 이용하여 각 7개 독소의 음이온들을 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode로 측정하였다. 이 때, 측정된 각 독소 성분들의 분자 이온 및 fragment ion들의 m/z는 Table 1과 같다.
- Okadaic acid(OA), dinophysistoxin-1 (DTX1), dinophy-sistoxin-3(DTX3), pectenotoxin(PTXl, PTX2, PTX6), yessotoxin(YTX) 등 7개의 표준품 독소는 일본 식품분석센터 (JFRL)에서 정제하여 제공한 것을 각 독소의 농도가 0.1 pg/100 mL 되도록 희석하여 1회에 5 11L씩 주입하였다. DTX3은 DTX1의 7위의 탄소에 palmitic acid가 ester 결합한 것을 사용하였다.
- 상층의 ether 층은 농축하고 1% tween 60 용액 에 단계별로 희석현탁 시켜 마우스에 복강 주사하여 24시간 이내에 치사 여부를 조사하였다(8). 마우스는 (주)오리엔트 바이오에서 구입한 strain이 검증된 ICR계 수컷 마우스(18~20 g)를 시험에 사용하였으며, 시료당 3마리에 투여하여 2마리 이상 치사한 것을 1 MU로 계산하였다.
- 1에 나타내었으며, 칼럼을 Shodex 칼럼으로 바꾸었을 경우는 시간을 3분 정도 단축할 수 있었다. 여기서는 각 독소별 음이온 분자와 fragment 이온을 동시에 matching하여 검출하도록 하여 MRM mode에서 측정한 것을 각각 별도의 chromatogram으로 나타내었다.
- 이동상 용매: 용매 A(2 mM NH4COOH+50 mM HCOOH, pH 2.3)와 용매 B(2 mM NH4COOH+50 mM HCOOH in 95% CH3CN, pH 2.3)를 각각 조제하여 초음파 및 수류 펌프로 탈기하였다. 용매는 20% B 용매로 13분간평 형화 시킨 다음, 시료 주입 후 20% B 용매를 100%까지 10분간 흘리고, 100% B 용매로 15분간 더 용출시켰다.
대상 데이터
- 2006년 3월부터 5월까지는 양식산 굴(Crassostrea gigas), 진주담치 edulis) 및 자연산 바지락CRuditapes philiphinanarum), 개조개 (Saxicfomus purpulatus) 및 7].리 h] {Patinopecten yessoensis) 등 5종을 6월부터 9월까지 는가리 비 대 신 꼬막조개 granosa)를 넣 어 5종을 매월 25일을 전후로 통영시 수산시장에서 껍질채로 살아있는 것 또는 가식부만을 취하여 신선한 상태로 판매 중인 것을구입 하여 실험실로 운반 후, 가식부를 마쇄하여 -20℃의 냉동고에 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
- 3월부터 9월까지 매월 패류를 5종씩(총 35점) 구입하여마우스 시험법에 의한 설사성 패류독을 조사한 것을 Table 2에 나타내었다. 일본에서의 기준치인 0.
- 1 pg/100 mL 되도록 희석하여 1회에 5 11L씩 주입하였다. DTX3은 DTX1의 7위의 탄소에 palmitic acid가 ester 결합한 것을 사용하였다.
- 7].리 h] {Patinopecten yessoensis) 등 5종을 6월부터 9월까지 는가리 비 대 신 꼬막조개 granosa)를 넣 어 5종을 매월 25일을 전후로 통영시 수산시장에서 껍질채로 살아있는 것 또는 가식부만을 취하여 신선한 상태로 판매 중인 것을구입 하여 실험실로 운반 후, 가식부를 마쇄하여 -20℃의 냉동고에 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
- 상층의 ether 층은 농축하고 1% tween 60 용액 에 단계별로 희석현탁 시켜 마우스에 복강 주사하여 24시간 이내에 치사 여부를 조사하였다(8). 마우스는 (주)오리엔트 바이오에서 구입한 strain이 검증된 ICR계 수컷 마우스(18~20 g)를 시험에 사용하였으며, 시료당 3마리에 투여하여 2마리 이상 치사한 것을 1 MU로 계산하였다.
이론/모형
- 시료의 전처리: Suzuki 등의 방법(17)에 준하여 마쇄한가식부 1 g 에 9 mL의 90% methanol을 가하고 2~3분간 mixer로 격 렬히 흔들어 독소를 추출한 다음, 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액 일부를 LC-MS/MS에 주입하여 분석하였다.
성능/효과
- Peak의 재현성을 나타내는 상대 표준편차(% RSD)는 100 ng/mL의 표준품을 시료 5회 분석 시 마다 주입하여 검출된 독소 peak의 면적으로부터 계산한 결과, LC-MS와 비슷하여(17) 가장 큰 것이 0A의 11.9%이었다. 최소 검출 한계는 독소에 따라 다소 달랐으나, DTX1 이 5 ng/g(가식부), 감도가 가장 낮은 낮은 PTX6의 경우도 50 ng/g(가식부)까지 검출이 가능하였다.
- 검출 모드는 LC-MS 에 의하여 OA와 DTX1에 대하여는 양이온 모드에서 분석하는 것이 훨씬 감도가 좋았으나, YTX의 경우 [M-2Na+3H]* 이온의 감도가 낮아 실제로 사용하기 곤란하였으며 , DTX3의 경우는 matrix의 영향을 많이 받아 모든 독소를 동시에 분석하기에는 음이온 모드로 하는 것이 효과가 좋았다. 또, PTX6의 경우, [M-H]' 이온보다는 [M+HCOOH-HT 이온의 재현성이 우수하였다.
- 또, PTX6의 경우, [M-H]' 이온보다는 [M+HCOOH-HT 이온의 재현성이 우수하였다. 따라서, OA나 DTX1 등 일부 성분만 분석할 경우는 성분에 따라 양이온 모드로 바꾸어 측정하는 것이 좋을 것으로 생각되었다.
- 2에 같이 나타내었다. 마우스 검사법 에 의하여 기준치를 초과하는 0.05-0.1 MU/g의 독성을 나타낸 3월 굴과 진주 담치에서는 설사성 패류독 중 어느 것도 검출되지 않아 이미 알려져 있는 설사성 패류독 중 어느 것도 검출되지 않아 이들 설사성 패류독들은 함유되어 있지 않은 것으로 확인되었다.
- 비교하였다. 마우스 검사법으로는 총 35종 시료 중 3월의 굴과 진주담치에서 0.05~0.1 MU/g의 독성을 나타내었으나, 이미 알려진 설사성 패류독소는 전혀 검출되지 않아 다른 성분에 의한 것으로 판단되었다. 한편, LC-MS/MS 법에 의하여서는 6월 진주담치 에서 dinophysistoxin-1 (DTX1) 이 0.
- 시료의 전처리는 간단하여 마쇄 시료를 9배량의 90% methanol로 추출하여 여과하는 것만으로도 충분하였으며, 모든 독소를 30분 이내에 동시 분석이 가능하였다.
- 5 ng이지 만 동시에 검줄이 가능하였으며, 용출 순서는 극성 에 따라 YTX=PTX1>PTX6>OA>PTX2>DTX1>DTX3 의 순으로 용출되었다. 용출 시간은 DTX3을 제외한 6개의 성분들이 10.9분에서 12.9분의 2분 사이에 모두 용출되 었으며, 특히 YTX와 PTX1은 동일 시간에 용출되었다. 그러나, 분자량 차를 이용한 SIM으로 검출하기 때문에 동일 시간에 용출되더라도 정량 분석에는 전혀 문제가 되지 않았다.
- 이상의 결과, 이미 알려져 있는 설사성 패류독의 여러 가지 독성분들은 LC-MS/MS를 이용한다면, 간단한 전처리를 통하여 고감도로 단시간내에 동시 분석이 가능한 것이 밝혀졌다. 그러나, 아직까지 우리나라에서는 설사성 패류독의 발생 빈도가 낮고, 함량도 적어 이에 의한 식중독이 발생하거나 양식 산업에 심각한 영향은 주지 않고 있다.
- 표준품 혼합 용액 주입량이 5 hL이므로 실제 독소는 각각 0.5 ng이지 만 동시에 검줄이 가능하였으며, 용출 순서는 극성 에 따라 YTX=PTX1>PTX6>OA>PTX2>DTX1>DTX3 의 순으로 용출되었다. 용출 시간은 DTX3을 제외한 6개의 성분들이 10.
후속연구
- 그러나, 아직까지 우리나라에서는 설사성 패류독의 발생 빈도가 낮고, 함량도 적어 이에 의한 식중독이 발생하거나 양식 산업에 심각한 영향은 주지 않고 있다. 그러나, 계절에 따라서는 유독성 플랑크톤이 연안에 출현하고 있기 때문에 국내산 패류의 안전성을 확보하기 위하여서는 지속적인 모니터링을 통하여 자료를 확보하고 기준치 설정과 분석 방법을 확립하여야 할 것이다.
- 있다. 따라서, 마우스가 치사하는 것만으로는 설사성 패류독에 의한 것이라고 단정하기가 어려우며, 독소 성분별 정량 분석이 가능한 방법에 의한 추가적인 확인이 필요하다.
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