식품소재의 단백질 glycation 저해효과를 조사하기 위하여 곡류, 채소류 및 생약재 등 83종 에탄올 추출물에 대한 단백질 가교결합 저해효과를 $[^{14}C]$-N-formyl-lysine incorporation method를 이용하여 측정하였다. 대부분의 추출물에서 저해효과가 나타났으나 일부 추출물은 단백질의 가교를 촉진하는 것으로 나타났다. 상대적으로 높은 활성을 나타낸 시료 중 20개를 선별하여 형광광도법을 이용한 AGE형성 억제능을 조사한 결과, 1일 발아한 메밀의 추출물 (GB-l)이 가장 높은 저해활성을 가지는 것으로 나타났다. 차후 GB-0l은 콜로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획되었으며 그 중 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 단백질 glycation 저해활성(95.2% inhibitory activity at 100 ug/mL addi- tion level)을 보였다. HPLC를 이용한 폴리페놀 분석결과 발아 및 추출, 분획과정을 거친 메밀의 아세테이트 분획은 rutin 및 quercetin 함량이 상당히 증가한 것으로 나타나서 부분정제물의 rutin 및 quercetin 함량과 저해활성사이에 높은 상관성을 나타내었다.
식품소재의 단백질 glycation 저해효과를 조사하기 위하여 곡류, 채소류 및 생약재 등 83종 에탄올 추출물에 대한 단백질 가교결합 저해효과를 $[^{14}C]$-N-formyl-lysine incorporation method를 이용하여 측정하였다. 대부분의 추출물에서 저해효과가 나타났으나 일부 추출물은 단백질의 가교를 촉진하는 것으로 나타났다. 상대적으로 높은 활성을 나타낸 시료 중 20개를 선별하여 형광광도법을 이용한 AGE형성 억제능을 조사한 결과, 1일 발아한 메밀의 추출물 (GB-l)이 가장 높은 저해활성을 가지는 것으로 나타났다. 차후 GB-0l은 콜로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획되었으며 그 중 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 단백질 glycation 저해활성(95.2% inhibitory activity at 100 ug/mL addi- tion level)을 보였다. HPLC를 이용한 폴리페놀 분석결과 발아 및 추출, 분획과정을 거친 메밀의 아세테이트 분획은 rutin 및 quercetin 함량이 상당히 증가한 것으로 나타나서 부분정제물의 rutin 및 quercetin 함량과 저해활성사이에 높은 상관성을 나타내었다.
The ethanolic extracts of 83 kinds of agricultural products, including cereals, vegetables, and Chinese herbs, were tested for their inhibitory activities on protein cross-linking using the $[^{14}C]$-N-formyl-lysine incorporation method. Most of the extracts inhibited, but some extracts ...
The ethanolic extracts of 83 kinds of agricultural products, including cereals, vegetables, and Chinese herbs, were tested for their inhibitory activities on protein cross-linking using the $[^{14}C]$-N-formyl-lysine incorporation method. Most of the extracts inhibited, but some extracts accelerated, the cross-linking of protein. Of those items with relatively high activities, we selected 20 samples to test for activity against AGE fonnation using the fluorophotometric method. The ethanol extract of buckwheat that was genninated for 1 day (GB-01) was detennined to have the highest activity with both methods. The ethanol extract of GB-01 was further fractionated by organic solvents, including chloroform, ethyl acetate, butanol, and water, in order of increasing polarity. The fraction that was extracted with ethyl acetate presented the highest protein glycation inhibitory activity (95.2% inhibition at the 100 ug/mL addition level). Polyphenol content analysis by HPLC showed that the amounts of rutin and quercetin were increased with the separation procedures. Finally, there was a significant relationship between activity and polyphenol content in the partially purified samples (p<0.05).
The ethanolic extracts of 83 kinds of agricultural products, including cereals, vegetables, and Chinese herbs, were tested for their inhibitory activities on protein cross-linking using the $[^{14}C]$-N-formyl-lysine incorporation method. Most of the extracts inhibited, but some extracts accelerated, the cross-linking of protein. Of those items with relatively high activities, we selected 20 samples to test for activity against AGE fonnation using the fluorophotometric method. The ethanol extract of buckwheat that was genninated for 1 day (GB-01) was detennined to have the highest activity with both methods. The ethanol extract of GB-01 was further fractionated by organic solvents, including chloroform, ethyl acetate, butanol, and water, in order of increasing polarity. The fraction that was extracted with ethyl acetate presented the highest protein glycation inhibitory activity (95.2% inhibition at the 100 ug/mL addition level). Polyphenol content analysis by HPLC showed that the amounts of rutin and quercetin were increased with the separation procedures. Finally, there was a significant relationship between activity and polyphenol content in the partially purified samples (p<0.05).
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문제 정의
제기될 수 있다(10). 그러므로 본 연구에서는 단백질의 이ycation을 저해할 수 있는 활성이 뛰어난 천연물 유래의 소재검색을 실시하고 소재의 분리 및 부분정제물의 단백질 glycation 저해효과 및 polyphenol 함량과의 관계를 알아보고자 하였다.
용매분획을 통하여 활성의 본체가 약한 극성을 가지는 물질일 것으로 추정되므로 좀 더 활성의 본체에 접근하여 활성과 본체추정물질과의 상관성을 구명하기 위하여, 메밀에 존재하는 것으로 알려진 polyphenol 화합물인 rutin과 quercetin(13-15)의 각 분획별 함량을 분석하여 활성과의 그 상관성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
70% ethanol로 위의 추출방법으로 추출하여 얻은 시료의 농축물 10mL에 chloroform 40mL씩 2회 혼합, 분획하여 chloroform fraction을 얻고 나머지 부분에 다시 ethyl acetate, butanol, 및 water를 40mL씩 2회 혼합하여 계속 극성이 증가하는 순으로 계속 분획 하여 ethyl acetate fraction, butanol fraction, 및 waterfiaction을 얻었다. 각각의 용매 仓action을 증발농축기를 이용, 용매를 제거하여 농축물을 얻어 활성 측정 및 polyphenol 화합물 측정용의 시료로 사용하였다.
40mL씩 2회 혼합하여 계속 극성이 증가하는 순으로 계속 분획 하여 ethyl acetate fraction, butanol fraction, 및 waterfiaction을 얻었다. 각각의 용매 仓action을 증발농축기를 이용, 용매를 제거하여 농축물을 얻어 활성 측정 및 polyphenol 화합물 측정용의 시료로 사용하였다.
2 mL와 증류수 2mL를 혼합하여 형광광도계(FP450, Jasco, Tokyo, Japan)을 이용하여 350 nm(excitation)과 425 nm (emission)에서 측정하였다. 대조군 시료는 ImL의 0.1 M 인산완충용액 (phosphate buSer, pH 7.0)에 5 mg의 수정체 단백질 등 반응혼합액을 준비한 후 상기한 방법대로 동일하게 분석하였다.
세척한 후 여과지를 완전히 건조한 다음 |*C]M포밀-리신의 혼입(incorporation)도를 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정함으로써 단백질 교차결합 도를 분석하였다. 대조군 시료로서 1 mL의 0.1 M 인산 완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 5 mg의 수정체 단백질, 1 mM DTPA, 2 μCi의 포밀-리신의 반응혼합액을 준비한 후 상기한 방법대로 동일하게 분석하였다.
발아 메밀의 에탄올 추출물의 농축액을 용매의 극성이 증가하는 순서 (chlorofbrm, ethyl acetate, butanol, water)로 주출 분획하고, 얻은 각 분획의 AGE 형성 저해활성을 형광물질 분석법으로 측정한 결과는 Table 3과 같았다.
발아 현미와 메밀의 제조는 건조된 현미와 메밀(50g)을 8시간 실온에서 침지한 후 항온기(2WC, 98%)에서 현미는 3일과 5일 동안, 메밀은 1일, 3일과 5일 동안 발아시키고 30℃ 건조기에서 건조시켜 분쇄하고 추출물 제조용 시료로 하였으며 추출물은 앞서 언급한 70% ethanol 추출법을 이용하여 제조하였다.
단백질 교차결합 저해활성과 AGE형성저해활성의 결과를 종합하였을 때 발아메밀(1일)이 가장 탁월한단백질 glycation 저해효과가 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 단백질 glycation 반응이 진행되는 동안 단백질의 교차결합 정도를 예측 하기위하여 2가지의 분석방법을 사용하였다. 즉활성의 1차 검색에 사용한 포밀-리신의 incorporation을 이용한 단백질 교차결합 저해활성 측정방법은 단백질의 glycation 반응이 진행됨에 따라 형성되는 단백질의 교차결합정도를 화학적으로 합성한 "C으로 균일하게 표식된 N-포밀-리신으로 정확하게 정량화하는 방법으로 amino-carbonyl 결합에 참여하지 않는 리신의 a 위치에 있는 아미노기를 포밀기(-CHO)로 막은 N-포밀-리신을 제조하여 이 기질이 교차 결합될 때 교차 결합된포밀-리신의 혼입정도에 따라 정량하는 방법으로, 교차 결합도를 측정하는 방법이며 2차 검증에 이용한 형광분석법은 형광성을 가지는 단백질 잉ycation의 종말산물의 함량을 측정하는 방법을 사용하였다.
생약재, 곡류, 버섯류, 허브류 등 총 83종 시료의 ethanol 추출물에 대한 단백질 glycation 저해활성으로 분석하였다. [”C]-N-포밀-리신의 incorporation을 이용한 방법(11)으로 단백질 교차결합도를 측정하였다.
생약재, 곡류, 채소류, 허브류 등 총 83종의 시료를 분쇄하고 70% ethanol 용액을 가하여 환류냉각관이 연결된 90℃ 수욕조에서 2시간 동안 추출하였다. 추출한 시료를 여과지 (Whatman No.
5 cm 지름의 여과지(Whatman)에 각각 점적하여 트리클로로아세트산(trichloroaceticacid)으로 세척하였다. 세척한 후 여과지를 완전히 건조한 다음 |*C]M포밀-리신의 혼입(incorporation)도를 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정함으로써 단백질 교차결합 도를 분석하였다. 대조군 시료로서 1 mL의 0.
시료의 polyphenol 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료를 메탄올로 녹인 후 정용하여 0.
배양시료에 10% TCA를 2mL 가하여 원심분리(30, 000Xg, 15min)하였다. 원심분리하여 생긴 침전물에 5% TCA(ice cold)를 2mL씩 두 번 가하여 세척하고 2mL 0.1M 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 용해시켜 그 중 0.2 mL와 증류수 2mL를 혼합하여 형광광도계(FP450, Jasco, Tokyo, Japan)을 이용하여 350 nm(excitation)과 425 nm (emission)에서 측정하였다. 대조군 시료는 ImL의 0.
[”C]-N-포밀-리신의 incorporation을 이용한 방법(11)으로 단백질 교차결합도를 측정하였다. 유효농도결정을 위하여 각 농도별(10ng, lug, 100 ng, 10 mg)로 활성을 측정한 결과, 100 ㎍ 수준의 첨가가 대상이 된 대부분의 시료에서 활성의 재현성 있는 결과를 보여 이후 단백질 교차결합도 측정시 추출물의 첨가 수준으로 결정하였다. 대부분의 추출물이 단백질 교차결합 저해활성을 나타내었으나 작약 등 26종은 단백질의 교차결합을 증가시킴으로서 단백질 glycation의 형성을 촉진하는 결과를 나타내었다.
대상 데이터
단백질 glycation 저해효과가 있는 식품소재의 개발을 위하여본 연구에서 사용된 시료는 Table 1과 같았으며 시료는 서울 경동시장에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 1급 이상 시약을 사용하였다.
이론/모형
Lee(ll>의 방법에 의하여 분석하였다. 즉 ImL의 0.
[”C]-N-포밀-리신의 incorporation을 이용한 방법(11)으로 단백질 교차결합도를 측정하였다. 유효농도결정을 위하여 각 농도별(10ng, lug, 100 ng, 10 mg)로 활성을 측정한 결과, 100 ㎍ 수준의 첨가가 대상이 된 대부분의 시료에서 활성의 재현성 있는 결과를 보여 이후 단백질 교차결합도 측정시 추출물의 첨가 수준으로 결정하였다.
성능/효과
rutin과 quercetin 함량은 Table 4와 같았다. Ethyl acetate 분획의 rutir과 quercetin 함량은 각각 390.4 mg%와 245.0 mg%로 다른 용매를 이용한 분획보다 월등히 높았다. 이는 chlorofbmi 분획의 rutin 함량(66.
Table 5는 단백질 glycation 저해활성과 polyphenol 화합물 함량과의 상관관계를 나타낸 것으로 저해활성은 rutin 또는 quercetin 단일 물질의 함량보다는 이 두 물질 함량의 합과 더 높은 상관관계를 나타내는 것으로 조사되었다. Quercetin과 rutin의 순수 표준물질이 1, 000 jig/ mL 첨가수준에서 각각 48.5% 및 53.1%의 저해활성을 보인 것에비하여 본 연구의 소재인 발아메밀 추출물의 저해활성이 월등한효과를 나타낸 것은 식물체에 존재하는 미지의 synergist 작용을하는 물질로 인한 것으로 판단할 수 있다. 이 들 물질들은 활성이 높았던 추출물을 정제하는 과정에서 그 활성이 저하되는 원인이 되기도 한다.
1% 감소한 결과이다. 그러나 처음 얻은 chloroform 분획의 저해활성은 42.7%, 물 분획의 저해활성이 21.5%로, ethanol 추출물의 활성에 비하여 매우 낮은 활성을 보여 chlorofbrm 및 물을 이용한 분획 이 활성의 본체에 대한 분리방법으로 효과적이지 않음을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 발아메밀 에탄올 추출물 중 활성의 본체가 되는 물질은 약한 극성을 나타내는 물질들일 것으로 추정되었다.
3%의 저해활성을 보여 단백질 교차결합 저해효과 결과와는 다른 양상을 보였다. 단백질 교차결합 저해활성과 AGE형성저해활성의 결과를 종합하였을 때 발아메밀(1일)이 가장 탁월한단백질 glycation 저해효과가 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 단백질 glycation 반응이 진행되는 동안 단백질의 교차결합 정도를 예측 하기위하여 2가지의 분석방법을 사용하였다.
1은 포밀뢰신의 incorporation을 이용한 단백질 교차결합도 측정에서 높은 저해 활성을 보인 시료를 활성의 크기에 따라 순서대로 20종을 선택하여 그 에탄올 추출물의 단백질잉ycation 저해활성을 AGE의 형광성에 기초한 분석법을 이용하여 확인한 결과이다. 대부분의 추출물이 높은 저해활성을 나타내었으며 단백질 교차결합 저해활성이 가장 높은 발아메밀(1일)이 AGE형성억제 효과도 83.3%로 가장 높았다. 또한 발아메밀(3일) 과 솔순, 사간의 추출물도 83.
사간, 반하, 감초, 단삼, 백지와 솔순 등 생약재들이 그 뒤를 이어 높은 단백질 교차결합 형성 저해활성을 나타내어 생약재들이 좋은 소재가 됨을 확인할 수 있었다. 또한 3일간 및 5일간 발아된 메밀 및 발아현미도 다른 곡류에 비하여 비교적 높은 저해활성을 보여 발아된 곡류의 저해효과가 다른 소재에 비하여 활성이 뛰어남을 알 수 있었다. 위의 결과로부터 발아 과정 중 배아의 생리적 변화가 단백질 교차결합 저해물질의 생산을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
3%로 가장 높았다. 또한 발아메밀(3일) 과 솔순, 사간의 추출물도 83.3%의 저해활성을 나타내어 단백질교차결합 저해 결과와 같은 경향을 보였으나 단백질 교차결합 저해활성이 높지 않았던 황기의 추출물이 AGE형성 저해 활성에서는 83.3%의 저해활성을 보여 단백질 교차결합 저해효과 결과와는 다른 양상을 보였다. 단백질 교차결합 저해활성과 AGE형성저해활성의 결과를 종합하였을 때 발아메밀(1일)이 가장 탁월한단백질 glycation 저해효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
7 mg%로 ethyl acetate 분획의 함량과 큰 차이를 보이지 않아 ethyl acetate 분획 후 잔존한 quercetin0] butanol과의 분획에서 용출된 것으로 생각된다. 반면 발아 메밀추출물의 물 분획에서는 rutin과 quercetin은 거의 검출되지 않아 이미 약한 극성을 가진 용매들에 의하여 대부분 분획되어 잔존량이 적은 것으로 결론할 수 있었다. Table 5는 단백질 glycation 저해활성과 polyphenol 화합물 함량과의 상관관계를 나타낸 것으로 저해활성은 rutin 또는 quercetin 단일 물질의 함량보다는 이 두 물질 함량의 합과 더 높은 상관관계를 나타내는 것으로 조사되었다.
4%의 저해활성을 나타내었다(Table 1). 사간, 반하, 감초, 단삼, 백지와 솔순 등 생약재들이 그 뒤를 이어 높은 단백질 교차결합 형성 저해활성을 나타내어 생약재들이 좋은 소재가 됨을 확인할 수 있었다. 또한 3일간 및 5일간 발아된 메밀 및 발아현미도 다른 곡류에 비하여 비교적 높은 저해활성을 보여 발아된 곡류의 저해효과가 다른 소재에 비하여 활성이 뛰어남을 알 수 있었다.
시료군중 단백질의 교차결합 증가에 의한 단백질 glycation의 형성을 촉진 효과가 가장 두드러진 군은 채소류였으며 가장 적은 군은 향신료 군이었다. 시료 중 100㎍/mL의 수준에서 단백질 교차결합 형성에 저해활성을 보인 시료는 5S종으로 그 중 가장 높은 활성을 보인 시료는 1일 발아시킨 메밀로 40.4%의 저해활성을 나타내었다(Table 1). 사간, 반하, 감초, 단삼, 백지와 솔순 등 생약재들이 그 뒤를 이어 높은 단백질 교차결합 형성 저해활성을 나타내어 생약재들이 좋은 소재가 됨을 확인할 수 있었다.
대부분의 추출물이 단백질 교차결합 저해활성을 나타내었으나 작약 등 26종은 단백질의 교차결합을 증가시킴으로서 단백질 glycation의 형성을 촉진하는 결과를 나타내었다. 시료군중 단백질의 교차결합 증가에 의한 단백질 glycation의 형성을 촉진 효과가 가장 두드러진 군은 채소류였으며 가장 적은 군은 향신료 군이었다. 시료 중 100㎍/mL의 수준에서 단백질 교차결합 형성에 저해활성을 보인 시료는 5S종으로 그 중 가장 높은 활성을 보인 시료는 1일 발아시킨 메밀로 40.
반응의 초기와 말기 모두를. 억제한다는 것을 발견하였다. 최근 일부 합성 항산화제들이 동물 실험결과 독성이 있는 것으로 밝혀져(17), 천연물을 이용한 안전한 제품 생산에 관심이 고조되고 있다(18).
또한 3일간 및 5일간 발아된 메밀 및 발아현미도 다른 곡류에 비하여 비교적 높은 저해활성을 보여 발아된 곡류의 저해효과가 다른 소재에 비하여 활성이 뛰어남을 알 수 있었다. 위의 결과로부터 발아 과정 중 배아의 생리적 변화가 단백질 교차결합 저해물질의 생산을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
5%로, ethanol 추출물의 활성에 비하여 매우 낮은 활성을 보여 chlorofbrm 및 물을 이용한 분획 이 활성의 본체에 대한 분리방법으로 효과적이지 않음을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 발아메밀 에탄올 추출물 중 활성의 본체가 되는 물질은 약한 극성을 나타내는 물질들일 것으로 추정되었다.
최종농도가 100pg/mL이 되도록 반응계에 첨가하였을 때 ethyl acetate 분획이 95.2%의 저해활성을 보여 가장 높은 저해효과를 나타내었으며, butanol분획에서도 78.2%의 저해활성을 보여 비교적 높은 활성을 나타내었다. 이는 발아메밀의 70% ethanol 추출물이 83.
합성 AGE 생성 억제제 인 aminoguanidine은 1, 000 |ig/mL 첨가수준에서 51%의 저해활성을 보여 본 연구의 소재인 발아메밀의 저해활성이 aminoguanidine에 비해 월등한 효과가 있음이 간접적으로 확인할 수 있었다. 이는 발아메밀의 70% ethanol 추출물이 83.
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