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문제 정의
- 본 연구에서는 자석으로 분리가 가능한 amylase가 coating 된 nanofiber를 사용하여 고정화 효소의 활성도, 안정성, 재사용 가능성, 및 온도효과를 분석하였으며 이를 토대로 연속식 효소 공정을 개발하여 starch의 분해효율을 조사 하였다.
- 본 연구에서는 효소 고정화 담체를 제조하는데 있어서 nanofiber에 ironoxide nanoparticle을 함유하도록 함으로서 자석에 의해 분리가 가능하도록 제조하였다. 실험 방법을 통하여 제조한 고정화 효소의 재사용 가능성을 조사하기 위해 고정화 효소를 반응시킨 후 자석으로 회수하여 다시 녹말을 분해하는 과정을 되풀이 하였다.
제안 방법
- 기질농도에 따라 분해 속도를 측정하여 Michalis- Menten 식을 사용하여 고정화 효소의 Vm 값과 Km 값을 추정하였다. Vm 값과 반응에 사용된 효소농도를 이용하여 사용된 생촉매의 kcat 값을 계산함으로써 고정화 효소의 특성을 조사 하였다.
- a-Ainylase의 활성도는 기질인 녹말을 분해하는 속도를 기준으로 측정하였다. 증류수에 용해가 가능한 녹말을 20mM sodium acetate buffer°]] 녹여 1 g/1 가 되도록 한 후 효소 (0.
- 고정화 효소를 사용하여 연속적으로 녹말을 분해할 수 있는 시스템을 개발하여 작은 크기의 반응기를 이용하여 실험을 수행하였다. 반응 부피를 2nd로 하고 자석으로 분리 가 가능한 고정화 효소의 양을 1.
- 또한 효소의 활성도는 녹말의 분당 분해속도를 측정하여 나타내었으며 이는 효소 첨가 후 100 μ1 샘플을 iodine solution 900 μ1에 섞은 다음405nm에서 흡광도를 측정하였으며 보정곡선을 사용하여 녹말의 농도를 계산하여 표시하였다. 고정화된 효소의 안정성은 고정화 효소를 buffer에 넣어 200 rpm 교반조건 하에서 온도에 따른 활성도의 감소를 측정하였다.
- 녹말의 분해속도는 37도 200 rpm에서 반응을 수행하였다. 또한 효소의 활성도는 녹말의 분당 분해속도를 측정하여 나타내었으며 이는 효소 첨가 후 100 μ1 샘플을 iodine solution 900 μ1에 섞은 다음405nm에서 흡광도를 측정하였으며 보정곡선을 사용하여 녹말의 농도를 계산하여 표시하였다. 고정화된 효소의 안정성은 고정화 효소를 buffer에 넣어 200 rpm 교반조건 하에서 온도에 따른 활성도의 감소를 측정하였다.
- 수행하였다. 반응 부피를 2nd로 하고 자석으로 분리 가 가능한 고정화 효소의 양을 1.0 mg 첨가하였으며 출구로 고정화 효소가 유출되지 않도록 하기 위하여 nanofilter를 설치하였다. Syringe pump를 이용하여 유량을 조절하여 반응기에 기질이 머무는 체류시간을 조절하여 체류시간 변화에 따른 녹말의 전환율을 측정하여 Fig.
- 생성물을 nanofilter가 장착된 유출구로 유출되었으며 이때 외부 유출되는 nanofiber는 없었다. 반응기로 주입되는 기질의 농도는 30 g/1 로 했으며 반응기로 주입되는 기질의양은 syringe pump (Harvard PHD2000 syringe pump,Plymouth, PA USA)를 사용하여 유량을 조절하였다. 반응기의 체류시간은 syringe pump의 유속을 조절하여 정하였으며 효소반응을 위해 유속은 조절 후 정상상태가 된 후 녹말의 농도를 측정하고 다른 유량으로 변경하여 체류시간을 바꾸면서 전환율을 측정하였다.
- 반응기로 주입되는 기질의 농도는 30 g/1 로 했으며 반응기로 주입되는 기질의양은 syringe pump (Harvard PHD2000 syringe pump,Plymouth, PA USA)를 사용하여 유량을 조절하였다. 반응기의 체류시간은 syringe pump의 유속을 조절하여 정하였으며 효소반응을 위해 유속은 조절 후 정상상태가 된 후 녹말의 농도를 측정하고 다른 유량으로 변경하여 체류시간을 바꾸면서 전환율을 측정하였다.
- 본 실험을 통하여 만든 nanofiber를 SEM을 사용하여 촬영하였다 (Fig. 1). PANI nanofiberS] 경우에는 직경이 수십에서 수백 nm의 fiber가 서로 엉켜져 fiber 사이로 다공성의 nanopore가 형성되어 있어 기질이 nanofiber 사이로 전달되어 반응이 일어나게 된다.
- 본 연구에서는 효소 고정화 담체를 제조하는데 있어서 nanofiber에 ironoxide nanoparticle을 함유하도록 함으로서 자석에 의해 분리가 가능하도록 제조하였다. 실험 방법을 통하여 제조한 고정화 효소의 재사용 가능성을 조사하기 위해 고정화 효소를 반응시킨 후 자석으로 회수하여 다시 녹말을 분해하는 과정을 되풀이 하였다. 재활용결과는 Fig.
- 자석으로 분리가 가능한 a-Amylase가 코팅된 나노 고분자를 제조하여 녹말의 분해공정에 활용하였다. 본 연구에서 개발된 고정화 효소의 안정성은 크게 증가하여 상온에서 200 rpm으로 교반하면서 보관한 경우 30일 동안에 92.
- 5 mg) 를 반응 부피가 2 ml인 반응기에 넣고 200 rpm으로 섞어주면서 효소 반응을 진행하였다. 정해진 시간에 50 ul를 회수하여 반응 농도를 측정하였다. 반응물의 초기 농도는 30 g/1 와 45 g/1 로 하여 녹말의 분해를 측정하였다.
- 측정하였다. 증류수에 용해가 가능한 녹말을 20mM sodium acetate buffer°]] 녹여 1 g/1 가 되도록 한 후 효소 (0.1 mg) 또는 고정화 효소 (0.5 mg)를 첨가한 후 반응을 시작하여 시간에 따라 남아있는 녹말의 농도를 측정함으로써 효소의 활성도를 측정하였다. 녹말의 분해속도는 37도 200 rpm에서 반응을 수행하였다.
- 초기 녹말 농도를 변화 시키면서 녹말 분해 속도를 측정하였다. 기질농도에 따라 분해 속도를 측정하여 Michalis- Menten 식을 사용하여 고정화 효소의 Vm 값과 Km 값을 추정하였다.
- 효소 반응을 통한 녹말의 분해 정도를 측정하기 위해 회분식 반응기를 사용하여 녹말을 분해 하였다. 초기 녹말의 농도를 45 g/1 로 하여 반응을 시작하여 40분 동안 반응하여 남아있는 녹말의 농도를 측정하였다 (Fig.
- 효소의 반응 속도를 결정하는 중요한 요인의 하나인 온도에 따른 효소의 활성도를 측정하였다. Fig.
대상 데이터
- Louis, USA) 에서 구입하였으며 ironoxide nanoparticle의 size는 평균 20-100nm 을사용하였으며 표면을 HC1 을 이용 개질 한 후 사용하였다.25% glutaraldehyde는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 실험에 사용된 시약은 시중에서 구할 수 있는 시약 중에 높은 등급의 시약을 사용하였다.
- Starch 분해 효소인 amylase, 및 p-nitrophenyl-p-D-gluco- side (pNPG)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 에서 구입하였으며 ironoxide nanoparticle의 size는 평균 20-100nm 을사용하였으며 표면을 HC1 을 이용 개질 한 후 사용하였다.25% glutaraldehyde는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 실험에 사용된 시약은 시중에서 구할 수 있는 시약 중에 높은 등급의 시약을 사용하였다.
이론/모형
- 0) at 37℃. Kinetic constants were obtained by using software (Enzyme Kinetics Pro from ChemSW, Farifield, CA) that per-forms nonlinear regression based on the least-square method.
- 기질농도에 따라 분해 속도를 측정하여 Michalis- Menten 식을 사용하여 고정화 효소의 Vm 값과 Km 값을 추정하였다. Vm 값과 반응에 사용된 효소농도를 이용하여 사용된 생촉매의 kcat 값을 계산함으로써 고정화 효소의 특성을 조사 하였다.
성능/효과
- 초기 녹말의 농도를 45 g/1 로 하여 반응을 시작하여 40분 동안 반응하여 남아있는 녹말의 농도를 측정하였다 (Fig. 2), 40분 만에 45 g/1 의 녹말이 io。% 분해되었으며 본 연구에 사용된 자석으로 분리가 가능한 고정화 효소는 반응 후 회수가 가능하였다. 녹말의 분해속도는 높은 녹말의 농도에서 일정하게 감소 되었으며 농도가 감소함에 따라 분해속도가 감소되는 전형적인 효소반응의 형태를 나타내고 있다.
- 따른 효소의 활성도를 측정하였다. Fig. 5(a)의 결과를 보면 낮은 온도에서 효소의 활성도는 낮은데 비해 온도가 증가함에 따라 효소의 활성도가 증가함을 볼 수 있었고 60℃ 이상에서는 amylase의 활성도가 급격히 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 이는 효소가 열에 의해 쉽게 변성되는 것을 의미하며 고정화되지 않은 효소의 경우에는 50℃ 이상이 되면서 활성도가 급격히 떨어지는데 비해 고정화된 효소의 경우에는 60℃ 이상에서 떨어지는 것을 보여 고정화에 의해 효소의 열 안정성이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다.
- 2%의 활성도 회수율을 보여 효소의 재사용 가능성을 확인시켜 주었다. 고정화 효소 0.5mg을 사용하여 녹말 분해 공정에 활용하였을 때 2 ml의 40 g/I 녹말 용액을 40분만에 완전히 분해 시켰다 이러한 고정화 효소를 사용하여 연속 효소반응기를 개발하여 녹말 분해공정에 활용한 결과 체류시간을 1시간으로 하였을 때 녹말 30 g/1 를 76% 분해시켜 산업적으로 활용 가능성을 보여 주었다
- 7%의 활성도를 유지하였다. 고정화 효소를 자석을 이용하여 재사용한 경우 10회 동안 사용했을 경우 95.2%의 활성도 회수율을 보여 효소의 재사용 가능성을 확인시켜 주었다. 고정화 효소 0.
- 고정화 효소의 ket 값과 비고정화 효소의 kcat 값을 비교하면 고정화 효소의 생촉매 활성도가 비고정화 효소의 23.7%임을 알 수 있었고 기질에 대한 친화도인 Km값의 경우에는 비고 정화 효소의 경우 1.63 g/1 인데 비해 고정화 효소의 경우에는 3.57 g/1 로 2.2배 이상의 증가를 보여주고 있다. 이러한 현상은 효소의 고정화에 따라 기질이 효소로 접근하는 물질전달에서 효소 자체의 변화에 따라 기질의 친화도가 감소된 것으로 판단된다.
- 반응물의 체류 시간이 1시간일 때 녹말의 전환율은 76%로 나타났다, 체류 시 간 증가에 따라 녹말의 전환율은 증가 하였으나 체류 시간이 1시간 이상이 되는 경우에는 체류시간 증가에도 녹말의 전환율이 크게 증가하지 않아 연속 효소반응기를 사용하는 경우 물질 전달 등의 이유로 완벽한 전환이 이루어지지 않음을 보이고 있다. 또한 연속 반응기를 사용하는 경우에는 회분식 반응기를 사용하는 경우보다 효소반응속도가 느린 것으로 나타났으며 녹말을 100% 전환시키기 위해서는 효소의 양의 증가뿐만 아니라 다단계 효소반응기가 필요할 것으로 판단되었다.
- 6에 나타내었다. 반응물의 체류 시간이 1시간일 때 녹말의 전환율은 76%로 나타났다, 체류 시 간 증가에 따라 녹말의 전환율은 증가 하였으나 체류 시간이 1시간 이상이 되는 경우에는 체류시간 증가에도 녹말의 전환율이 크게 증가하지 않아 연속 효소반응기를 사용하는 경우 물질 전달 등의 이유로 완벽한 전환이 이루어지지 않음을 보이고 있다. 또한 연속 반응기를 사용하는 경우에는 회분식 반응기를 사용하는 경우보다 효소반응속도가 느린 것으로 나타났으며 녹말을 100% 전환시키기 위해서는 효소의 양의 증가뿐만 아니라 다단계 효소반응기가 필요할 것으로 판단되었다.
- 제조하여 녹말의 분해공정에 활용하였다. 본 연구에서 개발된 고정화 효소의 안정성은 크게 증가하여 상온에서 200 rpm으로 교반하면서 보관한 경우 30일 동안에 92.7%의 활성도를 유지하였다. 고정화 효소를 자석을 이용하여 재사용한 경우 10회 동안 사용했을 경우 95.
- 4에 나타내었다. 본 연구에서 제조된 자석으로 분리가 가능한nanofiber enzymee Fig. 4의 결과에서 보는 바와 같이 10차례 이상 재사용 했을 때 활성도가 95% 이상으로 녹말의 전환공정에서 산업적인 활용이 가능 할 것으로 판단된다. Fig.
- 온도가 증가함에 따라 효소의 활성도는 시간이 지남에 따라 감소하는 현상을 보이는데 이는 다른 효소들과 같이 고정화 효소도 열에 의해 활성도가 감소되는 현상을 관찰할 수 있다. 비고정화 효소의 안정성은 시간이 지날수록 활성도가 급격히 감소하는 현상을 보여 상온에서 2일 지난 후 60%의 활성도가 감소하였으나 상온에서의 고정화 효소의 활성도는 장기간 활성도가 유지되어 92.7%의 안정성을 보이고 있으나 40℃ 에서는 고정화 효소의 안정성이 감소하는 현상을 보이며 60℃에서는 하루 만에 활성도가 모두 없어지는 현상을 보여 고정화 효소 도열에 대한 안정성은 고정화 하지 않은 효소보다는 증가하지만 높은 온도에서는 우수한 안정성을 유지하지 못하는 결과를 보였다.
- 5(a)의 결과를 보면 낮은 온도에서 효소의 활성도는 낮은데 비해 온도가 증가함에 따라 효소의 활성도가 증가함을 볼 수 있었고 60℃ 이상에서는 amylase의 활성도가 급격히 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 이는 효소가 열에 의해 쉽게 변성되는 것을 의미하며 고정화되지 않은 효소의 경우에는 50℃ 이상이 되면서 활성도가 급격히 떨어지는데 비해 고정화된 효소의 경우에는 60℃ 이상에서 떨어지는 것을 보여 고정화에 의해 효소의 열 안정성이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다.
- 자석으로 분리가 가능한 polyaniline nanofiber의 제조를 위해서 ironoxide 나노입자를 고분자 중합 시 첨가하여 반응을 시켜 polyaniline 중합시 nanoparticle 등이 끼워 들어가는 형태 또는 nanoparticle 표면에 polyaniline이 coating 되는 형태의 자석에 의해 분리가 가능한 나노입자 또는 nano- fiber의 제조가 가능하였다. 이렇게 제조된 나노 fiber는 증류수로 4번 이상 씻은 다음 효소의 고정화를 위해 냉장고에 보관하여 두었다.
- 안정성을 획기적으로 개선하였다. 특히 열 안정성 측면에서 기존의 효소보다도 10도 이상에서 안정한 효과를 나타냈으며 상온에서 고정화된 효소는 격렬하게 흔드는 조건하에서도 안정성을 30일 이상 유지하는 특성을 보여 산업적으로 활용 가능성을 보여주고 있다. 특히 자석으로 분리가 가능하게 함으로서 재사용이 가능하였다.
후속연구
- 연속 반응기에서 체류시간이 1시 간일 때 30 g/1 녹말의 전환율이 76%이었다. 효소반응기의 연속공정의 사용이 가능해짐으로서 효소 사용량을 현저히 감소시킬 수 있으며 이를 이용한 효소전환 반응의 상업적인 활용이 가능할 것이다.
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