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문제 정의
- 27, 28) 그러나 노박덩굴의 항 발암에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 본 연구는 인체암세포를 이용한 MTT assay를 행하여노박덩굴의 암세포 증식 억제 효과를 알아보았고, 암 예방 효소계인 quinone reductase 유도활성효과를 측정하여 노박덩굴의 항 발암 효과를 검토하였다.
제안 방법
- 이를 위해 각 세포주를 1 X 104 cells/well 의 농도로 맞추고 96 well에 각각 200 "L씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl-sulfoxide (DMSO)에 녹여서 30, 60, 90, 120, 150 "g/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 "L씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 와 ethan이을 1 : 1로 혼합한 용액 200 "L를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 각각의 암세포주를 세포배양용 petridish에 24시간 동안 안정화시킨 다음 노박덩굴 분획물을 60, 120, 180, 240, 300 "g/mL씩 농도별로 처리하여 48시간동안 배양한 후 현미경을 이용하여 200 배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 형태변화를 관찰한 다음 Olympus DP70을 이용하여 촬영하였다.
- 노박덩굴 분획물 중 암세포 증식 억제 효과에서 가장 높은 활성을 보인 methanol 분획층인 COMM층의 처리가 각 4 종의 암세포주에 어떠한 영향을 미치는지에 알아보고자 본 실험을 수행하였다 노박덩굴의 COMM층을 contr이군을 제외하고 각각 60, 120, 180, 240 및 300 "g/mL씩 첨가하여 48시간 배양 후 위상차 현미경을 이용하여 형태학적인 변화를 관찰한 결과를 Fig. 5에 나타내었다. COMM 층의 첨가에 따라 각 세포의 밀도 감소 현상과 형태학적인 변화가 나타났으며, 시료의 농도증가에 따라 세포막과 세포질의 손상과 세포의 부착력이 상실됨을 알 수 있었고 파괴된 잔여물과 더불어 뚜렷한 암세포의 형태적 변화를 관찰 할 수 있었다 HT- 29세포주에서와 같이 다른 세포주에서도 거의 같은 경향을 보였는데 (Data not shown), 이것으로 보아 암세포의 심한 형태적 변형의 정도는 노박덩굴 분획물의 처리에 따라 암세포 증식이 억제되었음을 보여준다고 할 수 있겠다.
- 이용한다. 이를 위해 각 세포주를 1 X 104 cells/well 의 농도로 맞추고 96 well에 각각 200 "L씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl-sulfoxide (DMSO)에 녹여서 30, 60, 90, 120, 150 "g/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 "L씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 와 ethan이을 1 : 1로 혼합한 용액 200 "L를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 암 예방 물질의 탐색에 많이 사용되어 왔다.13-15) 노박덩굴 분획물의 암 예방 효소 유도여부를 조사하기 위하여 암세포 증식억제효과에 사용된 4종의 암세포주 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 간암세포주인 HepG2를사용하여 QR유도활성 효과를 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 6 에 나타내었다. COMM 층의 경우 그 효과가 다른 분획 층에 비하여 월등히 높았으며 20, 40, 60, 80 및 120 "g/mL의 시료를 첨가하였을 때 control 1.
- 노박덩굴 분획물의 항 발암 효과를 알아보기 위하여 노박덩굴을 메탄올로 추출한 후, 다시 핵산, 메탄올, 부탄올, 물로 순차적으로 분획 추출하여 각 분획별로 암세포증식 억제에 대한 효과와 암 예방 지표인 QR 유도 활성 효과를 측정하였다. 4종의 암세포주인 HepG2, MCF-7, HT29 및 B16F10 을 이용하여 암세포 증식 억제 실험을 한 결과 모든 암세포에서 methan이층인 COMM층에서 다른 층에 비해서 높은 암세포 증식 억제효과가 나타났다.
- 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 20 "L씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 와 ethan이을 1 : 1로 혼합한 용액 200 "L를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 본 실험에서는 4종의 암세포주에 대한 노박덩굴 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 조사하기 위해 MTT (3- [4, 5-di- methylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) as- say를 행하였다. 실험에는 간암세포주인 HepG2, 유방암 세포주인 MCF-7 대장암세포주인 HT29, 및 피부암세포주인 B16-F10이 사용되었으며 실험결과는 Fig.
- 본 실험에서는 Prochaska와 Santamaria의 방법34)을 일부 변형하여 측정하였다. 세포배양용 petridish에 HepG2 세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1 X 104 cells/mL 되도록 세포를 분주하여 37C, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 노박덩굴 분획물을 HepG2의 세포생존율이 50% 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 20, 40, 60, 80, 120 "g/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 배양하였다.
- 이 추출물을 각 용매별로 분획하여 hexane층 (COMH), methan이층 (COMM), butanol층 (COMB) 및 수층분획물 (COMA)로 각각 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 얻은 노박덩굴 분획물의 시료를 본 실험에 사용하였다 (Table 1).
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 암 세포주는 인체 간암세포주인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 유방암세]포주인 MCF- 7 (human breast adenocarcinoma pleural effusion) 과대장암세포주인 HT29 (human colon adenocarcinoma) 와 마우스 유래의 피부암세포주인 B16-F10 (mouse mela noma) 과 인간 유래의 섬유아세포주인 NHDF (normal hu man dermal fibroblast)를 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하여 배양시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus, CO) 은 2005년 10월 강원도 인제군에 위치한 민속 약초 연구회에서 제공받았다. 이 시료를 추출하고 각 용매별로 분획하여 4종의 암세포주에 대한 암세포 증식 억제 효과 (cytotoxi city) 및 quinone reductase 유도활성 효과 (QR induced effect) 검색에 사용하였다 세포실험에 사용 된 시약 중 NP- 40과 menadione은 Sigma사 제품을 구입하였고 flavin ade nine dinucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose-6-phos- phate dehydrogenase는 Amresco사 제품을 구입하였으며, Dulbecco's Ea읺e modified medium (DMEM)과 fetal bo vine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS) 등은 Gibco-BRL (USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용 된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
- 시료로 사용 된 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus, CO) 는건조 후 분쇄하여 시료와 methan이을 1 :5 (W/V)로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성 물질을 선별하여 추출하기 위해 ethan이과 dichloromethane (CH2CL)을 1 :1로 섞은 용액에 2회 추출하고 회전식 진공농축기로 감압농축 시켜 동결건조 후 노박덩굴의 추출물 (COM)을 얻었다. 이 추출물을 각 용매별로 분획하여 hexane층 (COMH), methan이층 (COMM), butanol층 (COMB) 및 수층분획물 (COMA)로 각각 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 얻은 노박덩굴 분획물의 시료를 본 실험에 사용하였다 (Table 1).
- 행하였다. 실험에는 간암세포주인 HepG2, 유방암 세포주인 MCF-7 대장암세포주인 HT29, 및 피부암세포주인 B16-F10이 사용되었으며 실험결과는 Fig. 1~4에 나타내었다.
- 제공받았다. 이 시료를 추출하고 각 용매별로 분획하여 4종의 암세포주에 대한 암세포 증식 억제 효과 (cytotoxi city) 및 quinone reductase 유도활성 효과 (QR induced effect) 검색에 사용하였다 세포실험에 사용 된 시약 중 NP- 40과 menadione은 Sigma사 제품을 구입하였고 flavin ade nine dinucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose-6-phos- phate dehydrogenase는 Amresco사 제품을 구입하였으며, Dulbecco's Ea읺e modified medium (DMEM)과 fetal bo vine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS) 등은 Gibco-BRL (USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용 된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에 대한 실험결과는 세 번 실험하여 얻어진 평균치 및 표준편차를 나타내었고, 그룹간의 통계적 차이는 student's t-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 노박덩굴 분획물의 암세포 증식 억제 효과는 MTT (3- [4, 5-dimethyl thiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bro mide) assay를 사용하여 행하였다.
- 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색빙■법으로 정량하였다. 24 well plate에 crystal violet 용액을 첨가하고 37C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 증류수로 세척하였다 각 well에 0.
성능/효과
- 암 예방법은9, 10) 특정 천연물이나, 합성물에 의해 암신생 종양의 진행을 저해하고 차단하는데 그 목적을 두고 있으며, 화학적 암 예방을 이해하는 것은 암을 예방하는 효과적인 전략이 될 수 있다.11) 또한 quinone reductase (QR), gluthathione S-transferase (GST), glutathione (GSH) 등의 효소 측정을 통하여 암 예방 물질들이 조사되고 있으며, 12) 특히 QR 은 간세포에서 주로 생성되는 Phase II enzyme 의 한 종류로 quinone을 환원시켜 무독하게 만들고 발암물질에 의해 일어나는 돌연변이와 종양화를 막아주는 대표적인 효소이며 암 예방에 대한 연구에 많이 이용되고 있다.
- 4종의 암세포주인 HepG2, MCF-7, HT29 및 B16F10 을 이용하여 암세포 증식 억제 실험을 한 결과 모든 암세포에서 methan이층인 COMM층에서 다른 층에 비해서 높은 암세포 증식 억제효과가 나타났다. 특히 B16F10에 대한 암세포증식 억제효과는 최저 농도인 60 "g/mL농도에서 92.
- 5에 나타내었다. COMM 층의 첨가에 따라 각 세포의 밀도 감소 현상과 형태학적인 변화가 나타났으며, 시료의 농도증가에 따라 세포막과 세포질의 손상과 세포의 부착력이 상실됨을 알 수 있었고 파괴된 잔여물과 더불어 뚜렷한 암세포의 형태적 변화를 관찰 할 수 있었다 HT- 29세포주에서와 같이 다른 세포주에서도 거의 같은 경향을 보였는데 (Data not shown), 이것으로 보아 암세포의 심한 형태적 변형의 정도는 노박덩굴 분획물의 처리에 따라 암세포 증식이 억제되었음을 보여준다고 할 수 있겠다.
- Fig. 1은 인체 간암세포주인 HepG2에 대한 결과로 노박덩굴 분획물을 농도별로 첨가했을 때 methanol 분획층인 COMM층의 경우 120 “g/mL의 농도에서 86.22%의 가장 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었고, 다음으로 COMB 층에서 최종 농도인 300 “g/mL에서는 65.82%의 효과를 나타내었으며 그 외의 층에서는 유의적인 효과를 볼 수 없었다. Fig.
- 82%의 효과를 나타내었으며 그 외의 층에서는 유의적인 효과를 볼 수 없었다. Fig. 2는 유방암 세포주인 MCF-7에 대한 결과이며 COMM층을 60 “g/mL 첨가했을 때 이미 83.06%의 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, 그 이후의 농도에서도 계속 그 효과가 지속되었음을 볼 수 있었다. COMB의 경우 저농도에서는 별다른 효과가 없었으나, 최종 농도인 300 “g/ mL에서 50.
- 51%의 암세포 증식 억제 효과를 보였다. Fig. 3 은 대장암세포주인 HT29에 대한 실험결과를 나타내었으며 COMM층에 대한 효과는 앞서 두 암세포주인 HepG2와 MCF-7의 효과와 유사한 결과를 나타내었으며, COMM 층에서 가장 높은 암세포 증식 억제 효과를 보였으며 MCF-7와같이 최저농도 60 “g/mL 농도에서 69.10%의 암세포 증식억제 효과를 보였고, 최종 농도인 300 “g/mL 농도에서는 90.46%의 억제율을 보였다. 특히, COMA층의 경우 HepG2 와 MCF-7에서는 거의 효과가 없었으나 HT29 세포주에서는 최종농도인 300 "g/mL의 농도에서 56.
- 27배로 나타났으며 80 "g/mL 의 농도에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 다음으로 COMB 층의 경우 control^ 비해 1.2, 1.23, 1.43, 1.76 및 2.11 배로 COMM 층에 비해서는 낮으나 유의적인 QR 유도 활성이 나타났으며, COMH층과 COMA층에서는 거의 QR 유도 활성 효과를 볼 수 없었다.
- 있었다. 또한 이러한 결과는 본 연구실에서 연구된 다른 시료들과 비교해 볼 때, 미역귀, 모자반 등의 해조류 분획물과 해양생물인 키조개 분획물 그리고 육상식물인 적채 분획물에서의 QR 유도 활성 효과 보다 더 높은 결과라 할 수 있다. 35-38) 앞으로 더욱더 심도 있는 연구를 통해 생리활성 물질을 규명하여 기능성식품개발에 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료되어진다.
- 63%의 약한 억제효과를 보였다. 사용한 4가지 암세포주중 B16F- 10 세포주가 가장 그 효과가 큰 것으로 나타났다.
- 이상의 결과에서 암 예방 효과의 척도로 사용되는 QR 유도 활성 효과는 노박덩굴의 여러 용매 분획물 중 methanol 층에서 그 효과가 가장 컸고, 다음으로 butan이층에서도 활성효과를 보였으므로 주로 methanol층 분획층과 buthanol 분획층에 quinone reductase의 inducer가 존재함을 추정할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 본 연구실에서 연구된 다른 시료들과 비교해 볼 때, 미역귀, 모자반 등의 해조류 분획물과 해양생물인 키조개 분획물 그리고 육상식물인 적채 분획물에서의 QR 유도 활성 효과 보다 더 높은 결과라 할 수 있다.
- 이상의 결과에서 용매별로 분획한 노박덩굴 분획물이 각 암 세포주에 미치는 증식 억제 효과는 4가지 사용 암세포주서 모두 methanol 분획층인 COMM층에서 그 효과가 가장 뚜렷하게 나타났으며, 다음으로 butanol 분획층인 COMB 층이었다. 즉 암세포 증식을 억제시키는 생리활성 물질은 약한 극성물질이 녹아있는 methanol 분획층인 COMM층에 주로 존재 존재한다고 추측해 볼 수 있으며 이 층에서의 활성 물질의 구조에 대한 분석과 암세포 증식을 저지시키는 물질의 존재가 주목되는 바이다.
후속연구
- 또한 이러한 결과는 본 연구실에서 연구된 다른 시료들과 비교해 볼 때, 미역귀, 모자반 등의 해조류 분획물과 해양생물인 키조개 분획물 그리고 육상식물인 적채 분획물에서의 QR 유도 활성 효과 보다 더 높은 결과라 할 수 있다. 35-38) 앞으로 더욱더 심도 있는 연구를 통해 생리활성 물질을 규명하여 기능성식품개발에 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료되어진다.
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