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문제 정의
- 이에 저자는 紫苑의 항산화 효능이 신경세포에 미치는 효과를 알아보기 위해 紫蒐 水抽出物을 이용하여 氏2에 의해 유도된 PC-12 세포주의 세포사를 관찰한 결과, 유의한 결과를 얻어 다음과 같이 보고하는 바이다.
- 3A). 紫苑 水抽出物에 의해 생존에 관여하는 항산화 효소인 catalase의 비율이 촉진되는지를 알기 위해 catalase효소 활성도를 조사하였다. 정상군, 정상군에 紫苑 水抽出物 처리군, 대조군에서는 각각 100%, 98±1.
- 이에 저자는 紫苑의 항산화 효능이 신경세포에 미치는 효과를 알아보기 위해 玦2에 의해 유도된 PC-12 세포주의 세포사에서 紫苑 水抽出物이 신경세포의 형태학적 변화, 농도별 생존율에 미치는 영향, catalase효소 활성도, peroxide 억제 및 GSH효소 활성도 등을 측정하였다.
제안 방법
- 세포사를 유도하기 위해 200pM 压。2로 처리한 PC-12 세포주를 1x103세포수로 6-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 紫苑 水抽出物을 25μ以 畝농도로 처리하고 6시간동안 배양하여 세포 사의 억제 유무를 관찰하였다. 세포사는 phase-constrast microscope의 200배율에서 세포사가 유도된 200 개정도 세포수를 촬영하여 관찰하였다.
- 관찰하였다. 세포사는 phase-constrast microscope의 200배율에서 세포사가 유도된 200 개정도 세포수를 촬영하여 관찰하였다.
- 20011M H2O2로 처리하여 세포사를 유도한 PC-12 세포주를 5, 10, 25 및 50ng/ni« 紫苑 水抽 出物을 처리하고 6시간 동안 배양한 후, 0.2% trypan blue를 PBS에 5분간 첨가하여 phase-contrast microscopy로 관찰하였다. 세포사를 유도한 세포는 적자색으로 관찰되고, 생존세포들은 무색으로 관찰되며, 생존세포수는 전체 세포수 200개에서 생존율을 즉정하였다.
- 세포생존율을 즉정하기 위해서 Denizot의 방법 26을 이용하였는데 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)가 생존 세포 수의 비율에 의해 미토콘드리아의 succinate dehydrogenase가 작용하여 무색에서 fbnnazan의 적자색 반응 정도를 확인하였다. PC-12세포주를 96-well plates에 3><103cells/well를 분주한 다음, 세포사를 유도하기 위해 20011M 氏2로 처리하였다.
- PC-12세포주를 96-well plates에 3><103cells/well를 분주한 다음, 세포사를 유도하기 위해 20011M 氏2로 처리하였다. 각각 5, 10, 25 및 50瞄血 紫苑 水 抽出物을 처리한 다음 6시간동안 배양하고 phosphate buffered saline과 0.
- PC-12세포주를 96-well plates에 3><103cells/well를 분주한 다음, 세포사를 유도하기 위해 20011M 氏2로 처리하였다. 각각 5, 10, 25 및 50瞄血 紫苑 水 抽出物을 처리한 다음 6시간동안 배양하고 phosphate buffered saline과 0.5mg/mL MTT를 첨가하고 37℃ 에서 3시간동안 배양하고, 반응을 정지하기 위해 50% dimethylformamide, 20% sodium dodecyl sulfate(SDS) 100pL# 첨가하여 570nm/ 630nm의 흡광도에서 ELISA reader로 측정하였으며, catalase효소 활성도는 측정은 Aebi 방법 27을 통해 측정하였다.
- PC-12 세포주를 6-well plates에 l><104cells/well를 분주한 다음 세포사를 유도하기 위해 200yM H2O2로 처리하였다. 5, 10, 25 및 5叩g/畝 紫苑 水 抽出物을 처리한 다음 6시간동안 배양하였다. 1011M DCFDA를 30분간 37(3에서 반응시킨 다음 PBS 로 2회 세척하고 50pM digitonin을 첨가하고 세포 내 형광물질 인 fluorescence정량을 위해 Turner fluorometer(488nm/525nm)로 측정하였다.
- 5, 10, 25 및 5叩g/畝 紫苑 水 抽出物을 처리한 다음 6시간동안 배양하였다. 1011M DCFDA를 30분간 37(3에서 반응시킨 다음 PBS 로 2회 세척하고 50pM digitonin을 첨가하고 세포 내 형광물질 인 fluorescence정량을 위해 Turner fluorometer(488nm/525nm)로 측정하였다.
- 위해 20011M 压2로 처리하였다. 5, 10, 25 및 50μg/畝 紫苑 水抽出物을 처리한 다음 6시간 동안 배양하였다. 활성화 정도를 측정할 목적으로 Griffith 방법을28 사용하였다.
- 위해 20011M 压2로 처리하였다. 5, 10, 25 및 50μg/畝 紫苑 水抽出物을 처리한 다음 6시간 동안 배양하였다. 활성화 정도를 측정할 목적으로 Griffith 방법을28 사용하였다.
- 세포를 PBS로 2번 세척한 다음, 3% perchloric acid를 처리하고 15분간 4에서 원심분리하였다. 상등액인 O.lmM NaH2P04 와 5mM EDTA를 첨가하고 glutathione (GSH+GSSG)을 넣은 다음 412nm흡광도에서 U.V. spertrophotometer으로 측정하였다. GSSG는 GSH 를 2-vinylpyridine으로 전처리한 후 측정하였다.
- spertrophotometer으로 측정하였다. GSSG는 GSH 를 2-vinylpyridine으로 전처리한 후 측정하였다.
- 5분간 4℃ 조건하에서 원심분리하고 세포를 PBS로 재현탁하였다. 4% formaldehyde을 넣고 80% ethanol로 고정한 후 glass slides에 분주하고 TdT-Frag EL DNA fragmentation detection kit(Oncogene Research Products, Boston, MA, USA)을 통해 세포사의 정도를 methyl green으로 확인하였다. 전체 세포수 200개에서 Tunelpositive cells를 계산하였으며, 동일 방법으로 3회 반복 실시하여 측정하였다.
- 4% formaldehyde을 넣고 80% ethanol로 고정한 후 glass slides에 분주하고 TdT-Frag EL DNA fragmentation detection kit(Oncogene Research Products, Boston, MA, USA)을 통해 세포사의 정도를 methyl green으로 확인하였다. 전체 세포수 200개에서 Tunelpositive cells를 계산하였으며, 동일 방법으로 3회 반복 실시하여 측정하였다.
- 紫蒐 水抽出物에 의해 생존율이 얼마나 촉진되는지 알아보기 위해 MIT assay를 통해 조사하였다. PC-12세포의 생존율은 정상군, 정상군에 紫菟 水抽出物 처리군, 대조군에서는 각각 100%, 99±0.
- 紫苑 水抽出物에 의해 peroxide생성 억제를 조사하기 위해 비형광물질인 Z-7, -dichlorofluorescin diacetate(DCFDA; Molecular Probes, USA)의 최종산물인 DCF형광물질의 생성을 통해 관찰하였다. DCF축적을 억제하는 정도는 정상군, 정상군에 紫苑 水抽出物 처리군, 대조군에서 각각 10%, 12±0.
- 紫苑 水抽出物에 의해 GSH가 활성화 되는지 알아보기 위해 세포 내 GSH효소 활성도를 측정하였다. PC-12세포내의 GSH효소 활성도가 정상군, 정상군에 紫荒 水抽出物 처리군, 대조군에서 각각 30±4%, 33±1.
- 紫苑 水抽出物이 玦2에 의한 세포주의 세포사를 억제하는지 Tunel assay를 통해 관찰하였다. H2O2 처리와 같은 산화적 스트레스로 신경 상해를 유도한 PC-12세포내의 세포생존에서 정상군은 녹색으로 나타낸 반면, 대조군은 짙은 갈색의 형광으로 보여 PC-12에 H2O2처리로 인한 세포사가 촉진됨을 시사하고 있으며, 紫菟 水抽出物을 처리한 경우, 생존하고 있다는 증거인 녹색형광 그리고 세포사로 인한 갈색이 존재하지만 대조군에 비해 크게 감소함이 관찰되었다(Fig.
- 水抽出物에 의해 peroxide생성 억제를 조사하기 위해 비형굉물질인 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 의 최종산물인 DCF형광물질의 생성을 통해 관찰하였다. DCF축적을 억제하는 정도는 특히 25, 50 岫讹 紫菟 水抽出物 처리시 유의성(p<005) 있게 억제되었다(Fig.
- 紫菟 水抽出物이 H2O2에 의한 세포주의 세포사를 억제하는지 Tunel assay를 통해 관찰하였다. 压2처리로 산화적 스트레스 같은 인자에 의해 신경 상해를 유도한 PC-12세포내의 세포 생존에서 정상군은 녹색으로 나타낸 반면, 대조군은 짙은 갈색의 형광으로 보여 PC-12에 H2O2처리로 인한 세포사가 촉진됨을 시사하고 있으며, 紫苑 水抽出 物을 처리한 경우, 생존하고 있다는 증거인 녹색 형광 그리고 세포사로 인한 갈색이 존재하지만 대조군에 비해 크게 감소함이 관찰되었다(Fig.
- 질인 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFDA; Molecular Probes, USA)로 확인하였다. PC-12 세포주를 6-well plates에 l><104cells/well를 분주한 다음 세포사를 유도하기 위해 200yM H2O2로 처리하였다.
- 田2에 의한 세포사는 紫苑 水抽出物에 의해 얼마나 억제되는지를 알아보고자 세포사의 비율을 trypan blue로 염색하여 조사하였다. PC-12세포의 세포사 비율은 정상군, 정상군에 紫苑 水抽 出物 처리군, 대조군은 각각 10±1.
대상 데이터
- 실험에 사용된 시약은 RPMI 배지, fetal bovian serum(FBS), penicillin, streptomycin, trypsin, lipofectin(Gibco BRL), EtOH(Merck, Germany), dimethyl formamide, sodium dodecyl sulfate(SDS), catalase, succinate dehydrogenase, formazan, NaCl, H2O2, trypan blue, formaldehyde, MTT (3-[4, 5-dimethiozol-2y의2, 5-diphenytetrazolium bromide), phosphate-buffered saline(PBS), peroxides, 2-vinylpyridine, 5-5' dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), NaH2PO4, EDTA, digitonin, sodium phosphate, 3 carboxy-4 nitrophenyl disulfide(DTNB)는 Sigma OQ 에서 구입하였고 D2IXWA(2'-7-dichlorofluorescin diacetate) 는 Molecular Probes(USA)에서, Fluorescan Ascent FL는 Thermo Labsystem (Finland) 에서 구입하였고, 그 외 시약은 모두 특급 및 일반 시약을 사용하였다.
- 실험에 사용한 紫苑(Aster tataricus L.)은 대구한의대부속 대구한방병원 약재과에서 1kg을 엄선하여 잘게 분쇄한 후, 3차 증류수 5/를 넣고 8 0℃의 조건하에서 열탕 추출을 실시하여 거즈로 여과하고 감압농축기로 증발 농축하였다. 회수 한물 추출액 200ge 동결건조하여 분말상태로 85g을 회수하였다.
- 실험에 사용된 포유동물 세포주인 PC-12 celle서 울대 학교 암연구소 한국 세 포주은행 으로 부터분양 받아서 계대배양시켜 5% FBS가 함유한 RPMI배지에 penicillin/streptomycin을 첨가하여 flask 내지 cell culture용 dish에 배양하면서 1x103 세포수로 6-well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 하룻밤 배양한 다음 80%정도 조밀하게 배양하여 새로운 6-well plate에 다시 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator(VS-9108 MS, vision scientific Co.), phase-constrast microscope (Qympus), ELISA reader(en2yme-linked inrrunosorbent assay, Bio-Red, USA), U.V. spertrophotometer (Pharmcia, USA), Turner fluorometer(Tumer design Co. Canada) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 mean土S.D로 나타내었고 통계처리는 Student's t-test를 실시하여, p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 5, 10, 25 및 50μg/畝 紫苑 水抽出物을 처리한 다음 6시간 동안 배양하였다. 활성화 정도를 측정할 목적으로 Griffith 방법을28 사용하였다. 세포를 PBS로 2번 세척한 다음, 3% perchloric acid를 처리하고 15분간 4에서 원심분리하였다.
성능/효과
- 2% trypan blue를 PBS에 5분간 첨가하여 phase-contrast microscopy로 관찰하였다. 세포사를 유도한 세포는 적자색으로 관찰되고, 생존세포들은 무색으로 관찰되며, 생존세포수는 전체 세포수 200개에서 생존율을 즉정하였다.
- 신경세포인 PC-12가 20011M H2O2에 의한 세포사를 확인하기 위해 위상차현미경하에서 관찰한 결과, 정상군에 비해 대조군은 형태학적으로 큰 변화가 나타났는데, 정상적인 형태가 아닌 둥근 형태의 세포사 특징을 가진 세포들이 관찰되었다. 반면 紫蒐 水抽出物처리군은 25陽/戒 농도에서 세포사가 억제되고 신경돌기의 신장이 촉진되는 양상이 관찰되었다(Fig.
- 3%로 나타났다. 특히 25, 50您/戒 紫苑 水抽出物 처리시 세포사가 유의성(p<0・05) 있게 억제되었다(Fig. 2).
- PC-12세포의 생존율은 정상군, 정상군에 紫菟 水抽出物 처리군, 대조군에서는 각각 100%, 99±0.5%, 34±1.5%으로 나타난 반면, 5, 10, 25, 50 Ug/mC 紫蒐 水抽出物을 처리한 군에서는 각각 37±1.4%, 52.1±0.5%, 69±1.1%, 91.1±0.5%로 나타났다. 특히 25, 50/@叫 紫苑 水抽出物 처리시 생존율이 유의성(p<0.
- 5%로 나타났다. 특히 25, 50/zg/m£ 紫苑 水抽出物 처리시유의성(p<0.05) 있게 억제되었다(Fig. 4A).
- 관찰하였다. H2O2 처리와 같은 산화적 스트레스로 신경 상해를 유도한 PC-12세포내의 세포생존에서 정상군은 녹색으로 나타낸 반면, 대조군은 짙은 갈색의 형광으로 보여 PC-12에 H2O2처리로 인한 세포사가 촉진됨을 시사하고 있으며, 紫菟 水抽出物을 처리한 경우, 생존하고 있다는 증거인 녹색형광 그리고 세포사로 인한 갈색이 존재하지만 대조군에 비해 크게 감소함이 관찰되었다(Fig. 5A).
- 이를 통계처리한 결과 정상군, 정상군에 紫苑 水抽出物 처리군, 대조군은 각각 10±0.5%, 13± 1.5%, 68±1%으로 나타난 반면, 5, 10, 25, 50ug/ 畝 紫苑 水抽出物을 처리한 경우 각각 54±2.%, 39±0.5%, 31±1.5%, 22±0.5%로 나타났다. 특히 25, 50/zg/m« 紫苑 水抽出物 처리시 유의성(p<0.
- 관찰하였다. 压2처리로 산화적 스트레스 같은 인자에 의해 신경 상해를 유도한 PC-12세포내의 세포 생존에서 정상군은 녹색으로 나타낸 반면, 대조군은 짙은 갈색의 형광으로 보여 PC-12에 H2O2처리로 인한 세포사가 촉진됨을 시사하고 있으며, 紫苑 水抽出 物을 처리한 경우, 생존하고 있다는 증거인 녹색 형광 그리고 세포사로 인한 갈색이 존재하지만 대조군에 비해 크게 감소함이 관찰되었다(Fig. 5A). 이를 통계처리한 결과 특히 25, 50俸/圳 紫苑 水 抽出物 처리시 유의성(p<0.
- 压。2에 의한 세포사를 유도하여 신경세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과 정상군에 비해 대조군은 형태학적으로 큰 변화를 나타내었는데, 정상적인 형태가 아닌 둥근 형태의 세포사 특징을 가진 세포들이 관찰되었다. 반면 紫苑 水抽出物 처리 군은 25/zg/i戒 농도에서 세포의 생존율과 신경돌기의 신장이 촉진되고 세포사는 억제되었다(Fig.
- 1). 농도별 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 trypan blue로 염색하여 조사한 결과, 농도 의존적으로 억제되었으며 특히 25, 50/zg/m« 紫 苑 水抽出物 처리시 세포사가 유의성(p<0.05) 있게 억제되었다(Fig. 2).
- 紫蒐 水抽出物에 의해 생존율이 얼마나 촉진되는지 알아보기 위해 MTT assay를 통해 조사한 결과, 특히 25, 50“以1圳 紫苑 水抽出物 처리시 생존율이 유의성(p<0.05) 있게 활성화 되었다(Fig. 3A). Catalase는 항산화효소로 세포사 억제에 관여한다.
- Catalase는 항산화효소로 세포사 억제에 관여한다. 紫苑 水抽出物에 의해 얼마나 catalase의 비율을 촉진하는지를 조사하기 위해 catalase 효소 활성도를 조사한 결과, 특히 25, 50/zg/m 紫蒐 水抽出 物 처리시 활성도가 유의성(p<0.05) 있게 나타났다(Fig. 3B). 이상에서 볼 때 紫苑 水抽出物은 농도 의존적으로 생존율을 높이며 항산화효소를 활성화 시켜 신경세포의 세포사를 억제는 것으로 생각된다.
- 3B). 이상에서 볼 때 紫苑 水抽出物은 농도 의존적으로 생존율을 높이며 항산화효소를 활성화 시켜 신경세포의 세포사를 억제는 것으로 생각된다.
- 紫 苑 水抽出物에 의해 peroxide생성 억제를 조사하기 위해 비형굉물질인 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 의 최종산물인 DCF형광물질의 생성을 통해 관찰하였다. DCF축적을 억제하는 정도는 특히 25, 50 岫讹 紫菟 水抽出物 처리시 유의성(p<005) 있게 억제되었다(Fig. 4A). 또한 紫蒐 水抽出物에 의해 항산화 효소인 GSH의 효소활성도가 얼마나 촉진되는지 조사하기 위해 세포 내 GSH 효소 활성도를 측정하였는데 특히 25, 50昭/畝 紫苑 水抽出物 처리 시 유의성(p<0.
- 4A). 또한 紫蒐 水抽出物에 의해 항산화 효소인 GSH의 효소활성도가 얼마나 촉진되는지 조사하기 위해 세포 내 GSH 효소 활성도를 측정하였는데 특히 25, 50昭/畝 紫苑 水抽出物 처리 시 유의성(p<0.05) 있게 GSH효소가 활성화되었다(Fig. 4B), 따라서 紫莞 水抽出物이 peroxide 생성은 억제하며 항산화효소 활성도를 촉진시켜 세포사를 억제하는 것으로 사료된다.
- 5A). 이를 통계처리한 결과 특히 25, 50俸/圳 紫苑 水 抽出物 처리시 유의성(p<0.05) 있게 H2O2로 유도된 유해산소에 대한 세포독성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 5B). 따라서 紫苑 水抽出物이 농도 의존적으로 유해산소에 대한 세포독성을 억제하고 세포의 보호효과가 있다고 추측된다.
- 1. 紫苑 水抽出物은 형태학적으로 세포사 억제와 신경돌기의 신장을 촉진하였다.
- 2. 紫菟 水抽出物은 농도 의존적으로 유의성 있게 신경세포의 세포사를 억제하였다.
- 3. 紫蒐 水抽出物은 catalase항산화효소를 활성화 시켜 유의성 있게 신경세포의 세포사를 억제하였다.
- 4. 紫苑 水抽出物은 유의성 있는 peroxide 생성억제와 GSH효소 활성을 나타내어 신경세포의 세포사를 억제하였다.
- 5. 紫苑 水抽出物은 Tunel assay를 통해 확인한 결과 유의성 있게 세포사를 억제하는 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 이상에서와 같이 紫蒐 水抽出物은 PC-12세포주에서의 세포사에 대해 효과적으로 억제하는 효과가 나타나 치매를 비롯한 기타 뇌의 퇴행성 변화에 대해 효과가 있을 것으로 추정되며, 향후 다각적이고 지속적인 임상 및 실험적 연구가 병행되어야 할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.