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문제 정의
- 하지만 지금까지 PCR 방법을 이용하여 BPIV3를 정량적으로 검줄하고자 하는 연구는 진행된 바가 거의 없다. 본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPIV3 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPIV3를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPIV3 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time RT-PCR 시험법을 확립하고자 하였다. 또한 확립된 real-time RT-PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BPIV3를 김-염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BPIV3를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 소유래 원료를 사용하는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 안전성을 보증하기 위해서 BPIV3를 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 민감도와 특이도가 우수한 real-time RT-PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BPIV3 전체유전자를 대상으로 BPIV3 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다.
제안 방법
- 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BPIV3를 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 다시계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다 확립된 real-time RT-PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPIV3가 존재하는지 여부를 정량적으로 확인하였다. Real-time RT-PCR 양성 대조군으로는 titer가 2.
- BPIV3 를 2% 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 0.25 mL씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양^지를 0.
- BPIV3 정량을 위한 real-time RT-PCR 방법의 신뢰성 (reHability) 을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도 (sensitivity), 재현성 (reproducibility)등을 검증하였다.
- 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPIV3 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPIV3를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPIV3 제거검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법을 확립하였다. BPIV3에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPIV3 RNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 2.
- cDNA를 합성하기 위해 template RNA 10 μL, 10 pmol specific primer (reverse primer) 2 〃L, RNase inhibiter (10 U/"L) 1 pL, lOx buffer RT 2 “L, dNTP mix (5 mM) 2 “L, Omniscript reverse transcriptase 1 户L, RNase-free water 2 를 혼합하고 37 ℃ 에서 60분 동안 반응시켰다. BPIV3의 reverse transcription 반응으로 얻어진 cDNA를 주형으로 PCR을 실행하였다. PCR 반응을 위해 BPIV3 cDNA 2 /jL, 10 pmol forward primer 1 fjL, 10 pmol reverse primer 1 fjL, MgCh 용액 1 户L, Go Taq® Green Master Mix (Promega) premix 12.
- BPIV3의 정량을 위해 RT-PCR을 통해 확립된 RT-PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq (Bioneer, Korea) 을 사용하여 Real-time RT-PCR 조건을 확립하였다. BPIV3 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 Real-time PCR 기계를 사용하였다.
- BPIV3의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 50% tissue culture infectious dose (TCID50)로 나타내었다. BPIV3 를 2% 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 0.
- 소유래 물질을 원료로 사용한 경우 소유래바이러스에 쉽게 감염되는 BT (bovine turbinate) 세포주를 사용하여 바이러스를 검출한다. BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정 시료 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일이상 배양을 하면서 병변효과를 관찰하여 오염여부를 판단하거나 haemadsorption test를 통해 바이러스 오염여부를 판단한다. 또한 BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양 한 다음 소유래 바이러스에 대한 항혈청을 이용해 면역형광 방법으로 바이러스 오염 여부를 판단한다.
- CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 fccove's modified Dulbecco's medium (WDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT suppliment; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 에 BPIV3를 감염시킨 후 4일 동안 배양하였다.
- 확립하였다. Forward primer로 BPIV3-F3를 reverse primer로 BPIV3-R3 를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature 를 최적화하였다([Fig. 2]). Titer가 2.
- RT-PCR< 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Tag 을 사용하여 real-time RT-PCR 조건을 확립하였다. Forward primer로 BPIV3-F3를 reverse primer로 BPIV3-R3 를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature 를 최적화하였다([Fig.
- 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Softw戏re를 이용하여 BPIV3 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다{Table 1). RT-PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Tit屯가 2.
- Vero 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM : Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과 (cytopathic effect : CPE)를 관찰하였다. CPE 가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, 400 X g 에서 5분간 원심 분리하여 상층액은 따로 모으고 pellete 재현탁하였다.
- BPIV3 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BPIV3를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다.
- BPIV3 검출시험을 실시하였다. Titer가 7.8 x 105 TCIDWmL인 BPIV3를 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.2 mL을 소유래 콜라겐 1.8 ml止에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPIV3를 검출하였다. 각 시료에 대해 real-time RT-PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 7.
- Titer 가 7.8 X 105 TCID30/TnL'?l BPIV3를 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.2 mL을 소유래 콜라겐 1.8 m丄에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPIV3를 검출하였다. Real-time RT-PCR 음성 대조군으로는 바이러스를 첨가하지 않은 콜라겐을 사용하였다.
- Titer를 측정하고자 하는 시료들과 함께 titei.가 2.8 x 106 TCIDs涉mL인 BPIV3를 순차적으로 2.8 x 10° TCIDso/mL까지 10배씩 희석한 후 real-time RT-PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 BPIV3의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다.
- 25 mL씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% C6, 35 ℃ 로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정 시료 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일이상 배양을 하면서 병변효과를 관찰하여 오염여부를 판단하거나 haemadsorption test를 통해 바이러스 오염여부를 판단한다. 또한 BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양 한 다음 소유래 바이러스에 대한 항혈청을 이용해 면역형광 방법으로 바이러스 오염 여부를 판단한다. 이러한 생물학적 실험법의 경우시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다.
- 최적화된 annealing 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPIV3 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPIV3를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPIV3 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time RT-PCR 시험법을 확립하고자 하였다. 또한 확립된 real-time RT-PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BPIV3를 김-염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BPIV3를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
- 핵산증폭은 piB-incubatione 95笔에서 15분, denaturatione 95℃에서 10초 annealinge 30초 (amealing 온도 최적화를 위해 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃에서 real-time PCR 수행), extention 은 7213에서 30초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72莒부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCh 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 58℃에서 MgCk 농도를 변화시켜 첨가해준 BPIV3 cDNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
- 민감도를 측정하기 위해 2.8 x 106 TCIDWmL BPIV3를 순차적으로 10배씩 희석한 후 Real-time RT-PCR을 수행하였다. 각시료에 대해 Real-time RT-PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 2.
- 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 2.8 x 106 TCIDWmL인 BPIV3를 순차적으로 2.8 x 10° TCJDemL 까지 10배씩 희석한 후 real-time RT-PCR을 수행하였다. 재현성검증을 위해 titer가 2.
- 분리한 RNA를 주형으로 Omniscript Reverse Transcription Kit (QIAGEN, German)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 합성하기 위해 template RNA 10 μL, 10 pmol specific primer (reverse primer) 2 〃L, RNase inhibiter (10 U/"L) 1 pL, lOx buffer RT 2 “L, dNTP mix (5 mM) 2 “L, Omniscript reverse transcriptase 1 户L, RNase-free water 2 를 혼합하고 37 ℃ 에서 60분 동안 반응시켰다.
- 세포배양 상청액 4 mL을 회수하고, CHO DG44 세포를 町psin을 처리하여 4 mL 부피로 회수하였다. 세포배양 상청액과 CHO 세포에서 각각 RNA를 추출하고, 확립된 real-time RT-PCR을 활용하여 BPIV3를 정량 검출하였다([Fig. 6]C). 세포배양액에서는 2.
- BPIV3는 동물 세포주, 우혈청 등에 가장 흔하게 오염되는 바이러스이다. 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPIV3 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPIV3를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPIV3 제거검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법을 확립하였다. BPIV3에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPIV3 RNA 정량검출 시험법을 최적화하였다.
- 소유래 콜라겐에서 re히-time RT-PCR® 이용한 BPIV3 검출확립된 real-time RT-PCR을 소유래 콜라겐 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 콜라겐에서 BPIV3 검출시험을 실시하였다. Titer가 7.
- 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 원료물질, 공정중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다(13, 20). 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Softw戏re를 이용하여 BPIV3 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다{Table 1). RT-PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다.
- 25 mL씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양^지를 0.25 mL씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% C6, 35 ℃ 로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 8 x 10° TCJDemL 까지 10배씩 희석한 후 real-time RT-PCR을 수행하였다. 재현성검증을 위해 titer가 2.8 x 10s TCIDso/mL인 BPIV3를 순차적으로 2.8 X 10° TCIDemL까지 10배씩 희석한 후 서로 다른날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 RNA 바이러스인 hepatitis A virus (ATCC VR 1402), bovine viral diarrhoea virus (ATCC VR 534), ieovims type 3 (ATCC VR-824), encephalomyocarditis 후inis (ATCC VR 129B)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다.
- 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72莒부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCh 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 58℃에서 MgCk 농도를 변화시켜 첨가해준 BPIV3 cDNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
- 8 x 102 TCIDWmL인 BPIV3를 시료로 annealing temperature# 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃로 변화시키며 real-time RT-PCR을 수행하였을 때, 58 ℃ 에서 crossing point 가 가장 낮게 나타나 58℃가 최적 온도임을 알 수 있었다. 최적 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다([Table 2]). Titer가 2.
- RT-PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 MgCh 농도는 각각 58℃와 3 mM이었다. 최적 조건에서 RT-PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 2.
- 5% agarose gel 전기영동을 통해 TCR 반응물을 확인하였다. 최적화된 annealing 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 8 X 10° TCIDemL까지 10배씩 희석한 후 서로 다른날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 RNA 바이러스인 hepatitis A virus (ATCC VR 1402), bovine viral diarrhoea virus (ATCC VR 534), ieovims type 3 (ATCC VR-824), encephalomyocarditis 후inis (ATCC VR 129B)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 106 TCID요mL, 106 T* CID)/mL, 105 TCIDsc/mL, 107 TCIDMnL 이었다.
- 5 “L에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 20 甘L가 되게 하였다. 핵산증폭은 piB-incubatione 95笔에서 15분, denaturatione 95℃에서 10초 annealinge 30초 (amealing 온도 최적화를 위해 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃에서 real-time PCR 수행), extention 은 7213에서 30초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72莒부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다.
- 확립된 BPIV3 정량법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도 (sensitivity), 재현성 (reproducibility) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 2.
- 확립된 BPIV3 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPIV3 표준시료에서 RNA를 추출하고 real-time RT-PCR 을 수행한 후 crossing point 값을 비교하였다([Fig. 4]). BPIV3 log titer (log 10 TCID3o/mL; x) 에 대한 crossing point 값 (y) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 y=-3.
- 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 fccove's modified Dulbecco's medium (WDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT suppliment; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다.
- 확립된 시험법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 시험법검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성 (reproducibility) 이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 CHO 세포주와 소유래 콜라겐에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다. BPIV3를 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 BPIV3를 정량적으로 검출할 수 있었다.
- 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BPIV3를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다.
- 확립된 real-time RT-PCR을 소유래 콜라겐 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 콜라겐에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다. Titer 가 7.
대상 데이터
- BPIV3 (ATCC VR 281)의 배양과 정량을 위해 Vero 세포 (ATCC CCL 81)를 사용하였다. Vero 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM : Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다.
- BPIV3 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서열은 NCBI data base에 보고된 BPIV3 complete genome (NC 002161)을 기초로 Primer3 Software를 이용하여 디자인하였다 ([Table 1]).
- RT-PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BPIV3 전체유전자를 대상으로 BPIV3 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5쌍의 primer 중 BPIV3의 HN (siaHdase) 유전자를 대상으로 디자인 한 primer 쌍 BPIV3-F3, BPIV3-R3의 민감도가 가장우수하였다.
- 4일 동안 배양한 후 다시계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다 확립된 real-time RT-PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPIV3가 존재하는지 여부를 정량적으로 확인하였다. Real-time RT-PCR 양성 대조군으로는 titer가 2.8 x 104 TCIDem丄인 BPIV3를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배양배지를 사용하였다.
- CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 fccove's modified Dulbecco's medium (WDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT suppliment; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 에 BPIV3를 감염시킨 후 4일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BPIV3를 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다.
- CCL 81)를 사용하였다. Vero 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM : Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과 (cytopathic effect : CPE)를 관찰하였다.
- 특이성 검증을 위해 RNA 바이러스인 hepatitis A virus (ATCC VR 1402), bovine viral diarrhoea virus (ATCC VR 534), ieovims type 3 (ATCC VR-824), encephalomyocarditis 후inis (ATCC VR 129B)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 106 TCID요mL, 106 T* CID)/mL, 105 TCIDsc/mL, 107 TCIDMnL 이었다.
데이터처리
- Reproducibility of real-time RT-PCR assay for quantitative detection of BPIV3. The standard curves were obtained by the regression analysis of crossing point values versus initial virus titer. These results were obtained from three independent assays performed at different days.
이론/모형
- BPIV3 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 Real-time PCR 기계를 사용하였다. Real-time PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq 5 pL, 10 pmol forward primer 0.
- 분리하였다. RNA 분리는 QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, German)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 배양액 140 “L로부터 총 60 μL의 RNA를 용출하였다.
성능/효과
- BPIV3 전체유전자를 대상으로 BPIV3 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5쌍의 primer 중 BPIV3의 HN (siaHdase) 유전자를 대상으로 디자인 한 primer 쌍 BPIV3-F3, BPIV3-R3의 민감도가 가장우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCh 농도 등 real-time RT-PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 2.
- 1]). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 BPIV3 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).
- 8 x 10° TCID5t/mL 인 BPIV3를 시료로 RT-PCR을 수행한 결과 primer 쌍 BPIV3-F3, BPIV3-R3가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). RT-PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 MgCh 농도는 각각 58℃와 3 mM이었다. 최적 조건에서 RT-PCR의 민감도를 측정하였다.
- 5A]). Real-time RT-PCR 산물을 1.5% agarose gel 상에서 분석한 결과 BPIV3 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반웅 산물이 생성되지 않았음을 알 수 있었다([Fig 5B]). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time RT-PCR 방법은 BPIV3 에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 최적 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다([Table 2]). Titer가 2.8 x 106 TCID50/mL, 2.8 x 104 TCIDso/mL, 2.8 x 102 TCIDWmL인 BPIV3를 시료로 MgCh 농도를 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM로 변화시켜가며 real-time RT-PCR을 수행하였을 때 2 mM에서 crossing point가 가장낮게 나타나 최적 MgCl2 농도는 2 mM임을 알 수 있었다.
- 최적 조건에서 RT-PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 2.8 x 106 TCIDWmL인 BVDV를 순차적으로 희석하여 RT-PCR 한 결과 2.8 TCIDso/mL까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다([Fig. 1]). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www.
- 2]). Titer가 2.8 x 106 TCIDso/mL, 2.8 x 104 TCIDso/niL, 2.8 x 102 TCIDWmL인 BPIV3를 시료로 annealing temperature# 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃로 변화시키며 real-time RT-PCR을 수행하였을 때, 58 ℃ 에서 crossing point 가 가장 낮게 나타나 58℃가 최적 온도임을 알 수 있었다. 최적 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다([Table 2]).
- RT-PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Tit屯가 2.8 X 106 TCIDso/mL, 2.8 x 104 TCIDso/mL, 2.8 x 102 TCIDsemL, 2.8 x 10° TCID5t/mL 인 BPIV3를 시료로 RT-PCR을 수행한 결과 primer 쌍 BPIV3-F3, BPIV3-R3가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). RT-PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 MgCh 농도는 각각 58℃와 3 mM이었다.
- 8 ml止에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPIV3를 검출하였다. 각 시료에 대해 real-time RT-PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 7.8 X 10° TCIDsc/niL 까지 정량적으로 검출할 수 있었다(Fig. 7).
- 8 x 106 TCIDWmL BPIV3를 순차적으로 10배씩 희석한 후 Real-time RT-PCR을 수행하였다. 각시료에 대해 Real-time RT-PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 2.8 TCIDWmL임을 확인할수 있었다([Fig. 3]A). Melting curve 분석 결과 BPIV3에 특이적인 부분과 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조군에서는 BPIV3에 특이적인 peak을 확인할 수 없었다([Fig.
- 다른 RNA virus 들 (hepatitis A virus, bovine viral dianhoea virus, reovirus type 3, encephalomyocarditis virus)을 대상으로 특이성을 실험할 결과 BPIV3의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 없었다 ([Fig. 5A]). Real-time RT-PCR 산물을 1.
- 본 연구를 통해 확립된 BPIV3 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BPIV3 검출 시험에 활용하였을 때, BPIV3가 오염된 CHO 세포주와 세포주 배양 상등액에서 BPIV3를 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 BPIV3 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다.
- 하지만 BPIV3를 효과적으로 검출할 수 있는 시험법이 확립되지 않아 real-time RT-PCR 시험법 같은 민감한 시험법이 요구되고 있다. 본 연구를 통해 확립된 BPIV3 검출 시험법을 0.5% 콜라겐에 적용하였을 때 7.8 X 10° TCIDso/mL 까지 정량적으로 검출할 수 있어 콜라겐의 품질보증에 활용할 수 있는 우수한 시험법임을 확인하였다.
- 이러한 생물학적 실험법의 경우시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다. 본 연구를 통해 확립된 BPIV3 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BPIV3 검출 시험에 활용하였을 때, BPIV3가 오염된 CHO 세포주와 세포주 배양 상등액에서 BPIV3를 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 BPIV3 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다.
- 99 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 알 수 있었다. 생물의약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 BPIV3를 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 5쌍의 primer 중 BPIV3의 HN (siaHdase) 유전자를 대상으로 디자인 한 primer 쌍 BPIV3-F3, BPIV3-R3의 민감도가 가장우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCh 농도 등 real-time RT-PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 2.8 TCIDWmL이었다. 확립된 BPIV3 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPIV3 표준시료에서 RNA를 추출하고 real-time RT-PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교한 결과, BPIV3 log titer (logio TCIDso/mL; x) 에 대한 crossing point 값 (y) 간의 표준 회귀식의 결정계수 (?) 는 모두 0.
- BPIV3에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPIV3 RNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 2.8 TCIDMnL이었다. 확립된 시험법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 시험법검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성 (reproducibility) 이 우수함을 확인하였다.
- 8 TCID50/niL 까지 정량적으로 검출할 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법과 같은 생물학적 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.
- 5% agarose gel 상에서 분석한 결과 BPIV3 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반웅 산물이 생성되지 않았음을 알 수 있었다([Fig 5B]). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time RT-PCR 방법은 BPIV3 에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 1 X 102 TCIDjo equivalent/mL BPIV3가 검출되었다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% (w/v) agarose gel 을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BPIV3 양성시료, 세포배양액, 세포에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 음성 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다([Fig. 6]D).
- 3]B). 증폭된 PCR 산물을 1.5% (w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BPIV3 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시).
- 8 TCIDMnL이었다. 확립된 시험법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 시험법검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성 (reproducibility) 이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 CHO 세포주와 소유래 콜라겐에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다.
후속연구
- 본 연구를 통해 확립된 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법도 세포배양 유래 생물의약품 제조 공정에서 바이러스 제거검증과 크로마토그래피 세척 검증에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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