반응표면분석에 의한 해송이버섯(Hypsizigus marmoreus) 추출물 중 단백다당체의 암세포 성장억제효과 Cytotoxic Effect of Isolated Protein-bound Polysaccharides from Hypsizigus marmoreus Extracts by Response Surface Methodology원문보기
해송이버섯 분말의 암세포성장억제효과의 증진을 위한 성분의 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다. 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 추출온도 $51.3^{\circ}C$, 추출시간 8.2시간, 그리고 추출용매비는 46.7 mL/g 으로 나타났다. 최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당 체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다. 위암세포주 AGS에는 산성다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 73.97%로 가장 높은 세포증식억제효과를 보였으며 간암세포주 HepG2에는 조다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 82.45%로 가장 높은 효과를 보였다. 그러나 결장암세포주 SW480에서는 모든 분획의 시료가 20%미만의 세포성장 억제효과를 보였다.
해송이버섯 분말의 암세포성장억제효과의 증진을 위한 성분의 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다. 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 추출온도 $51.3^{\circ}C$, 추출시간 8.2시간, 그리고 추출용매비는 46.7 mL/g 으로 나타났다. 최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당 체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다. 위암세포주 AGS에는 산성다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 73.97%로 가장 높은 세포증식억제효과를 보였으며 간암세포주 HepG2에는 조다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 82.45%로 가장 높은 효과를 보였다. 그러나 결장암세포주 SW480에서는 모든 분획의 시료가 20%미만의 세포성장 억제효과를 보였다.
This study used response surface methodology (RSM) in an effort to optimize the water extraction conditions of Hypsizigus marmoreus in order to increase cytotoxicity activity of the extract. A central composite design was applied to investigate the effects of independent variables, which included th...
This study used response surface methodology (RSM) in an effort to optimize the water extraction conditions of Hypsizigus marmoreus in order to increase cytotoxicity activity of the extract. A central composite design was applied to investigate the effects of independent variables, which included the extraction temperature ($X_1$), extraction time ($X_2$), the ratio of solvent to sample ($X_3$) on dependent variables of the extracts, including extraction yield ($Y_1$) and protein content ($Y_2$). The estimated optimal conditions were as follows: $51.3^{\circ}C$ extraction temperature, 8.2 hrs extraction time, and 46.7 mL/g of solvent per sample. The extract (CE) was extracted at optimal condition and crude polysaccharides (CPS) were obtained from CE by ethanol precipitation, dialysis, and freeze drying. Neutral (NPS) and acidic (APS) fraction of polysaccharides were seperated from CPS by ion chromatography. The growth inhibitory effects of the APS (0.5 mg/mL) on AGS human cancer cells were 73.97%. CPS showed the highest growth inhibitory effects on HepG2 human cancer cell at 0.5 mg/mL. However all fraction polysaccharides from Hypsizigus marmoreus showed lower than 20% growth inhibition on SW480 human cancer cell.
This study used response surface methodology (RSM) in an effort to optimize the water extraction conditions of Hypsizigus marmoreus in order to increase cytotoxicity activity of the extract. A central composite design was applied to investigate the effects of independent variables, which included the extraction temperature ($X_1$), extraction time ($X_2$), the ratio of solvent to sample ($X_3$) on dependent variables of the extracts, including extraction yield ($Y_1$) and protein content ($Y_2$). The estimated optimal conditions were as follows: $51.3^{\circ}C$ extraction temperature, 8.2 hrs extraction time, and 46.7 mL/g of solvent per sample. The extract (CE) was extracted at optimal condition and crude polysaccharides (CPS) were obtained from CE by ethanol precipitation, dialysis, and freeze drying. Neutral (NPS) and acidic (APS) fraction of polysaccharides were seperated from CPS by ion chromatography. The growth inhibitory effects of the APS (0.5 mg/mL) on AGS human cancer cells were 73.97%. CPS showed the highest growth inhibitory effects on HepG2 human cancer cell at 0.5 mg/mL. However all fraction polysaccharides from Hypsizigus marmoreus showed lower than 20% growth inhibition on SW480 human cancer cell.
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문제 정의
또한, 이러한 해송이버섯은 인공재배가 가능하고 맛이 좋아 최근 미국, 중국, 일본, 한국에서 소비량이 증가하고 있다(17). 따라서 본 연구에서는 항암효과가 뛰어난 물질로 알려진 조단백다당류를 만가닥느티버섯의 일종인 해송이버섯에서 효과적으로 추출하고자 반응표면분석을 이용하여 추출방법을 확립하고 이 추출물을 이용하여 조다당체를 얻고 이온교환 수지를 이용하여 분리한 뒤 분획별 암세포성장 억제율을 알아보았다.
제안 방법
흡착되지 않은 용출액을 동결건조하여 중성다당체(NPS)를 분리하였다. Column에 흡착된 성분을 분리하기 위하여 2 M의 NaCl 수용액을 전개용매로 사용하여 용출하였고 용출액에 포함된 NaCl을 제거하기 위하여 용출액을 dialysis tube(Spectra/Por. Membrane, MWCO 12,000～14,000 Da, Spectrum Laboratories)에 넣고 4일간 투석한 후 동결건조하여 산성다당체(APS)를 분리하였다.
, Virginia, USA)로 흡광도를 측정하였다. MTT assay에 의해 측정된 대조군과 실험군의 O.D. 값을 다음과 같이 아래의 계산식에 의해 세포생장 억제효과를 구하였다.
물추출물을 40 brix의 농도로 제조한 후 3배량의 에탄올(순도 95%이상)을 넣고 4℃에서 24시간 동안 침전 대기하였다. 원심분리를 통하여 상등액을 제거하고 침전물을 분리하여 소량의 증류수로 침전물을 녹인 후 dialysis tube(Spectra/Por. Membrane, MWCO 12,000～14,000Da, Spectrum Laboratories, CA, USA)에 넣고 3일간 투석을 실시하였다. 투석 후 침전물을 여과하여 제거하고 동결건조하여 조다당체(CPS)를 최종적으로 분리하였다.
, State College, PA, USA)를 사용하였다. 이때 추출조건은 시료에 대한 추출온도(X1) 8～92℃와 추출시간(X2) 2～11시간과 추출용매비(X3) 23～57 mL/g이었으며, 이들 독립변수들은 5단계(-1.68, -1, 0, 1, 1.68)로 부호화(Table 1)하여 중심합성계획에 따라 20구간으로 설정하였다(Table 2). 또한 이들 독립변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Yn)는 수율(Y1)과 단백질 함량(Y2)으로 하였다.
조다당체(CPS)를 DEAE-Sephacell resin이 충진된 ion exchange column에 적용시켜 중성다당체(NPS)와 산성다당체(APS)를 분리하였다. Fraction collector를 이용하여 분획된 시료를 분석한 결과 NPS와 APS의 분획시료들이 단백질과 당이 검출되어 이들은 모두 단백질과 결합되어있는 단백다당체일 것으로 사료되어진다(Fig.
해송이버섯 분말의 암세포성장억제효과의 증진을 위한 성분의 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다. 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 추출온도51.
단백질 함량은 Lowry-Folin 방법(21)으로 분석하였다. 즉, 시료 0.5 mg에 Lowry-Folin 반응을 실시한 후 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 740 nm에서 흡광도를 측정하였다.
최적 조건에서 추출한 추출물에 알코올을 첨가하여 침전물을 얻은 후 dialysis tube를 이용하여 분자량 12,000 Da 이하의 물질을 제거하여 조다당체(CPS)를 얻었다. 현재 버섯 및 미생물 배양 등에서 단백다당류를 분리하는 방법으로 열수로 추출한 다음 에탄올로 침전시키는 방법이 주로 이용되고 있으며, 얻어진 침전물이 항암효과를 가지는 단백다당류로 일반적으로 인정되고 있다(25,26).
7 mL/g으로 나타났다. 최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다. 위암세포주 AGS에는 산성다당체가 0.
Membrane, MWCO 12,000～14,000Da, Spectrum Laboratories, CA, USA)에 넣고 3일간 투석을 실시하였다. 투석 후 침전물을 여과하여 제거하고 동결건조하여 조다당체(CPS)를 최종적으로 분리하였다.
해송이버섯의 유효성분을 추출하기 위하여 중심합성계획에 의한 20구간의 추출조건에 따라 추출시험을 실시하고, 이때 얻어진 각각의 추출물에 대하여 수율, 단백질함량을 측정한 결과를 Table 2에 나타내었다.
대상 데이터
본 연구에 사용한 해송이버섯은 (주)해송산업(강원도 강릉시)에서 제공받았으며 35℃에서 24시간 건조한 후 분쇄하여 분말로 만들어 -20℃ 냉동고에 보관하며 실험에 이용하였다.
해송이버섯 각 추출물의 암세포의 생장억제 효과는 Green 등(22)의 방법에 따라 MTT assay를 이용하여 검토하였다. 실험에 사용된 위암 세포주 AGS(stomach adenocarcinoma), 간암세포주 HepG2(liver hepatoblastoma), 대장암 세포주SW480(colon adenocarcinoma)은 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 streptomycin-penicillin(Gibco BRL) 1%가 첨가된 RPMI-1640 medium(Gibco BRL)에 배양하였으며, 고착성을 가지는 세포를 cell scraper로 회수, 부유시켜서 사용하였다.
데이터처리
각각의 결과를 이용하여 최적 추출조건을 얻고자 반응표면 회기분석을 실시하여 각 종속변수 즉, 수율과 단백질 함량에 대한 회귀식을 얻었다(Table 3). 독립변수들의 반응표면은 Maple 프로그램으로 용매비, 추출온도, 추출시간을 독립변수로 하여 Fig.
또한 실험결과는 평균±표준편차(Mean±SD)로 표시하였으며, 통계적 유의성은 SAS(statistical analysis system) program을 이용하여 5% 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
반응표면분석에 의한 해송이버섯 추출조건의 최적화는 MINITAB program을 이용하여 각각의 독립변수의 특성값에 대한 목표값을 설정하여 목표값을 만족시키는 인자의 최적 조합을 결정하였다.
본 실험에서는 추출조건에 따른 추출특성의 모니터링과 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법(response surface methodolgy, RSM)(18)을 사용하였다. 추출조건에대한 실험계획은 중심합성계획(19)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 MINITAB statistical software(Version 13, Minitab Inc., State College, PA, USA)를 사용하였다. 이때 추출조건은 시료에 대한 추출온도(X1) 8～92℃와 추출시간(X2) 2～11시간과 추출용매비(X3) 23～57 mL/g이었으며, 이들 독립변수들은 5단계(-1.
해송이버섯 분말로부터 단백다당체의 최적추출조건을 구하기 위해 ANOVA 분석을 하였다. 모든 독립변수의 특성값을 고려한 최적추출조건(Table 6)은 추출온도 51.
해송이버섯 추출조건에 따른 추출물의 특성은 MINITAB program(Minitab Inc., Minitab Statistical software, USA)을 사용하여 반응표면회귀분석으로 통계처리 하였다. 반응표면 분석에서 독립변수(Xl, X2, X3)에 대한 2차 회귀모형은 다음과 같다.
이론/모형
단백질 함량은 Lowry-Folin 방법(21)으로 분석하였다. 즉, 시료 0.
본 실험에서는 추출조건에 따른 추출특성의 모니터링과 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법(response surface methodolgy, RSM)(18)을 사용하였다. 추출조건에대한 실험계획은 중심합성계획(19)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 MINITAB statistical software(Version 13, Minitab Inc.
총당 함량 분석은 Saha와 Brewer(20)의 방법에 따라 phenol-sulfuric acid 법으로 실시하였다. 즉, 5% phenol (w/v) 0.
해송이버섯 각 추출물의 암세포의 생장억제 효과는 Green 등(22)의 방법에 따라 MTT assay를 이용하여 검토하였다. 실험에 사용된 위암 세포주 AGS(stomach adenocarcinoma), 간암세포주 HepG2(liver hepatoblastoma), 대장암 세포주SW480(colon adenocarcinoma)은 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 streptomycin-penicillin(Gibco BRL) 1%가 첨가된 RPMI-1640 medium(Gibco BRL)에 배양하였으며, 고착성을 가지는 세포를 cell scraper로 회수, 부유시켜서 사용하였다.
해송이버섯 분말의 암세포성장억제효과의 증진을 위한 성분의 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다.
성능/효과
간암세포주 HepG2 에는 CPS가 다른 분획의 시료들보다 세포증식억제효과가 모든 농도에서 높은 것으로 나타났으며 0.5 mg/mL의 농도에서는 82.45±5.74%의 세포증식억제효과가 있는 것으로 나타났다.
그러나 단백질 함량은 APS가 18.47±1.56%로 NPS의 5.74±1.09%보다 높게 나타나 APS가 단백다당체의 함량이 더 높은 것으로 나타났다(Table 8).
이는 AGS 세포증식억제효과를 나타내는 물질이 APS에 많이 있을 것으로 사료되어진다. 또한 0.05 mg/mL의 농도에서는 모든 분획의 세포증식억제효과가 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다.
또한 실제로 최적조건에서 해송이버섯 분말을 추출한 결과(Table 7), 추출수율은 59.5±3.2%, 추출물 중의 단백질함량은 22.4±1.3%로 나타나 예측된 수율과 추출물 중의 단백질 함량보다 높았다.
추출용매비가 증가함에 따라 단백질의 함량이 늘어나다 45배를 넘어서는 다시 감소하는 것으로 나타났는데 이는 단백질 이외의 성분들도 함께 추출되어 상대적으로 단백질의 함량비가 줄어든 것으로 생각된다. 또한 추출시간이 8시간까지는 증가하다가 그 이후의 온도에서는 단백질의 함량 변화가 없는 것으로 나타났다. 추출온도의 영향은 추출온도가 50℃까지는 증가하다가 그 이후의 온도에서는 감소하는 것으로 나타났다.
해송이버섯 분말로부터 단백다당체의 최적추출조건을 구하기 위해 ANOVA 분석을 하였다. 모든 독립변수의 특성값을 고려한 최적추출조건(Table 6)은 추출온도 51.3℃, 추출시간 8.2시간, 시료에 대한 추출용매비 46.7 mL/g이었고 이때 예측된 수율은 56.4%, 추출물 중의 단백질 함량은 21.3%로 나타났다.
분산분석의 결과 수율과 마찬가지로 일차항과 이차항은 통계적으로 유의성이 있는 것으로 나타났으나(p0.1)으로 나타났다(Table 5).
중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다. 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 추출온도51.3℃, 추출시간 8.2시간, 그리고 추출용매비는 46.7 mL/g으로 나타났다. 최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다.
최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다. 위암세포주 AGS에는 산성다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 73.97%로 가장 높은 세포증식억제효과를 보였으며 간암세포주 HepG2에는 조다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 82.45%로 가장 높은 효과를 보였다. 그러나 결장암세포주 SW480에서는 모든 분획의 시료가 20%미만의 세포성장 억제효과를 보였다.
위암세포주 AGS에는 산성다당체인 APS가 0.5 mg/mL의 농도에서 73.97±8.29%의 유의적으로 가장 높은 세포증식억제를 나타내었으며 해송이버섯 조추출물 CE와 조다당체 CPS가 각각 52.07±5.01%와 54.23±4.79%로 나타났으며 중성다당체인 NPS는 31.88±6.17%로 유의적으로 가장 낮은 세포증식 억제효과를 나타내었다.
1에 나타내었다. 추출용매비가 45배에 가까워질수록 추출수율이 증가하다 다시 감소하는 경향을 보였으며 해송이 버섯의 추출온도는 70℃부근까지 증가하다 그 이후 온도에서는 변화가 없는 것으로 나타났다. 그리고 추출시간의 경우 8시간까지 추출수율이 증가하다 그 이후의 온도에서는 추출수율의 변화가 보이지 않았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
해송이버섯은 무엇인가?
해송이버섯은 만가닥느티버섯(Hypsizigus marmoreus)의 일종으로 담자균류의 송이과(Tricholomataceae) 느티버섯속(Hypsizyus)에 속하는 버섯의 일종이다(11,12). 이러한 만가닥느티버섯의 생리적 특징으로는 암세포성장억제효과와 항산화효과(13,14)와 만가닥느티버섯에서 분리한 hypsin의 항진균효과, 항종양효과 등의 생리활성에 관한 여러 보고가 있다(15,16).
만가닥느티버섯의 생리적 특징에는 무엇이 있는가?
해송이버섯은 만가닥느티버섯(Hypsizigus marmoreus)의 일종으로 담자균류의 송이과(Tricholomataceae) 느티버섯속(Hypsizyus)에 속하는 버섯의 일종이다(11,12). 이러한 만가닥느티버섯의 생리적 특징으로는 암세포성장억제효과와 항산화효과(13,14)와 만가닥느티버섯에서 분리한 hypsin의 항진균효과, 항종양효과 등의 생리활성에 관한 여러 보고가 있다(15,16).
해송이버섯 분말의 암세포성장억제효과의 증진을 위한 성분의 추출조건을 최적화하기 위한 실험연구에서 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 어떻게 나타났는가?
중심합성계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 추출시간, 용매비)와 이에 따라 영향을 받는 수율과 추출물의 단백질 함량을 종속변수로 설정하였다. 수율과 단백질 함량이 높은 조건을 충족시키는 최적조건은 추출온도51.3℃, 추출시간 8.2시간, 그리고 추출용매비는 46.7 mL/g으로 나타났다. 최적조건에서 추출되어진 조추출물을 이용하여 알코올을 이용하여 침전한 후 dialysis tube를 이용하여 저분자물질을 제거하여 조다당체를 얻었으며 조다당체를 이용하여 이온교환수지를 이용하여 산성다당체와 중성다당체를 얻어 각각의 다당체의 암세포성장억제효과를 알아보았다.
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