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문제 정의
- 균주를 nutrient broth에 접종하여 37’C에서 14~16시간 동안 진탕 배양한 후, 1 ~2xl09 cell/mL의 농도가 되도록 희석하여 사용하였다. 돌연변이 유발 물질로는 직접 돌연변이 원인 4-NQO와 sodium azide를 사용하였고, 이들이 사용 농도에서 돌연변이를 유발하는지 확인하였따. 또한, 시료의 농도는 돌연변이 실험을 실시하여 돌연변이능이 나타나지 않는 범위 내에서 결정하였다.
- 그러나 앞서 언급한 활성산소로 인한 생체의 산화적 손상 중 핵산 장해로 인하여 나타나는 돌연변이에 대한 오미자의 항돌연변이 활성 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 오미자의 생리활성에 대한 기초 자료를 얻고자 천연 항산화제로 이용 가능성을 시험하기 위하여 오미자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 능과 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량을 분석하였고, Ames test를 통한 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 측정하였다.
제안 방법
- (Re et al 1998)으로 측정하였다. 즉, 증류수 5 “와 오미자 에탄올 추출물 1 mL, Folin & Ciocalteau's phenol(FC)시약 0.5 mL를 혼합하여 8분간 상온에서 반응시 킨 후 7% Na2CO3 10 "를 첨가한 후 증류수를 이용하여 최종 부피를 25 mL 로 조정하였다. 이 혼합 용액을 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, hesperetin을 표준물질로 한 검량 곡선을 이용하여 시료의 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 돌연변이 유발 물질로는 직접 돌연변이 원인 4-NQO와 sodium azide를 사용하였고, 이들이 사용 농도에서 돌연변이를 유발하는지 확인하였따. 또한, 시료의 농도는 돌연변이 실험을 실시하여 돌연변이능이 나타나지 않는 범위 내에서 결정하였다. 멸균시킨 cap tube에 시료 50 와 변이 원 50 아 L, 균 배양액 100 아 L를 넣은 후 phosphate buffer!- 첨가하여 최종 부피를 700 a로 맞추었다.
- Salmonella 변이주가 실험에 이용되었다. 본 실험에서는 base pair substitutiorr을 일으킨 돌연변이주인 Salmonella thyphimurium TAI00을 이용하여 4-NQO와 sodium azaid에 대한 시료의 항돌연변이 활성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 오미자 에탄올 추출물의 항산화 활성과 총폴리 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정하고, Salmonella typhimurium TA 100을 이용하여 항돌연변이 활성을 분석하였다. 오미자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 500/zg/assay의 농도에서 57%이었고, IC50값이 435 /zg/assay 으로 나타나 비교적 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다.
- a/(2000)의 방법을 통하여 측정하였다. 시료 0.5 mL와 10% aluminum nitrate 1 mL, 1 M potassium acetate 1 mL, 80% ethanol 4.3 mL를 혼합하여 40분간 방치한 후, 510 파에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 하여 검량곡선으로부터 구하였다.
- 5xl(T3 * 5 * * M DPPH 2 mL를 혼합한 용액을 37℃에서 30 분간 반응시킨 후, UV/Visible spectrophotometer(Beckman, USA) 를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 무첨가 군의 흡광도를 100%로 하여 DPPH 라디칼에 대한 시료의 라디칼 소거능은 아래의 식에 따라 산출하얬고, DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도인 IC50값을 구하였다.
- 방법을 변형하여 추출하였다. 오미자 100 으에 70% 에탄올 20배를 가하여 실온에서 12시간 추출한 후 여과지로 여 과하였고, 회 전감압농축기 (EYELA, Rikakikai, Co, Japan) 로 농축한 후 동결건조하여 냉동보관하며 사용하였다.
- 오미자 에탄올 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다(Blois MS 1958). 0.
- 5 mL를 혼합하여 8분간 상온에서 반응시 킨 후 7% Na2CO3 10 "를 첨가한 후 증류수를 이용하여 최종 부피를 25 mL 로 조정하였다. 이 혼합 용액을 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, hesperetin을 표준물질로 한 검량 곡선을 이용하여 시료의 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 3 mL를 혼합하여 40분간 방치한 후, 510 파에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 하여 검량곡선으로부터 구하였다.
- 항돌연변이 활성 측정에 앞서 돌연변이원과 시료의 돌연변이 활성을 검증하였다. 실험 결고}, 세포 내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발하는 직접 돌연변이 원인 4-NQO와 sodium azaid는 대조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켰으나, 시료는 사용된 농도에서 돌연변이를 유발하지 않아 항돌연변이 실험에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 1).
대상 데이터
- 실험에 사용된 오미자는 음건된 형태로 시판되는 국내산 한약 규격품을 대구 약령시 에서 구입하여 사용하였고, Han et a/(2006)의 방법을 변형하여 추출하였다. 오미자 100 으에 70% 에탄올 20배를 가하여 실온에서 12시간 추출한 후 여과지로 여 과하였고, 회 전감압농축기 (EYELA, Rikakikai, Co, Japan) 로 농축한 후 동결건조하여 냉동보관하며 사용하였다.
데이터처리
- plates. 2) Values in the same column with the different letters are significantly difforent(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- onplates. Values in the same column with the different letters are significantly different(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- )를 이용하여 통계처리하였다. 각 실험군의 유의성은 ANOVA를 통한p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 검정하였고, Student's 『-test를 통하여 돌연변이 활성 측정에서 시료와 양성 대조군간의 차이를 검정하였다.
이론/모형
- 세균의 변이주가 DNA 손상 물질에 대한 항돌연변이 활성검색 시험에 이용될 수 있음이 알려지고 Maron & Ames(1983) 에 의해 항돌연변이 활성 실험법이 확-립되어 histidine 요구주인 Salmonella 변이주가 실험에 이용되었다. 본 실험에서는 base pair substitutiorr을 일으킨 돌연변이주인 Salmonella thyphimurium TAI00을 이용하여 4-NQO와 sodium azaid에 대한 시료의 항돌연변이 활성을 측정하였다.
- 오미자 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Danis 법 (Re et al 1998)으로 측정하였다. 즉, 증류수 5 “와 오미자 에탄올 추출물 1 mL, Folin & Ciocalteau's phenol(FC)시약 0.
- 오미자 에탄올 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Moreno et a/(2000)의 방법을 통하여 측정하였다. 시료 0.
- 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받은 Salmonella typhimurium TA100 균주를 이용하여 Maron & Ames(1983)의 방법으로 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성을 측정하였다. 균주를 nutrient broth에 접종하여 37’C에서 14~16시간 동안 진탕 배양한 후, 1 ~2xl09 cell/mL의 농도가 되도록 희석하여 사용하였다.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 5-500 /zg/assay의 농도에서 오미자는 0.5 ~57.2%의 전자공여능을 나타내어 농도가 증가할수록 DPPH radical 소거 활성이 유의적으로 증가는 경향을 보였고, 500 /zg/assay의 농도에서 50%가 넘는 항산화 활성을 나타내어 5-500 /zg/assay의 농도에서 2.9 ~ 89.9%의 전자 공여능을 나타낸 합성 항산화제 BHT의 전자공여 능보다는 낮게 나타났으나, Kim et a/(2004) 과 Lee et al (2003)에 의해 보고된 오미자 열수 추출물의 항산화 활성 (33.5%)과 메탄올 추출물의 항산화 활성(1.4%)보다 본 실험의 에탄올 추출물이 더 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한, 오미자 에탄올 추출물의 ICso값은 435.
- 7%로 오미자보다 높았으나, 수영의 헥산 분획과 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획의 항돌연변이 활성(8~39%) 보다는 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성이 높게 나타났다(Lee et al 2001). 따라서 오미자 에탄올 주줄물의 4-NQO 와 sodium azaid에 대한 항돌연변이 활성은 다른 한약재에 비해 비교적 높은 것으로 보여졌다.
- 3%로 오미자 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 돌연변이 억제능이 나타났다. 또한 4-NQO에 대한 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성을 측정한 결과, 시료의 농도가 0.5, 1, 5 mg/plate일 때 각각 34.4%, 82.5%, 67.1%의 항돌연변이 활생을 나타내어 1 mg/ plate의 농도에서 가장 높은 항돌연변이 활성이 나타났다. 한약재로 상용되는 물질들의 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성과 오미자의 항돌연변이 활성을 비교해 보면, Kim el al (2002)은 씀바귀 부탄올 분획물의 항돌연변이 활성이 88.
- 97 mg/g으로 분석되었다. 또한 오미자 에탄올 추출물은 sodium azide(5 mg/plate) 와 4-NQO(l mg/plate)에 대한 항돌연변이 활성이 각각 45%, 82%로 나타나 4-NQO에 대해 높은 돌연변이 억제 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 오미자 에탄올 추출물이 높은 항산화 활성과 항돌연변이 활성을 가진 것으로 나타나, 앞으로 천연 항산화제 및 항돌연변이 기능성 소재로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 활성을 검증하였다. 실험 결고}, 세포 내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발하는 직접 돌연변이 원인 4-NQO와 sodium azaid는 대조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켰으나, 시료는 사용된 농도에서 돌연변이를 유발하지 않아 항돌연변이 실험에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 1). Sodium azaid에 대한 오미자 에탄올 추출물의 농도별 항돌연변이 활성은 Table 2에 나타나 있고, 4-NQO에 대한 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성은 Table 3에 나타나 있다.
- Sodium azaid에 대한 오미자 에탄올 추출물의 농도별 항돌연변이 활성은 Table 2에 나타나 있고, 4-NQO에 대한 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성은 Table 3에 나타나 있다. 오미'자 에탄올 주줄 물의 농도가 0.5, 1, 5 mg/plate일 때 sodium azaid에 대한 항돌연변이 활성은 각각 16.2%, 24.3%, 45.3%로 오미자 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 돌연변이 억제능이 나타났다. 또한 4-NQO에 대한 오미자 에탄올 추출물의 항돌연변이 활성을 측정한 결과, 시료의 농도가 0.
- 오미자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 500/zg/assay의 농도에서 57%이었고, IC50값이 435 /zg/assay 으로 나타나 비교적 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 오미자 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 9.
- 오미자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 500/zg/assay의 농도에서 57%이었고, IC50값이 435 /zg/assay 으로 나타나 비교적 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 오미자 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 9.53 mg/g과 3.97 mg/g으로 분석되었다. 또한 오미자 에탄올 추출물은 sodium azide(5 mg/plate) 와 4-NQO(l mg/plate)에 대한 항돌연변이 활성이 각각 45%, 82%로 나타나 4-NQO에 대해 높은 돌연변이 억제 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 2와 같다. 오미자 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량은 9.53 mg/g, 총 플라보노이드 화합물 함량은 3.97 mg/g으로 총 폴리페놀 화합물 함량이 총 플라보노이드 화합물 함량보다 높았다. Kim et a/(2001)과 Cho et a/(2007)에 의해 보고된 오미자 열수 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량은 각각 2.
후속연구
- 또한 오미자 에탄올 추출물은 sodium azide(5 mg/plate) 와 4-NQO(l mg/plate)에 대한 항돌연변이 활성이 각각 45%, 82%로 나타나 4-NQO에 대해 높은 돌연변이 억제 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 오미자 에탄올 추출물이 높은 항산화 활성과 항돌연변이 활성을 가진 것으로 나타나, 앞으로 천연 항산화제 및 항돌연변이 기능성 소재로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
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