히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포 분화와 세포주기 조절인자의 발현에 미치는 영향 Effects of Histone Deacetylase Inhibitor, Trichostatin A, on the Differentiation of C2C12 Myoblasts and the Expression of Cell Cycle Regulators원문보기
본 연구는 분화 전단계인 C2C12 myoblast세포에 중요한 후천적 기작의 하나인 DNA 히스톤 단백질의 아세틸화를 조절하였을 때 일어나는 변화를 살펴본 결과, 히스톤 탈아세틸화 효소를 trichostatin A로서 억제시키자 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화하였다. 이는 immunofluorescentstaining을 통해 smooth muscle ${\alpha}-actin$의 발현 증가를 trishostatin A로 처리한 세포에서 관찰하였으며, DAPI 염색을 통해 대조군 세포와 비교하여 세포의 증식이 많이 억제됨을 관찰하였다. 또한 real-time PCR 결과는 smooth muscle ${\alpha}$-actin과 transgelin mRNA의 발현이 trichostatin A 처리군 세포에서 현저히 증가함을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 히스톤 단백질의 탈아세틸화 억제는 C2C12 myoblast 세포의 분화에 매우 중요한 역할을 하며, 또한 C2C12 myoblast 세포를 골격근인 다핵의 myotube로 분화시키지 않고, smooth muscle로 분화시킴을 알 수 있었다. 이것은 분명히 HDAC억제제 인 trichostatin A가 DNA 히스톤 단백질의 HDAC 효소에 의한 탈아세틸화를 강력히 억제하고, 이러한 HDAC효소의 억제는 세포주기에 있어서 증식과 분화를 조절하는 유전자들의 발현을 조절하였음을 시사한다. 이를 검증하기 위해 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin Dl mRNA의 발현을 조사한 결과 세포를 증식단계로 진행하는데 있어서 필수적인 cdk 억제제인 p21 mRNA의 발현이 trichostatin A로 처리한 세포에서 현저히 증가함을 보였으며, 세포 증식을 유도하는 cyclin Dl mRNA의 발현은 trichostatin A를 처 리 한 후 24시간 후 유의하게 감소함을 보였는데 이는 trichostatin A가 세포증식을 억제하는 초기단계에서 cyclin Dl 유전자의 발현을 조절함을 보여준다. 향후 연구에서는 또 하나의 중요한 후천적 기작인 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화가 유전자 발현을 조절하는데 있어서 상호작용에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
본 연구는 분화 전단계인 C2C12 myoblast세포에 중요한 후천적 기작의 하나인 DNA 히스톤 단백질의 아세틸화를 조절하였을 때 일어나는 변화를 살펴본 결과, 히스톤 탈아세틸화 효소를 trichostatin A로서 억제시키자 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화하였다. 이는 immunofluorescentstaining을 통해 smooth muscle ${\alpha}-actin$의 발현 증가를 trishostatin A로 처리한 세포에서 관찰하였으며, DAPI 염색을 통해 대조군 세포와 비교하여 세포의 증식이 많이 억제됨을 관찰하였다. 또한 real-time PCR 결과는 smooth muscle ${\alpha}$-actin과 transgelin mRNA의 발현이 trichostatin A 처리군 세포에서 현저히 증가함을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 히스톤 단백질의 탈아세틸화 억제는 C2C12 myoblast 세포의 분화에 매우 중요한 역할을 하며, 또한 C2C12 myoblast 세포를 골격근인 다핵의 myotube로 분화시키지 않고, smooth muscle로 분화시킴을 알 수 있었다. 이것은 분명히 HDAC억제제 인 trichostatin A가 DNA 히스톤 단백질의 HDAC 효소에 의한 탈아세틸화를 강력히 억제하고, 이러한 HDAC효소의 억제는 세포주기에 있어서 증식과 분화를 조절하는 유전자들의 발현을 조절하였음을 시사한다. 이를 검증하기 위해 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin Dl mRNA의 발현을 조사한 결과 세포를 증식단계로 진행하는데 있어서 필수적인 cdk 억제제인 p21 mRNA의 발현이 trichostatin A로 처리한 세포에서 현저히 증가함을 보였으며, 세포 증식을 유도하는 cyclin Dl mRNA의 발현은 trichostatin A를 처 리 한 후 24시간 후 유의하게 감소함을 보였는데 이는 trichostatin A가 세포증식을 억제하는 초기단계에서 cyclin Dl 유전자의 발현을 조절함을 보여준다. 향후 연구에서는 또 하나의 중요한 후천적 기작인 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화가 유전자 발현을 조절하는데 있어서 상호작용에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
The purpose of this study was to determine the modulating effects of histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, on the differentiation of mouse C2C12 myoblasts. We demonstrated that trichostatin A induced morphological changes of C2C12 myoblasts into smooth muscles and significantly increased th...
The purpose of this study was to determine the modulating effects of histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, on the differentiation of mouse C2C12 myoblasts. We demonstrated that trichostatin A induced morphological changes of C2C12 myoblasts into smooth muscles and significantly increased the gene expression of smooth muscle markers including smooth muscle ${\alpha}-actin$ and transgelin. These results were due to the change in the expression level of cell cycle regulators in trichostatin A-treated C2C12 cells. Real-time PCR data revealed that cyclin dependent kinase inhibitor, p21, mRNA expression was significantly increased in trichostatin A-treated C2C12 cells. However, trichostaDn A rapidly decreased cyclin Dl mRNA expression necessary for cell cycle progression in 24hr after treatment. In conclusion, the strong inhibitory effects of trichostatin A on histone deacetylation induced transdifferentiation of C2C12 myoblasts into smooth muscle cells and these results are partly due to the changes in the expression of cell cycle regulators such as p21 and cyclin D1.
The purpose of this study was to determine the modulating effects of histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, on the differentiation of mouse C2C12 myoblasts. We demonstrated that trichostatin A induced morphological changes of C2C12 myoblasts into smooth muscles and significantly increased the gene expression of smooth muscle markers including smooth muscle ${\alpha}-actin$ and transgelin. These results were due to the change in the expression level of cell cycle regulators in trichostatin A-treated C2C12 cells. Real-time PCR data revealed that cyclin dependent kinase inhibitor, p21, mRNA expression was significantly increased in trichostatin A-treated C2C12 cells. However, trichostaDn A rapidly decreased cyclin Dl mRNA expression necessary for cell cycle progression in 24hr after treatment. In conclusion, the strong inhibitory effects of trichostatin A on histone deacetylation induced transdifferentiation of C2C12 myoblasts into smooth muscle cells and these results are partly due to the changes in the expression of cell cycle regulators such as p21 and cyclin D1.
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문제 정의
하지만 본 연구에서는 mouse 골격근 C2C12 myoblast 세포를 분화 배지로 유도하지 않은 상태에서 trichostatin A가 C2C12 세포에 미치는 영향에 초점을 두었다. 따라서 구체적인 본 연구의 목적은 강력 한 HDAC 억 제 제 인 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 증식과 분화에 어떠한 영향을 미치는지 세포주기 조절인자를 중심으로 살펴보는데 있다.
trichostatin A를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 형태학적으로 세포의 증식이 trichostatin A의 농도가 높아질수록 더욱 억제되는 것을 현미경상에서 뚜렷이 볼 수 있었으며, 또한 세포가 분화될 때의 특징인 길어짐(elongation)과 주위의 다른 세포들과의 융합(fusion) 현상이 일어났으며, smooth muscle의 전형적인 형태로 분화되었다. 또한 본 연구에서는 유전자의 직접적인 발현을 통해 smooth muscle로의 분화를 검증하기 위해 smooth muscle의 지표로 널리 쓰이는 smooth muscle a-actin과 transgelin mRNA의 변화를 살펴보았다. Trichostatin A는 농도 의존적 (concentration-dependent)으로 smooth muscle a-actin과 transgelin mRNA의 발현을 최대 약 6배, 13배 정도 각각 증가시켰다.
본 연구에서 real-time PCR을 이용하여 trichostatin A을처리한 C2C12 myoblast 세포에서 이들 유전자의 mRNA 변화를 살펴보았다.
본 연구에서는 HDAC 억제제인 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 분화를 촉진시켰는데, 이러한 결과는 세포주기 조절인자 유전자의 변화에 의해 세포의 증식이 억제되는 동시에 분화가 촉진되었음을 시사한다. 이를 검증하기 위하여 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin D1 유전자의 발현 변화를 알아보았다.
히스톤 아세틸화는 일반적으로 유전자 발현이 활성화된 경우에 일어나며, HDAC 효소에 의한 탈 아세틸화는 유전자의 발현을 억제시킨다[12, 14]. 본 연구에서는 이러한 특정 유전자의 발현을 조절하는 기능이 있는 히스톤 구조의 재편성을 HDAC 효소 억제제인 trichostatin A를 이용하여 C2C12 myoblast 세포에 유도하였을 때 일어나는 유전자의 발현과 세포의 변화를 살펴보았다.
제안 방법
본 실험에서 사용한 primer sequences는 표 1에 나타난 바와 같다. SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(PE Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며, 각각의 target mRNA 의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.
Trans gelin, smooth muscle a-actin, p21z cyclin DI messenger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, doublestranded DNA dye 인 SYBR Green(Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다. PCR 조건은 총 4 단계로 구성되어 있으며, 1 단계는 50℃, 2분으로 1 cycle이며, 2 단계는 95℃, 10분이며, 3 단계는 총 30 cycles의 95℃, 15초와 60℃, 1분으로 구성되었다.
5, 125 nM)의 trichostatin A을 처 리하여 3일 동안 배양하였다. Trichostatin A 처리 시간에 따른 세포 형태와 유전자 발현의 변화를 살펴보기 위하여 세포를 2 ml당 2xl04 세포를 분주하고 24시간 후 62.5 nM의 trichostatin A를 24, 48, 72시간 동안 처리한 후 대조군과 비교하였다. 모든 실험은 똑같은 조건의 세포 3 세트를 구성하여 실시하였다.
7% formaldehyde(pH 7-8)를 함유하고 있는 PBS 1 ml를 각각의 well에 10분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 고정된 세포를 헹군 후 02% trinton X・100과 10% goat serum 을 포함하고 있는 PBS로 상온에서 15분간 처리하여 세포를 penneabilizatioii했다. 다음은 C2C12 myoblast 세포에 mouse IgG monoclonal smooth muscle a-actin primary 항체 (Sigma, St.
대조군과 trichostatin A로 처리된 세포를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen/ Valencia, CA)을 이용하여 추출하였다. 그 다음 추출된 RNA를 ultrapure waters] 용해시 킨 후 ultra- violet(UV) 260 nm에서 농도를 측정하였다.
본 연구는 분화 전단계인 C2C12 myoblast 세포에 중요한 후천적 기작의 하나인 DNA 히스톤 단백질의 아세틸화를 조절하였을 때 일어나는 변화를 살펴본 결과, 히스톤 탈 아세틸화 효소를 trichostatin A로서 억제시키자 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화하였다. 이는 immunofluorescent staining을 통해 smooth muscle a-actin의 발현 증가를 trish- ostatin A로 처리한 세포에서 관찰하였으며, DAPI 염색을 통해 대조군 세포와 비교하여 세포의 증식이 많이 억제됨을 관찰하였다.
5 μg/ml의 4//6-diainidmo-2phenylindole(DAPI)> 이용하여 세포를 염색한 후 PBS로 3번 헹궈내었다. 세포 배양 plate상에서의 smooth muscle a-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 체계를 갖춘 Axiovert 200 epifluorescence 현미경 (Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하여 관찰하였다.
CO, 의 incubator에서 배양하였다. 세포는 6 wells plate에서 배양하였으며, 각각의 30 mm well에 2 ml당 2xl04 세포를 분주하고 24시간 후 여러가지 농도(0, 8, 16, 31.3, 62.5, 125 nM)의 trichostatin A을 처 리하여 3일 동안 배양하였다. Trichostatin A 처리 시간에 따른 세포 형태와 유전자 발현의 변화를 살펴보기 위하여 세포를 2 ml당 2xl04 세포를 분주하고 24시간 후 62.
동시에 분화가 촉진되었음을 시사한다. 이를 검증하기 위하여 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin D1 유전자의 발현 변화를 알아보았다. Fig.
즉, trichostatin A가 C2C12 세포의 조절기전에 관여하는 중요한 유전자의 발현을 조절하여 세포의 증식을 억제함과 동시에 분화를 유도하는 기전이 활성화된 것으로 판단된다. 이를 검증하기 위하여 본 연구에서는 trichostatin A를 C2C12 세포에 처리한 후 세포주기 조절유전자인 p21과 cyclin DI mRNA의 변화를 살펴보았다. Cycline 세포주기 기전에 있어서 필수적인 구성요소로서 각각의 cycline cyclin dependent kinase(cdk) 단백질에 결합하여 활성화를 시킨다[24].
대부분의 연구들은 C2C12 myoblast 세포를 배양한 후 confluent 한 상태가 되면 분화 배지로 세포를 배양하여 myotube로 분화를 유도하였으며, 이 과정에서 일어나는 근육 형성과정의 분자적 기작을 연구하였다[4, 10, 16, 22]. 하지만 본 연구에서는 mouse 골격근 C2C12 myoblast 세포를 분화 배지로 유도하지 않은 상태에서 trichostatin A가 C2C12 세포에 미치는 영향에 초점을 두었다. 따라서 구체적인 본 연구의 목적은 강력 한 HDAC 억 제 제 인 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 증식과 분화에 어떠한 영향을 미치는지 세포주기 조절인자를 중심으로 살펴보는데 있다.
대상 데이터
Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배양 접시는 BioQone, Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, trichostatin A는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.
Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, trichostatin A는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
0) 통계 프로그램을 이용하여 처리하였다. 측정치는 평균±표준오차(Mean± SE) 로 표시하였으며, 그룹간의 비교를 위하여 one-way ANOVA 와 Tukey's post-hoc test를 실시하였으며, 통계적 유의수준은 a=.O5로 설정하였다.
성능/효과
7에 나타난 바와 같다. 62.5 nM의 trichostatin A 를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 24시간이 경과하자 cyclin DI mRNA가 50%이상 감소하였으며, 48시간 이후에는 급격히 감소되었던 cyclin DI mRNA가 대조군 수준으로 회복되었으며, 72시간 경과 후에도 큰 변화가 없이 대조군 수준으로 발현이 유지되었다.
6에서 보는 바와 같이 p21 mRNA의 발현은 시간이 경과할수록 농도가 높아질수록 대체적으로 증가하는 경향을 보였다. 72시간 trichostatin A를 처리하였을 때 p21 mRNA는 해당 농도에서 가장 높은 증가치를 나타내었으며 본 연구에서 사용한 가장 높은 농도의 trichostatin A(125 nM)를 72 시간동안 처리하였을 때 p21 mRNA는 약 15배 이상 유의하게 증가함을 보였다(p<.05).
C2C12 myoblast 세포를 plate에 분주를 한 후 24 시간이경과한 후 여러 농도의 trichostatin A(0, 8, 16, 31.3, 62.5, 125 nM)를 3일간 처리한 결과 smooth muscle a-actin mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 본 연구에서 사용한 가장 높은 농도인 125 nM의 trichostatin A를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 약 6배가량 유의하게 증가하였다(Fig. 2). Fig.
분화시켰다. trichostatin A를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 형태학적으로 세포의 증식이 trichostatin A의 농도가 높아질수록 더욱 억제되는 것을 현미경상에서 뚜렷이 볼 수 있었으며, 또한 세포가 분화될 때의 특징인 길어짐(elongation)과 주위의 다른 세포들과의 융합(fusion) 현상이 일어났으며, smooth muscle의 전형적인 형태로 분화되었다. 또한 본 연구에서는 유전자의 직접적인 발현을 통해 smooth muscle로의 분화를 검증하기 위해 smooth muscle의 지표로 널리 쓰이는 smooth muscle a-actin과 transgelin mRNA의 변화를 살펴보았다.
이는 immunofluorescent staining을 통해 smooth muscle a-actin의 발현 증가를 trish- ostatin A로 처리한 세포에서 관찰하였으며, DAPI 염색을 통해 대조군 세포와 비교하여 세포의 증식이 많이 억제됨을 관찰하였다. 또한 real-time PCR 결과는 smooth muscle a-actin 과 transgelin mRNA의 발현이 trichostatin A 처리군 세포에서 현저히 증가함을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 히스톤 단백질의 탈아세틸화 억제는 C2C12 myoblast 세포의 분화에 매우 중요한 역할을 하며, 또한 C2C12 myoblast 세포를 골격근인 다핵의 myotube로 분화시키지 않고, smooth muscle로 분화시킴을 알 수 있었다.
따라서 이러한 선행연구를 바탕으로 cyclin D1 은 세포가 증식 또는 분열할 수 있도록 하는데 있어서 매우 중요한 역할을 담당함을 알 수 있다. 본 연구에서 cyclin D1 mRNA의 발현은 62.5 nM의 trichostatin A를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 24시간이 경과하자 급격히 감소하여대조 군의 30% 정도에 미치지 않았다. 하지만 이렇게 감소된 cyclin DI mRNA의 발현은 48시간이 지난후 대조군과 차이가 나지 않았다.
1은 대조군과 trichostatin A를 3일간 처리한 C2C12 myoblast 세포를 smooth muscle a-actin(녹색)과 DAPI(푸른색) 항체로 이 중 염색한 후 형광 현미경으로 찍은 사진이다. 본 연구에서는 HDAC 억제제인 trichostatin A 31.3 nM을 C2C12 myoblast 세포에 3일간 처리한 결과 형태학적으로 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화함을 보였다 (Fig 1. c, d). 또한 이들 세포에서는 핵의 증가가 대조군 세포에 비해 많이 억제되었음을 보여주었다.
여러 농도의 trichostatin A(0, 8, 16, 31.3, 62.5, 125 nM)를 3일간 처리한 결과 또 하나의 주요 smooth muscle marker인 trangelin mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하여 최대 13배 이상 증가치를 보였다(Fig. 4).
smooth muscle로 분화하였다. 이는 immunofluorescent staining을 통해 smooth muscle a-actin의 발현 증가를 trish- ostatin A로 처리한 세포에서 관찰하였으며, DAPI 염색을 통해 대조군 세포와 비교하여 세포의 증식이 많이 억제됨을 관찰하였다. 또한 real-time PCR 결과는 smooth muscle a-actin 과 transgelin mRNA의 발현이 trichostatin A 처리군 세포에서 현저히 증가함을 보여주었다.
또한 real-time PCR 결과는 smooth muscle a-actin 과 transgelin mRNA의 발현이 trichostatin A 처리군 세포에서 현저히 증가함을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 히스톤 단백질의 탈아세틸화 억제는 C2C12 myoblast 세포의 분화에 매우 중요한 역할을 하며, 또한 C2C12 myoblast 세포를 골격근인 다핵의 myotube로 분화시키지 않고, smooth muscle로 분화시킴을 알 수 있었다. 이것은 분명히 HDAC 억제제인 trichostatin A가 DNA 히스톤 단백질의 HDAC 효소에 의한 탈아세틸화를 강력히 억제하고, 이러한 HDAC 효소의 억제는 세포주기에 있어서 증식과 분화를 조절하는 유전자들의 발현을 조절하였음을 시사한다.
이것은 분명히 HDAC 억제제인 trichostatin A가 DNA 히스톤 단백질의 HDAC 효소에 의한 탈아세틸화를 강력히 억제하고, 이러한 HDAC 효소의 억제는 세포주기에 있어서 증식과 분화를 조절하는 유전자들의 발현을 조절하였음을 시사한다. 이를 검증하기 위해 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin DI mRNA의 발현을 조사한 결과 세포를 증식단계로 진행하는데 있어서 필수적인 cdk 억제제인 p21 mRNA의 발현이 trichostatin A로 처리한 세포에서 현저히 증가함을 보였으며, 세포 증식을 유도하는 cyclin DI mRNA의 발현은 trichostatin A를 처리한 후 24 시간 후 유의하게 감소함을 보였는데 이는 trichostatin A가 세포증식을 억제하는 초기단계에서 cyclin D1 유전자의 발현을 조절함을 보여준다. 향후 연구에서는 또 하나의 중요한 후천적 기작인 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화가 유전자 발현을 조절하는데 있어서 상호작용에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
한다는 것을 나타낸다. 즉, trichostatin A가 C2C12 세포의 조절기전에 관여하는 중요한 유전자의 발현을 조절하여 세포의 증식을 억제함과 동시에 분화를 유도하는 기전이 활성화된 것으로 판단된다. 이를 검증하기 위하여 본 연구에서는 trichostatin A를 C2C12 세포에 처리한 후 세포주기 조절유전자인 p21과 cyclin DI mRNA의 변화를 살펴보았다.
처리 시간에 따른 trangelin mRNA 발현 변화를 보기 위해 C2C12 myoblast 세포에 62.5 nM의 trichostatin A를 24, 48, 72시간동안 각각 처리한 결과, 24시간 경과 후 trangelin mRNA의 발현이 25배 이상 급격히 증가하였으며, 48시간 이후부터는 대조군에 비해 여전히 증가된 발현을 보였지만 24시간에 비해 많이 감소하였다(Fig. 5).
후속연구
이를 검증하기 위해 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin DI mRNA의 발현을 조사한 결과 세포를 증식단계로 진행하는데 있어서 필수적인 cdk 억제제인 p21 mRNA의 발현이 trichostatin A로 처리한 세포에서 현저히 증가함을 보였으며, 세포 증식을 유도하는 cyclin DI mRNA의 발현은 trichostatin A를 처리한 후 24 시간 후 유의하게 감소함을 보였는데 이는 trichostatin A가 세포증식을 억제하는 초기단계에서 cyclin D1 유전자의 발현을 조절함을 보여준다. 향후 연구에서는 또 하나의 중요한 후천적 기작인 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화가 유전자 발현을 조절하는데 있어서 상호작용에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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