[논문]한국인에서의 페닐케톤뇨증의 유전자변이에 대한 고찰

유수정; 홍용희; 이용화; 정성철; 기창석; 이동환

한국인에서의 페닐케톤뇨증의 유전자변이에 대한 고찰
The Study of DNA Mutations of Phenylketonuria in Koreans 원문보기

Journal of genetic medicine, v.5 no.1, 2008년, pp.26 - 33

유수정 (순천향대학교 의과대학 소아과학교실) , 홍용희 (순천향대학교 의과대학 소아과학교실) , 이용화 (순천향대학교 부천병원 진단검사의학과) , 정성철 (이화여자대학교 의과대학 생화학교실) , 기창석 (성균관대학교 의과대학 진단검사의학교실) , 이동환 (순천향대학교 의과대학 소아과학교실)

초록
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목 적 : 페닐케톤뇨증은 상염색체 열성으로 유전되는 아미노산 대사질환으로 PAH와 조효소인 $BH_4$의 활성이 저하되어 발생한다. 본 연구에서는 PAH 유전자 돌연변이와 임상양상과의 연관성을 조사하였고 PAH DNA 변이의 국가간의 차이를 분석하였다. 방 법 : 페닐케톤뇨증 환자와 환자 가족의 동의하에 DNA를 말초혈액의 백혈구에서 분리하여 PAH 유전자를 PCR을 통해 증폭하여 유전자 서열을 분석하였고 PAH 돌연변이가 하나의 대립유전자에서만 발견이 되거나 없는 경우는 분석된 서열을 MLPA를 시행하여 분석을 하였다. 결 과 : 유전자 검사를 시행한 102명의 대립유전자 204개 중 199개의 돌연변이가 발견되어 97%의 검출률을 보였다. 발견된 돌연변이는 총 44가지의 유전자형으로 9개는 novel missense mutation이었고 1개는 novel splice site mutation이었다. 가장 많은 대립 유전자형은 R243Q와 $IVS4^{-1}$G>A로 각각 13.1%와 11.6%를 나타내었다. 전형적 페닐케톤뇨증에서는 R243Q와 $IVS4^{-1}$G>A가 각각 14.2%를 차지하였고 $BH_4$ 반응형 페닐케톤뇨증의 경우에는 R241C가 33.3%, 양성 고페닐알라닌혈증이 R241C가 40%에서 나타났다. $BH_4$ 반응형 페닐케톤뇨증의 경우에는 약물 치료만으로 조절이 되는 환자에서 T278I와 V388M mutation이 발견되었고 약물 치료만으로 조절이 되지 않고 식사요법을 병행해야하는 환자들에서만 K95del과 A447P의 돌연변이가 나타났다. 그리고 2004년 이전에는 동양인에게서 A259T 대립유전자 돌연변이가 발견되지 않은 것으로 보고되었으나 본 연구에서는 10.1%에서 발견되었다. 결 론 : 페닐케톤뇨증과 관련된 새로운 유전자 변이들이 발견되고 있으며 $BH_4$에 반응하는 유전자 변이들의 유전자형들이 확인되면서 PAH 유전자 분석은 페닐케톤뇨증 환자에서 진단, 유전상담, 식사 요법과 치료 계획 수립에 기여할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose : Phenylketonuria(PKU) is an inborn error of metabolism and a genetic disorder resulting from a deficiency of phenylalanine hydroxylase(PAH) and decreased activity of tetrahydrobiopterin(BH4).In this study the correlation between the DNA mutation and clinical manifestations was investigated and PAH DNA mutations were compared bewteen Asian and Caucasian populations. Methods : DNA was isolated from peripheral leukocytes. The PAH gene was amplified by Polymerase Chain Reaction(PCR) and the sequence was analyzed with Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA). Results : We characterized the PAH gene of 102 independent Korean patients with PKU. PAH nucleotide sequence analysis revealed 44 different mutations, including 10 novel mutations comprising 9 missense mutations(N207D, K95del, A447P, G344D, P69S, S391I, A202T, G103S, and I306L) and 1 novel splice-site variant mutation(IVS10-3C>G). R243Q was the most prevalent mutation in this study. A259T has not previously been reported in Asian populations, but we found that this mutation had a frequency of 10.1% in our study. Furthermore, the genotypes of $BH_4$ responsive patients were analyzed and were divided into two groups: $BH_4$ medication-only group and $BH_4$ medication with diet therapy group. In the $BH_4$ medication-only group and $BH_4$ medication with diet therapy group, R241C was the most common mutation. Conclusion : Novel mutations in the PAH gene of PKU patients are still being discovered. Additional information as to the frequency of mutations in the tetrahydrobiopterine responsive gene is also accumulating. We anticipate that knowledge of these PKU gene mutations will assist the diagnosis, genetic counseling, and therapeutic treatment of PKU patients in future.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 순천향대학교병원 소아청소년과에서 진단받은 143명의 페닐케톤뇨증 환자들의 PAH 유전자를 분석하여 유전자형과 표현형의 연관성을 연구함으로써 유전 상담 및 치료 방향을 제시하는데 도움이 되고자 하였으며 더 나아가 한국인에서 PAH 유전자 돌연변이의 다양성을 분석하여 일본과 중국 등의 다른 동양 국가들과 비교분석하고자 하였다.

제안 방법

0.5 µL와 0.75 µL 사이의 반응을 각각 TAMRA-labeled internal size standard 0.5 µL와 deionized formamide 12 µL에 혼합하였고 ABI-3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)로 fragment analysis를 하였다.
DNA 게놈은 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 말초혈액의 백혈구에서 얻었고 모든 13개의 PAH exons와 intron sequence는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 증폭시켰다. 5개의 증폭된 산물은 10U shrimp alkaline phosphatase와 2U exonuclease I로 처리하였고 그 후 ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)의 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Applied Biosystems)를 사용하여 direct sequencing을 시행하였다. 새로운 돌연변이 가능성이 있는 변이들은 PAHdb database (http://www.
60℃에서 Taq polymerase 총 50 µL를 PCR에 추가하였고 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 동안 총 36 cycles을 진행하였고, 마지막 extension step으로 72℃에서 20분간 수행하였다.
3%를 보였고, 그 다음으로 A259T, V388M 등의 순으로 나타났다(Table 4). BH₄ 반응형 페닐케툔뇨증의 경우를 두 가지 또 다른 군으로 나누어 보았다: 약으로만 치료되는 경우와 약과 식사요법을 병행하여야만 조절이 되는 경우를 비교하였다. 약으로만 또는 약과 식사요법을 병행하여야만 조절되는 경우 모두 R241C가 가장 많았으며 그 외 공통적으로는 A259T, R243Q, G344D, R111X 등이 있었다.
BH₄ 부하검사는 BH₄ 20 mg/kg(36개월 미만의 환아) 또는 7.5 mg/kg(36개월 이상의 환아)를 경구 투여하여 시행하였다. 혈중 페닐알라닌 농도는 경구 BH₄ 복용 전, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간 후에 각각 측정하였다.
본 연구에 참여한 페닐케톤뇨증 환아의 수는 총 143명이며 이 중 102명의 환자들의 유전자 검사를 시행하였다(Table 1). BH₄ 비반응형 전형적 페닐케톤뇨증 환아는 전체 143명중 118명으로 이중 82명이 유전자 검사를 시행하였고 BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증은 20명의 환아 중 15명, 양성 고페닐알라닌혈증은 5명의 환아 중 5명 모두가 유전자 검사를 시행하였다. 본 연구에서는 총 44가지의 돌연변이가 발견되었고 이들 중 10개의 novel mutation이 발견되었다.
보호자의 동의를 얻은 후 환자와 환자 가족들의 혈액을 채취하였다. DNA 게놈은 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 말초혈액의 백혈구에서 얻었고 모든 13개의 PAH exons와 intron sequence는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 증폭시켰다. 5개의 증폭된 산물은 10U shrimp alkaline phosphatase와 2U exonuclease I로 처리하였고 그 후 ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)의 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Applied Biosystems)를 사용하여 direct sequencing을 시행하였다.
각 대상자로부터 얻은 총 200 ng의 DNA 게놈을 Tris EDTA buffer 5µL 에 희석하여 98℃에서 5분간 변성시켰다.
보호자의 동의를 얻은 후 환자와 환자 가족들의 혈액을 채취하였다. DNA 게놈은 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 말초혈액의 백혈구에서 얻었고 모든 13개의 PAH exons와 intron sequence는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 증폭시켰다.
염기서열 분석을 시행한 결과 편측 또는 양측 대립유전자에서 PAH 유전자의 변이가 확인되지 않았던 8명의 환자에 대해 MLPA 분석이 시행되었다. 이 중 6명에서 결실 또는 중복이 확인되었는데 5명에서는 엑손 결실이 관찰되었고 한 명에서는 4번 엑손의 중복이 관찰되었다.
5 mg/kg(36개월 이상의 환아)를 경구 투여하여 시행하였다. 혈중 페닐알라닌 농도는 경구 BH₄ 복용 전, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간 후에 각각 측정하였다. 첫 혈중 페닐알라닌 농도가 BH₄ 투여 후 최소 30% 이상 감소하면 BH₄ 반응형이라고 정의하였다.
PAH 유전자 검사는 102명에서 시행하였다. 환자의 정도는 페닐알라닌 제한 식사를 한 후 혈중 페닐알라닌을 측정하여 BH₄비반응형 전형적 페닐케톤뇨증, BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증 그리고 양성 고페닐알라닌혈증으로 분류하였다.

대상 데이터

1983년 1월부터 2007년 4월까지 만 22년 9개월 동안 순천향대학교병원에서 신생아 선별검사와 생화학적 방법으로 PAH 결핍이 확인되어 진단된 143명의 페닐케톤뇨증 환자를 대상으로 하였고, 연령은 생후 3일에서 14세였다. PAH 유전자 검사는 102명에서 시행하였다.
1983년 1월부터 2007년 4월까지 만 22년 9개월 동안 순천향대학교병원에서 신생아 선별검사와 생화학적 방법으로 PAH 결핍이 확인되어 진단된 143명의 페닐케톤뇨증 환자를 대상으로 하였고, 연령은 생후 3일에서 14세였다. PAH 유전자 검사는 102명에서 시행하였다. 환자의 정도는 페닐알라닌 제한 식사를 한 후 혈중 페닐알라닌을 측정하여 BH₄비반응형 전형적 페닐케톤뇨증, BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증 그리고 양성 고페닐알라닌혈증으로 분류하였다.
본 연구에 참여한 페닐케톤뇨증 환아의 수는 총 143명이며 이 중 102명의 환자들의 유전자 검사를 시행하였다(Table 1). BH₄ 비반응형 전형적 페닐케톤뇨증 환아는 전체 143명중 118명으로 이중 82명이 유전자 검사를 시행하였고 BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증은 20명의 환아 중 15명, 양성 고페닐알라닌혈증은 5명의 환아 중 5명 모두가 유전자 검사를 시행하였다.
BH₄ 비반응형 전형적 페닐케톤뇨증 환아는 전체 143명중 118명으로 이중 82명이 유전자 검사를 시행하였고 BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증은 20명의 환아 중 15명, 양성 고페닐알라닌혈증은 5명의 환아 중 5명 모두가 유전자 검사를 시행하였다. 본 연구에서는 총 44가지의 돌연변이가 발견되었고 이들 중 10개의 novel mutation이 발견되었다. 10개의 새롭게 발견된 novel mutation은 N207D, K95del, A447P, G344D, P69S, S391I, A202T, G103S, I306L, 그리고 novel splice-site mutation인 IVS10^-3C>G이다(Table 2).

성능/효과

243번째 arginine이 glutamic acid로 바뀐 R243Q가 26개의 독립 대립유전자수로 13.1%를 차지하였으며 그 다음으로 intron 내의 intervening sequence에 돌연변이가 발생한 경우로 IVS4-1G>A같은 split site 변이가 23개로 11.6%를 차지하였고 204번째 tyrosine이 cystein으로 바뀐 Y204C가 21개로 10.6%에서 확인되었다.
5명의 고페닐알라닌혈증 환아가 확인되었고 가장 빈도 높은 유전자형은 R241C로 10개의 대립유전자 중 4개의 대립유전자 수로 40%를 차지하였다(Table 6).
BH₄ 결핍증은 과거에는 악성 또는 비전형적 페닐케톤뇨증이라고 불렸었고 결국 고페닐알라닌혈증을 일으키는 질환으로 PTPS 결핍증과 dihydropteridine reductase(DHPR) 결핍증 두가지가 가장 흔한 형임이 밝혀졌다⁶⁾. PTPS 결핍증 환자에서 BH₄를 복용했을 경우 페닐알라닌 농도는 극적으로 그리고 완전히 정상 농도까지 떨어지는 양상이 관찰되었고 페닐케톤뇨증 환자의 경우는 상대적으로 점차적으로 감소하는 소견을 볼 수 있었으나 혈중 페닐알라닌 농도는 정상보다는 높게 유지되는 양상이 관찰되었다. 그리고 몇몇 페닐케톤뇨증 환자들의 경우에는 BH₄에 전혀 반응하지 않는 소견을 보였으며 이러한 결과로 미루어 보았을 때 BH₄에 반응을 하려면 남은 효소 활성도가 조금이라도 필요하다는 것을 알 수 있으나 모든 경한 표현형이 꼭 BH₄ 반응성과 연관이 있지는 않았다.
R243Q와 IVS4-1G>A가 한국인 페닐케톤뇨증 환자들에서 가장 흔한 돌연변이로 나타났다.
약으로만 또는 약과 식사요법을 병행하여야만 조절되는 경우 모두 R241C가 가장 많았으며 그 외 공통적으로는 A259T, R243Q, G344D, R111X 등이 있었다. T278I과 V388M 같은 경우는 약으로만 치료되던 군에서만 나타났으며 이 두 mutation은 예후가 좋을 것으로 추정할 수 있고 K95del과 A447P 등의 경우는 식사요법을 병행하는 환아들에서만 발견되는 것으로 미루어 보아 이들의 경우에는 예후가 안 좋을 수 있을 것으로 추정할 수 있다(Table 5).
. 각 인종들의 PAH 유전자 돌연변이의 자료를 비교해 보았을 때, 연구대상인 인종의 돌연변이와 유전적 과거력(genetic history) 사이에는 연관성이 있어 보였다. 예를 들어, 유럽에는 R408W, IVS12⁺¹G>A, IVS10^-11G>A, 그리고 Y414C와 같이 특정 우세한 founder 대립유전자가 존재하며 이들은 유럽인구의 확장, 이주 그리고 유전학적 drift 흐름을 나타내고 있다¹⁶⁾.
본 연구에서 15명의 BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증 환아들에서 총 30개의 대립유전자 수를 보였으며 그 중 R241C가 33.3%를 보였고, 그 다음으로 A259T, V388M 등의 순으로 나타났다(Table 4). BH₄ 반응형 페닐케툔뇨증의 경우를 두 가지 또 다른 군으로 나누어 보았다: 약으로만 치료되는 경우와 약과 식사요법을 병행하여야만 조절이 되는 경우를 비교하였다.
. 본 연구에서는 novel frameshift mutation이나 nonsense mutation은 발견되지 않았다.
과거부터 많은 연구들이 다양한 인종의 유전자 분석을 시행하고자 하였고 이러한 검사들에 의해 약 90-99%의 PAH 유전자의 돌연변이 검출 비율을 나타내었다^{14, 16, 17)}. 본 연구에서도 97%의 돌연변이 검출 비율을 보였다. 이렇게 유전자 분석이 사용되면서부터 특별한 방법들이 개발되고 도입되고 있다.
R241C은 조효소가 결합하는 부위에 가까이 위치하고 있고 조효소와는 직접 상호작용을 하지 않기 때문에 돌연변이가 생겨도 비교적 경한 구조적 이상을 나타내는 것이다²⁴⁾. 본 연구에서도 전형적인 페닐케톤뇨증에서는 R413P가 3.7%, R241C는 0.6%로 확인된 반면 BH₄ 반응형 페닐케톤뇨증과 양성 고페닐알라닌혈증 환자의 경우 R241C가 각각 33.3%와 40%로 이러한 이전 연구 결과들과 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
그리고 본 연구에서 발견된 것과 같이 BH₄에 반응하는 환자 군을 나누어 관찰한 경우 약물 치료만 가능한 경우의 유전자 변이와 약물치료만으로는 부족하여 식사 요법과 같이 병행해야 하는 경우의 유전자 변이들이 발견되어 치료와 예후를 예측하는데 많은 도움이 되고 있다. 본 연구의 결과에 따르면 약으로만 또는 약과 식사요법을 병행해야 조절되는 경우 모두 R241C가 가장 많았으며 그 외 공통적으로는 A259T, R243Q, G344D, R111X 등이 있었다. T278I과 V388M같은 경우는 약으로만 치료되던 군에서 나타났으며 이들은 비교적 예후가 좋을 것으로 추정할 수 있고, 반면 K95del과 A447P 등의 경우는 식사요법을 병행하는 경우로 예후가 비교적 좋지 않을 것으로 추정된다.
그러나 나머지 2명에서는 MLPA 상에서 결실이나 중복이 관찰되지 않았다. 전체 33명의 페닐케톤뇨증 환자 중 6명에서 엑손의 결실이나 중복이 관찰되어 발생 빈도는 약 9%(6/ 66)이었다.
전형적 페닐케톤뇨증 환아 전체의 유전자형으로는 총 42가지의 유전자형이 밝혀졌으며 총 161개의 대립유전자 중에 R243Q와 splice site mutation인 IVS4-1G>A가 161개 중 46개의 대립유전자 수로 가장 많은 28.4%를 차지하였다(Table 3).

후속연구

몇몇 연구들은 유전자형과 다양한 표현형과의 연관성을 밝히려 하였다. 이렇게 유전자형과 표현형의 연관성이 밝혀지면 식사요법을 계획하거나 치료 방법을 모색하는데 많은 도움이 될 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	BH4 결핍증에서 가장 흔한 유형 두 가지는 무엇인가?	Pyruvoyl-tetrahydropterin synthase(PTPS) 결핍증 환자들과 페닐케톤뇨증 환자의 BH4 반응 양상은 조금은 차이를 보인다. BH4 결핍증은 과거에는 악성 또는 비전형적 페닐케톤뇨증이라고 불렸었고 결국 고페닐알라닌혈증을 일으키는 질환으로 PTPS 결핍증과 dihydropteridine reductase (DHPR) 결핍증 두가지가 가장 흔한 형임이 밝혀졌다6). PTPS 결핍증 환자에서 BH4를 복용했을 경우 페닐알라닌 농도는 극적으로 그리고 완전히 정상 농도까지 떨어지는 양상이 관찰되었고 페닐케톤뇨증 환자의 경우는 상대적으로 점차적으로 감소하는 소견을 볼 수 있었으나 혈중 페닐알라닌 농도는 정상보다는 높게 유지되는 양상이 관찰되었다.
	BH4 결핍증은 어떠한 질환인가?	BH4 결핍증은 조효소인 BH4의 합성과 재생 경로에 효소의 결함이 생겨서 발생하는 상염색체 열성으로 유전되는 대사질환이다. Pyruvoyl-tetrahydropterin synthase(PTPS) 결핍증 환자들과 페닐케톤뇨증 환자의 BH4 반응 양상은 조금은 차이를 보인다.
	국내의 페닐케톤뇨증 빈도는 어느 정도인가?	핀란드, 일본, 태국이 각각 1:100,00011), 1:108,00012), 1:212,00013)의 빈도로 비교적 낮은 빈도를 나타내고 있다. 그리고 한국인에서는 1988년 신생아 선별검사가 시행되면서부터 현재까지 약 1:44,000의 빈도를 나타내고 있다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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