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문제 정의
- 본 연구에서는 통상적인 발효 추출물 제조법과 다르게 과일 및 채소 내 모든 유용성분들을 이용할 수 있는 즙을 짜는 방법으로, 미생물 무처리한 생즙과 미생물을 처리한 발효즙을 비교하여 항산화 및 피부세포 노화를 개선시킬 수 있는 효능이 있는지 알아보았다.
- 파프리카 생즙과 발효즙이 노화 관련 단백질 변성에 대한 영향을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 본 실험은 glycation이 되면 형광물질이 형성되는데, 이 형광물질을 배양 24 h 배양 전후를 측정하여 glycation 정도를 평가하는 실험법으로 실험의 신뢰도를 위해 양성대조군으로 Aminoguanidine을 사용하였다.
제안 방법
- fluorescent microplate reader 로 370 nm와 440 nm로 바로 측정한다. 37℃에서 24 h 동안 고습도배양기에 배양 후, 다시 흡광도를 측정하여 배양 전과 후의 형광값을 비교하여 anti-glycation 효과를 확인한다.
- 시료의 세포독성 측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 HDF를 이용한 MTT assay를 시행하였다. HDF에서 파프리카 생즙 2종과 파프리카 발효즙 2종의 세포독성을 확인한 결과, 시료 모두 2%의 농도로 처리 시 HDF의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되었지만(Figure 2), 자외선 조사조건에서는 2%의 농도에서 섬유아세포에 영향을 나타내어 이후 실험에서는 섬유아세포에 영향을 미치지 않는 1%의 농도부터 실험을 진행하였다(data not shown).
- UVA에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 activator protein-1 (AP-1)의 신호전달경로를 통해 MMP-1 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래하여 피부 광노화 연구에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. MMP-1의 발현에 항산화실험결과 가장 높은 수치를 나타낸 빨간색 파프리카 발효즙이 미치는 영향을 알아보고자 HDF에 6.3 J/cm2 UVA를 조사하고 각 시료를 첨가하여 24 h 배양한 후 MMP-1 발현저해 효과를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용해 흡광도를 측정하였다. 그 결과 빨간색 파프리카 발효즙은 농도 의존적으로 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내었으며, 1%의 농도로 처리 시MMP-1 발현저해 효과는 29%를 나타났으며, 양성대조 군인 EGCG는 10 µM에서 43%의 MMP-1 발현저해 효과를 나타내었다(Figure 3).
- MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide] 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다[10]. HDF를 2 × 104 cells/well 농도로 96-well plate의 well에 각 시료들을 첨가 후 CO2 배양기에서 24 h 배양하였다.
- 5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)를 섞고 distilled water로 전체를 25 µL로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR 후 시료들을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 MMP-1과 GAPDH 유전자의 발현을 확인하였다.
- Polymerase Chain Reaction (PCR)은 cDNA로부터 MMP-1, GAPDH를 증폭하기 위하여 1 µL cDNA, 0.5 µM의 5'과 3'primer, 10 X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 200 µM dNTP, 25 mM MgCl 2 , 2.5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)를 섞고 distilled water로 전체를 25 µL로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다.
- 5 × 105 cells/mL의 농도로 35 mm dish에 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 배양한다. UV조사 전에 배양배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum을 제거한 후 PBS 상태에서 6.3 J/cm2 UVA (UVA F15T8BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 각 시료들을 투여하여 24 h 배양하였다.
- cDNA합성은 1 µg의 total RNA를 oligo (dT)15 primer, dNTP (0.5 µM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany)로 37℃에서 60 min, 93℃에서 5 min heating 시켜 반응을 중지시켰다.
- 과 산화된 시료에 산화정지를 위해 3.6% BHA와 600 µL TBA-TCA 용액(thiobarbituric acid, 15% trichloroacetic acid, 0.25 N HCl)을 혼합하여 boiling water bath에서 30 min 반응 후 냉각해 0.6 mL chloroform을 첨가하여 3000 rpm에서 5 min 원심 분리한 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하여 지질과산화 억제효과를 측정하였다[9].
- 기존의 천연물 화장품 조성물을 제조하는 방법인 추출법과 미생물 발효법이 아닌 다른 색다른 방법으로 시료를 제조하고, 천연물이 가진 본연의 특성을 모두 나타내고자 생즙이라는 방법을 선별하였다. 즙은 동의보감에서 사용되는 치료를 목적으로 하는 제조법 중 하나로써, 과일과 채소에 함유된 모든 영양소뿐만 아니라 함유된 효소를 사용할 수 있게 되어 섭취 시 신진대사가 활발해져 비만예방 및 체질개선을 할 수 있다[1].
- 당의 카르노닐기와 단백질의 아미노기와 결합한 최종당화산물(AGEs)의 생성을 억제하는 효과인 anti-glycation을 확인하는 시험을 진행하였고, 이는 최종당화 산물의 단백질 교차결합 부분 일부는 형광을 띄어 반응물의 생성 정도를 형광도로 측정할 수 있다. 5 mL의 neutralizing solution을 첨가한 50 µL의 the collagen solution을 96 well black plate에 분주하여 37℃에서 18 -24 h 동안 고습도배양기로 배양한다.
- 파프리카 생즙과 발효즙이 노화 관련 단백질 변성에 대한 영향을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 본 실험은 glycation이 되면 형광물질이 형성되는데, 이 형광물질을 배양 24 h 배양 전후를 측정하여 glycation 정도를 평가하는 실험법으로 실험의 신뢰도를 위해 양성대조군으로 Aminoguanidine을 사용하였다. 그 결과, 파프리카 생즙보다 발효즙에서 최종 당화산물(advanced glycation end-products, AGEs) 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5).
- 시료의 세포독성 측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 HDF를 이용한 MTT assay를 시행하였다. HDF에서 파프리카 생즙 2종과 파프리카 발효즙 2종의 세포독성을 확인한 결과, 시료 모두 2%의 농도로 처리 시 HDF의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되었지만(Figure 2), 자외선 조사조건에서는 2%의 농도에서 섬유아세포에 영향을 나타내어 이후 실험에서는 섬유아세포에 영향을 미치지 않는 1%의 농도부터 실험을 진행하였다(data not shown).
- 5 mL씩 첨가하고 37℃에서 24 h 동안 염색을 하였다. 염색된 세포는 1 mL PBS로 세척 후 1 mL 70% glycerol을 넣고 광학현미경(Olympus, Japan)으로 염색된 세포 수를 측정하였다. 염색된 세포의 측정은 각 plate의 동일한 5곳을 위치하여 사진을 촬영한 후, 전체 세포의 수와 염색된 세포의 수를 계수하여 시행하였다.
- 염색된 세포는 1 mL PBS로 세척 후 1 mL 70% glycerol을 넣고 광학현미경(Olympus, Japan)으로 염색된 세포 수를 측정하였다. 염색된 세포의 측정은 각 plate의 동일한 5곳을 위치하여 사진을 촬영한 후, 전체 세포의 수와 염색된 세포의 수를 계수하여 시행하였다.
- 지질은 체내에서 발생하는 프리라디칼의 공격을 받아 과산화물들을 형성하여 여러 가지 만성질환을 초래 한다. 이러한 지질의 과산화억제를 측정하기 위해 linoleic acid를 이용한 실험을 통해 파프리카 생즙 2종과 파프리카 발효즙 2종의 지질과산화 억제효과를 측정 하였다(Figure 1). 그 결과, 파프리카 생즙보다는 발효즙에서 지질과산화 억제율이 높았으며, 발효즙 중 빨간색 파프리카 발효즙 2% 농도에서는 90% 이상의 지질과산화 억제효과를 보였다.
- 푸른색 혼합물이 생성되면 UV-VIS spectrophotometer (Evolution 201, Thermo scientific, USA) 765 nm에서 측정한다. 지표물질로는 Gallic acid를 사용하여 10, 100, 125, 250, 500, 1000 ppm을 765 nm에서 측정된 값으로 표준곡선을 작성 한뒤, 시료들의 값을 대입하였다. Control로는 물 0.
- 5 mL를 혼합하여 상온에서 10 min 반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer (Evolution 201, Thermo scientific, USA) 367 nm에서 측정한다. 지표물질로는 Quercetin을 사용하여 27, 81, 242, 725 ppm을 367 nm에서 측정된 값으로 표준곡선을 작성한 뒤, 시료들의 값을 대입하였다. Control로는 물 0.
- 통상의 발효 물 제조방식이 아닌 새로운 원료 제조방법인 즙을 짜는 방식을 사용하여 파프리카 생즙과 유산균을 이용한 발효즙의 항산화 및 항노화 효능을 비교하였다. 그 결과, 파프리카 생즙보다 유산균을 접종하여 발효한 파프리카 발효즙이 유의 있게 항산화와 항노화 효과가 높게 나타났다.
- 항산화능과 생리활성에 영향을 미치는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정하여 파프리카를 이용한 생즙과 발효즙의 차이를 확인하였다. 총 폴리페놀 함량 측정 결과, 파프리카 생즙 2종과 발효즙 2종 모두 발효즙에서 높은 수치를 나타냈으며, 그중 빨간색 파프리카 발효즙의 폴리페놀과 플라보노이드 총 함량이 541, 801 µg/mL로 가장 높은 함량을 나타냈다.
대상 데이터
- 발효에 사용된 유산균은 김치에서 분리된 유산균 (Lactobacillus plantarum, L. P)을 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth, difco) 50 mL에 접종하여 37℃, 150 rpm으로 24 h 배양한 것을 사용하였다. 배양된 유산균을 파프리카 빨간색과 녹색에 접종하여 37℃, 150 rpm으로 5일 간 발효 후, 고압으로 즙을 짜내어 400 mesh로 걸러낸 샘플을 파프리카 발효즙 시료로 사용하였다.
- P)을 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth, difco) 50 mL에 접종하여 37℃, 150 rpm으로 24 h 배양한 것을 사용하였다. 배양된 유산균을 파프리카 빨간색과 녹색에 접종하여 37℃, 150 rpm으로 5일 간 발효 후, 고압으로 즙을 짜내어 400 mesh로 걸러낸 샘플을 파프리카 발효즙 시료로 사용하였다.
- 신생아의 표피조직에서 분리한 human dermal fibroblast (HDF)는 Modern Tissue Technology (MTT, Korea) 로부터 구입하여, DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 배양액을 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 4-8 세대 세포를 실험에 이용하였다.
- 실험에 이용한 파프리카는 경상남도 진주에서 생산한 빨간색과 녹색을 각각 구매하여, 고압으로 즙을 짜서 400 mesh로 걸러낸 샘플을 생즙시료로 하였다.
- 본 실험에서는 파프리카를 이용한 생즙과 발효즙의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 실험법을 이용하였다. 양성대조군으로는 항산화 효과가 알려진 EGCG를 사용하였다. 그 결과, 생즙 2종보다 발효즙 2종에서 프리라디칼 소거효과가 높았으며, 특히 빨간색 파프리카 발효즙이 2% 농도에서 90% 정도의 프리라디칼 소거효과가 나타났으며 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.
데이터처리
- 각 시료별 평균 표준편차(Standard deviation, S.D)로 표기하였고, 실험데이터는 대조군과 샘플처리 그룹 간 Student’ t-test법을 이용하여 처리하였다.
이론/모형
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Aldrich, USA)를 이용하여 시료들의 자유라디칼 소거효과를 측정하는 Blois법을 활용하여 항산화 실험을 하였다[8]. 동일한 양의 시료와 함께 0.
- DPPH radical은 반응 시 청남색의 색차를 비색 정량 하여 시료가 갖는 free radical의 능력을 측정할 수 있다. 본 실험에서는 파프리카를 이용한 생즙과 발효즙의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 실험법을 이용하였다. 양성대조군으로는 항산화 효과가 알려진 EGCG를 사용하였다.
- 세포 노화 측정의 바이오마커인 β-galactosidase를 이용한 염색방법인 SA-β-gal assay를 통해 측정하였고, 이를 위해 senescence detection kit (sigma, USA)를 사용하였다.
- 이 방법은 식품뿐 아니라, 현재에는 EM 균을 이용한 발효사료나 균에서 유래한 효소제, 항생제 및 항균제, 생물농약 등 다양한 분야에서 사용되고 있는 보편적인 방법이다. 이러한 미생물 중 생육 시 산을 배출하여 위의 산성조건에서도 생존이 가능하며 항암물질과 Bacteriocin을 생성하는 것으로 알려진 유산균을 이용한 발효법을 선별하였다[7]. 이러한 유산균을 이용한 발효 물은 화장품에서 피부미용의 목적으로 익히 사용되고 있다.
- 파프리카의 생즙과 발효즙이 세포노화에 미치는 영향을 확인하기 위해 SA-β-galactosidase assay를 실시하였다.
성능/효과
- 파프리카의 생즙과 발효즙이 세포노화에 미치는 영향을 확인하기 위해 SA-β-galactosidase assay를 실시하였다. UVA를 조사 시 노화세포의 비율이 42% 정도 증가하였으며, 사멸된 세포도 관찰되어 UVA가 HDF의 생존을 억제함이 확인되었다. 시료 처리 시 노화세포의 비율이 농도 의존적으로 감소하였고, 파프리카의 생즙과 발효즙 모두 UVA로 인한 세포성장 억제로부터 HDF를 보호함을 확인하였다.
- 결론적으로, 파프리카 생즙보다는 발효즙이 유의 있게 항산화와 항노화 효능이 우수하게 나타났고, 항산화와 항노화 효능에서 가장 높은 효능을 나타낸 빨간색 파프리카 발효즙은 항산화와 항노화의 화장품 원료로 다양하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 결과 빨간색 파프리카 발효즙은 농도 의존적으로 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내었으며, 1%의 농도로 처리 시MMP-1 발현저해 효과는 29%를 나타났으며, 양성대조 군인 EGCG는 10 µM에서 43%의 MMP-1 발현저해 효과를 나타내었다(Figure 3).
- 양성대조군으로는 항산화 효과가 알려진 EGCG를 사용하였다. 그 결과, 생즙 2종보다 발효즙 2종에서 프리라디칼 소거효과가 높았으며, 특히 빨간색 파프리카 발효즙이 2% 농도에서 90% 정도의 프리라디칼 소거효과가 나타났으며 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.
- 본 실험은 glycation이 되면 형광물질이 형성되는데, 이 형광물질을 배양 24 h 배양 전후를 측정하여 glycation 정도를 평가하는 실험법으로 실험의 신뢰도를 위해 양성대조군으로 Aminoguanidine을 사용하였다. 그 결과, 파프리카 생즙보다 발효즙에서 최종 당화산물(advanced glycation end-products, AGEs) 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5).
- 통상의 발효 물 제조방식이 아닌 새로운 원료 제조방법인 즙을 짜는 방식을 사용하여 파프리카 생즙과 유산균을 이용한 발효즙의 항산화 및 항노화 효능을 비교하였다. 그 결과, 파프리카 생즙보다 유산균을 접종하여 발효한 파프리카 발효즙이 유의 있게 항산화와 항노화 효과가 높게 나타났다. 파프리카 발효즙 중에서는 빨간색 파프리카를 이용한 발효즙에서 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량이 높았고, 자유라디칼 소거능과 지질 과산화 억제효과도 가장 높게 나타났다.
- 이러한 지질의 과산화억제를 측정하기 위해 linoleic acid를 이용한 실험을 통해 파프리카 생즙 2종과 파프리카 발효즙 2종의 지질과산화 억제효과를 측정 하였다(Figure 1). 그 결과, 파프리카 생즙보다는 발효즙에서 지질과산화 억제율이 높았으며, 발효즙 중 빨간색 파프리카 발효즙 2% 농도에서는 90% 이상의 지질과산화 억제효과를 보였다. 이 결과는 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.
- 그 결과 빨간색 파프리카 발효즙은 농도 의존적으로 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내었으며, 1%의 농도로 처리 시MMP-1 발현저해 효과는 29%를 나타났으며, 양성대조 군인 EGCG는 10 µM에서 43%의 MMP-1 발현저해 효과를 나타내었다(Figure 3). 빨간색 파프리카 발효즙이 HDF에서 UVA에 의해 발현되는 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 한 결과, 단백질 발현결과와 동일하게 농도 의존적으로 MMP-1 mRNA 발현을 저해하는 것으로 나타났다(Figure 4).
- 뿐만 아니라, 빨간색 파프리카 발효즙은 노화와 연관된 당화생성 억제활성과 MMP-1 발현 억제효과, β-galactosidase활성 억제효과가 가장 높은 것으로 나타났다.
- UVA를 조사 시 노화세포의 비율이 42% 정도 증가하였으며, 사멸된 세포도 관찰되어 UVA가 HDF의 생존을 억제함이 확인되었다. 시료 처리 시 노화세포의 비율이 농도 의존적으로 감소하였고, 파프리카의 생즙과 발효즙 모두 UVA로 인한 세포성장 억제로부터 HDF를 보호함을 확인하였다. 그중 빨간색 파프리카 발효즙이 가장 높은 감소율을 보였다(Figure 6).
- 2배 증가하였다(Table 1). 이 결과들로 보아 파프리카 생즙보다는 발효즙에서 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량의 성분이 증가함을 알 수 있었다.
- 총 폴리페놀 함량 측정 결과, 파프리카 생즙 2종과 발효즙 2종 모두 발효즙에서 높은 수치를 나타냈으며, 그중 빨간색 파프리카 발효즙의 폴리페놀과 플라보노이드 총 함량이 541, 801 µg/mL로 가장 높은 함량을 나타냈다.
- 1배 높은 수치를 나타내었다. 총 플라보노이드 함량에서는 빨간색 파프리카 발효즙이 생즙보다 2.5배 증가하였고, 녹색 파프리카 역시 발효즙이 생즙보다 3.2배 증가하였다(Table 1). 이 결과들로 보아 파프리카 생즙보다는 발효즙에서 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량의 성분이 증가함을 알 수 있었다.
- 그 결과, 파프리카 생즙보다 유산균을 접종하여 발효한 파프리카 발효즙이 유의 있게 항산화와 항노화 효과가 높게 나타났다. 파프리카 발효즙 중에서는 빨간색 파프리카를 이용한 발효즙에서 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량이 높았고, 자유라디칼 소거능과 지질 과산화 억제효과도 가장 높게 나타났다. 뿐만 아니라, 빨간색 파프리카 발효즙은 노화와 연관된 당화생성 억제활성과 MMP-1 발현 억제효과, β-galactosidase활성 억제효과가 가장 높은 것으로 나타났다.
- 총 폴리페놀 함량 측정 결과, 파프리카 생즙 2종과 발효즙 2종 모두 발효즙에서 높은 수치를 나타냈으며, 그중 빨간색 파프리카 발효즙의 폴리페놀과 플라보노이드 총 함량이 541, 801 µg/mL로 가장 높은 함량을 나타냈다. 파프리카 생즙과 발효즙을 비교 시 총 폴리페놀 함량에서는 빨간색 파프리카 발효즙이 생즙보다 1.8배 높았고, 녹색 파프리카 발효즙은 생즙보다 2.1배 높은 수치를 나타내었다. 총 플라보노이드 함량에서는 빨간색 파프리카 발효즙이 생즙보다 2.
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