[논문]목향 헥산추출물의 LNCaP 전립선암세포 증식 억제 효과

박소영; 김은지; 임도영; 김정상; 임순성; 신현경; 윤정한

doi:10.3746/jkfn.2008.37.1.8

목향 헥산추출물의 LNCaP 전립선암세포 증식 억제 효과
Inhibitory Effect of the Hexane Extract of Saussurea lappa on the Growth of LNCaP Human Prostate Cancer Cells 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.37 no.1, 2008년, pp.8 - 15

박소영 (한림대학교 식품영양학과) , 김은지 (한림대학교 식의약품의 효능평가 및 기능성소재개발센터) , 임도영 (한림대학교 식품영양학과) , 김정상 (경북대학교 동물공학과) , 임순성 (한림대학교 식의약품의 효능평가 및 기능성소재개발센터) , 신현경 (한림대학교 식품영양학과) , 윤정한 (한림대학교 식품영양학과)

초록
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목향은 국화과에 속한 다년생 식물인 Saussurea lappa의 뿌리로서 한의학에서는 구토, 설사 및 염증치료 등에 사용되고 있다. 목향 추출물 및 그 성분들은 항균 작용, 항염증 작용, 혈관생성 억제 효능 등을 지니고 있으며 위암과 대장암의 세포증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 전립선암에 대한 목향의 효과는 연구된 바 없다. 본 연구에서는 목향이 전립선 암세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 LNCaP 세포의 증식과 apoptosis에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물을 LNCaP 세포 배양액에 여러 농도($0{\sim}4$ mg/L)로 첨가하여 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 LNCaP 세포의 증식은 현저하게 감소하였고 apoptosis는 증가함을 관찰하였다. 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis 일으키는 기전을 연구하기 위하여 목향 헥산추출물을 첨가하고 세포를 48시간 배양한 후 cell lysate를 얻어 Western blot을 실시하였다. Apoptosis 과정에 작용하는 중요한 단백질 중 하나인 Bcl-2 family 단백질 중 pro-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bak와 BH3 only Bcl-2 단백질인 truncated-Bid의 단백질 수준은 목향 헥산 추출물에 의해 유의적으로 증가한 반면 anti-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL 및 Mcl-1 단백질 수준은 변하지 않았다. 또한 apoptosis를 집행하는 caspase의 활성 형태인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3의 단백질 수준이 목향 헥산추출물의 처리에 의해 증가하였고 caspase-3의 표적 단백질 중 하나인 PARP의 불활성 형태인 cleaved PARP의 단백질 수준도 현저하게 증가하였다. 이 결과들은 목향 헥산 추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis를 유도함으로써 전립선 암세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이며 목향 헥산추출물에 의한 apoptosis 유도는 caspase 활성 증가와 Bak 및 t-Bid 단백질의 증가에 의한 것임을 제시한다. 따라서 앞으로 항암효과를 나타내는 성분의 동정 및 동물실험을 통하여 좀 더 면밀한 기전 연구가 수행된다면 목향 헥산추출물은 화학적 암예방 물질이나 치료제로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Saussurea lappa (SL) has been used to reduce abdominal pain and tenesmus in traditional oriental medicine. SL and major compounds of SL, sesquiterpene lactones, have been suggested to possess various biological effects, including anti-tumor, anti-ulcer, anti-inflammatory, anti-viral and cardiotonic activities. Recently, it has been reported that ethanol extracts from roots of SL have antiproliferative effects on gastric cancer cells. To explore the possibility that SL has chemopreventive effects on prostate cancer, we examined whether the hexane extract of SL (HESL) inhibits the growth of LNCaP human prostate cancer cells. Cells were incubated with various concentrations ($0{\sim}4$ mg/L) of HESL in DMEM/F12 containing 5% charcoal stripped fetal bovine serum. HESL substantially decreased viable cell numbers and induced apoptosis of LNCaP cells in dose-dependent manners. HESL increased the levels of cleaved caspase-8, -9, -7 and -3, and poly (ADP-ribose) polymerase. HESL increased the levels of the pro-apoptotic Bak and truncated-Bid proteins whereas it had no effect on the anti-apoptotic Bcl-2, Bcl-xL, or Mcl-1. The present results indicate that HESL inhibits the growth of human prostate cancer cells by inducing apoptosis, which involves the activation of the caspase cascades.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

LNCaP 전립선암세포는 p53 유전자가 변이된 많은 인간의 암세포와는 달리 p53 유전자가 wild type으로 존재하는 세포이다(26). 따라서 목향 헥산추출물이 p53 단백질의 발현에 미치는 영향을 먼저 살펴보았다. 그 결과 목향 헥산 추출물은 p53 단백질의 발현에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig.
Apoptosis는 암세포의 증식을 억제하는 기전 중의 하나이다. 목향 헥산추출물에 의한 세포증식 억제 효과가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis에 미치는 영향을 살펴보았다. Apoptosis의 형태학적 특성을 평가하기 위하여 Hoechst 33258 시약으로 염색한 결과 세포질의 위축, 염색사의 응축 및 핵의 분절 등을 포함하는 전형적인 apoptosis 특이적 형태가 관찰되었다(Fig.
Apoptosis 유발인자에 세포가 노출되면 여러 가지 경로와 핵심 인자들 간의 유기적인 작용으로 최종적으로 단백질 분해 효소인 caspase에 의해서 DNA가 분해되면서 주변세포나 식세포에 의한 phagocytosis를 통해 사멸하게 된다(23). 본 연구에서는 LNCaP 세포에서 목향 헥산추출물의 apoptosis 유도 경로를 조사하기 위하여 목향 헥산추출물을 세포배양액에 첨가하고 48시간 배양한 후 세포를 모아 cell lysate를 만들어 Western blot을 통해 apoptosis를 조절하는 단백질의 발현 양상을 조사하였다.
그러나 현재까지 전립선암에 대한 목향의 효과는 연구된 바 없다. 본 연구에서는 목향이 전립선 암세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 LNCaP 세포의 증식과 apoptosis에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물을 LNCaP 세포 배양액에 여러 농도(0～4 mg/L)로 첨가하여 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다.
본 연구에서는 목향이 전립선암에 미치는 영향을 조사하기 위해 목향이 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 LNCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하고 그 기전을 밝히고자 하였다.
또한 Ko 등은 목향 에탄올 추출물이 AGS gastric cancer cell의 세포증식은 현저히 억제하나 rat의 정상상피세포의 세포증식 억제효과는 미약하다고 보고하였다(8). 이러한 결과를 통해 목향은 대장암세포, 위암세포, 유방암세포 뿐만 아니라 전립선암세포의 증식도 억제하며 독성과 부작용이 비교적 적은 항암제로 개발할 수 있는 좋은 소재가 될 수 있음을 제시한다.
이렇게 활성화된 caspase-3는 caspase-7을 활성화시키고 활성화된 effector caspase들은 lamin A, PARP, DNA fragmentation factor 등의 단백질을 분해하여 apoptosis를 유도한다(33,34). 이처럼 apoptosis에 있어 중요한 역할을 하는 caspase의 활성에 미치는 목향 헥산추출물의 효과를 조사하기 위하여 caspase의 활성형태인 cleaved caspase 단백질들의 발현을 조사하였다. 그 결과 initiator caspase인 cleaved caspase-8, -9은 각각 4 mg/L, 3 mg/L 농도에서 약 3배 정도 증가하였다(Fig.

제안 방법

세포를 50,000 cells/well의 밀도로 4-well chamber slide에 분주하였다. 24시간 후 5% charcoal stripped FBS medium으로 배지를 교환하고 24시간 뒤 여러 농도의 목향 헥산추출물이 포함된 5% charcoal stripped FBS medium을 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 4% formaldehyde로 20분간 고정시키고, DNA-specific fluorochrome Hoechst 33258로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다(19).
24시간이 지난 후 10% FBS 대신 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 교환하여 혈청에 함유된 여러 성분들의 효과를 최소화하였다. 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 세포를 24시간 동안 배양한 후 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지에 목향 헥산추출물을 여러 농도(0, 1, 2, 3, 4 mg/L)로 첨가하여 교환한 후 세포를 배양하였다. 목향 헥산추출물을 첨가한 후 24시간, 48시간, 72시간이 경과한 뒤 MTT assay로 살아있는 세포수를 측정하였다(16).
이를 통해 미토콘드리아를 통한 내적 경로와 death receptor를 통한 외적인 경로가 서로 연결되게 된다(28). LNCaP 세포에서 목향 헥산 추출물에 의해 증가된 apoptosis가 미토콘드리아 막 투과성의 변화에 의한 것인지 확인하기 위하여 Western blot을 통해 Bcl-2 family 단백질들의 변화를 조사하였다. Anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1은 목향 헥산추출물의 처리에 의해 변화하지 않았고(Fig.
24시간 후 5% charcoal stripped FBS medium으로 배지를 교환하고 24시간 뒤 여러 농도의 목향 헥산추출물이 포함된 5% charcoal stripped FBS medium을 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 4% formaldehyde로 20분간 고정시키고, DNA-specific fluorochrome Hoechst 33258로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다(19).
본 연구에서는 목향이 전립선 암세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 LNCaP 세포의 증식과 apoptosis에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물을 LNCaP 세포 배양액에 여러 농도(0～4 mg/L)로 첨가하여 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 LNCaP 세포의 증식은 현저하게 감소하였고 apoptosis는 증가함을 관찰하였다.
세포를 24 well-plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 목향 헥산추출물을 처리하였다. 목향 헥산추출물을 첨가하여 48시간이 경과한 후 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집하였다. 세포를 Annexin V-PE와 7-AAD로 염색한 후 FACScan^TM(Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA)를 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 Annexin V 또는 7-AAD에 의해 염색된 세포의 수를 측정하였다(17,18).
5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 세포를 24시간 동안 배양한 후 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지에 목향 헥산추출물을 여러 농도(0, 1, 2, 3, 4 mg/L)로 첨가하여 교환한 후 세포를 배양하였다. 목향 헥산추출물을 첨가한 후 24시간, 48시간, 72시간이 경과한 뒤 MTT assay로 살아있는 세포수를 측정하였다(16).
목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 LNCaP 세포의 증식은 현저하게 감소하였고 apoptosis는 증가함을 관찰하였다. 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis 일으키는 기전을 연구하기 위하여 목향 헥산추출물을 첨가하고 세포를 48시간 배양한 후 cell lysate를 얻어 Western blot을 실시하였다. Apoptosis 과정에 작용하는 중요한 단백질 중 하나인 Bcl-2 family 단백질 중 pro-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bak와 BH3 only Bcl-2 단백질인 truncated-Bid의 단백질 수준은 목향 헥산 추출물에 의해 유의적으로 증가한 반면 anti-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL 및 Mcl-1 단백질 수준은 변하지 않았다.
목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 희석하여 25,000 cells/well의 밀도로 24 well-plate에 분주하였다. 24시간이 지난 후 10% FBS 대신 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 교환하여 혈청에 함유된 여러 성분들의 효과를 최소화하였다.
목향 헥산추출물이 인간의 전립선에서 유래한 LNCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 배양액에 0, 1, 2, 3, 4 mg/L의 목향 헥산추출물을 첨가하고 0, 1, 2, 3일이 경과한 후 MTT assay 방법(16)으로 살아있는 세포수를 측정하였다. 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 세포 증식이 감소하였다(Fig.
2A). 사멸되는 세포수를 정량화하기 위하여 세포배양액에 목향 헥산추출물을 처리하고 48시간 배양한 후 Annexin V로 세포를 염색하여 flow cytometry 방법으로 early apoptotic cell 수를 측정하였다. 목향 헥산추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 살아있는 세포수는 감소하였고 early apoptotic cell 수는 현저하게 증가하여 4 mg/L의 농도에서는 apoptotic cell이 약 58%에 달하였다(Fig.
세포를 100 mm dish에서 위와 동일한 방법으로 목향 헥산추출물을 처리하고 세포 파쇄액을 준비하여 Western blot을 실시하였다. 세포 파쇄액은 세포를 차가운 PBS로 헹구고, 세포를 수집하여 lysis buffer(20 mM Hepes, pH 7.
목향 헥산추출물을 첨가하여 48시간이 경과한 후 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집하였다. 세포를 Annexin V-PE와 7-AAD로 염색한 후 FACScan^TM(Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA)를 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 Annexin V 또는 7-AAD에 의해 염색된 세포의 수를 측정하였다(17,18).

대상 데이터

Bcl-2, Bax antibody는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, Bcl-xL, Mcl-1, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-7, cleaved caspase-9, cleaved poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)에 대한 antibody는 Cell Signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V(Annexin V-PE)와 7-amino-actinomycin D(7-AAD)는 BD Pharmingen(Franklin Lake, NJ, USA)으로부터 구입하였다.
Hoechst 33258 staining. Cells were stained with Hoechst 33258. Images were obtained using a fluorescence microscope.
세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA는 Cambrex Bio Technology(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다. Bovine serum albumin(BSA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), β-actin antibody와 본 연구에 사용한 일반적인 시약은 Sigma Chemical Co.
추출을 2회 반복 실시한 후 추출물을 여과지로 여과하고 감압 농축하여 3 g의 추출물을 얻었다. HPLC 성분 검사 결과 목향 헥산추출물은 목향 메탄올추출물의 헥산분획과 유사한 성분 조성을 지님을 확인하여(data not shown) 목향 헥산추출물을 본 실험에 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Horse radish peroxidase-linked anti-rabbit IgG와 horse radish peroxidase-linked anti-mouse IgG는 Amersham(Buckinghamshire, England)에서 구입하여 사용하였다. Bcl-2, Bax antibody는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, Bcl-xL, Mcl-1, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-7, cleaved caspase-9, cleaved poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)에 대한 antibody는 Cell Signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V(Annexin V-PE)와 7-amino-actinomycin D(7-AAD)는 BD Pharmingen(Franklin Lake, NJ, USA)으로부터 구입하였다.
본 연구팀의 공동연구자인 Im 등은 목향 메탄올추출물의 헥산분획이 detoxifying 효소의 활성을 증가시키며 여러 종류의 암세포 증식억제 효능을 지닌다고 보고하였다(15). 따라서 춘천지역 한약방에서 구입한 목향은 분쇄하여 가루로 만든 후 목향 분말 100 g에 2 L의 헥산을 가하고 환류 조건하에서 70℃의 온도로 3시간 추출하였다. 추출을 2회 반복 실시한 후 추출물을 여과지로 여과하고 감압 농축하여 3 g의 추출물을 얻었다.
세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다.
인간의 전립선에서 유래한 암세포인 LNCaP 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

수집된 결과는 SAS(Statistical Analysis System, ver. 8.01) PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 α=0.05 수준에서 analysis of variance와 Duncan's multiple range test를 이용하여 분석하였다.

이론/모형

PARP의 분절로 인한 불활성화는 세포 분해를 촉진함으로 cleaved PARP의 증가는 세포가 apoptosis 되고 있음을 나타낸다(35,36). Bcl-2 family 단백질들의 변화와 caspase 단백질들의 활성화를 일으킨 목향 헥산추출물이 PARP 단백질의 분절에 미치는 영향을 Western blot을 통해 살펴보았다. Fig.
After serum deprivation, cells were incubated in serum-deprivation medium in the absence or presence of various concentrations of HESL for the indicated periods. Viable cell numbers were estimated by the MTT assay. Each bar represents the mean±SEM (n=6).
그 후 horse radish peroxidase-linked anti-rabbit IgG 또는 horse radish peroxidase-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 protein band는 SuperSignal^ⓡ West Dura Extended Duration Substrate(Pierce, USA)를 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다.

성능/효과

1). 1일 경과 후 2 mg/L 농도의 목향 헥산추출물에서 세포의 증식이 감소하였으며 2일 후에는 낮은 농도(1 mg/L)에서도 세포증식 억제효과를 나타내었고 시간이 경과함에 따라 세포증식의 감소는 더욱 현저하게 나타났다. Jeon 등은 목향에서 분리한 dehydrocostuslactone 성분이 인간의 대장암세포인 HCT-116 세포의 세포증식을 억제한다고 보고하였고(20), Bocca 등은 목향에서 분리한 costunolide 성분이 인간의 유방암세포인 MCF-7의 세포증식을 억제한다고 보고하였다(21).
목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 희석하여 25,000 cells/well의 밀도로 24 well-plate에 분주하였다. 24시간이 지난 후 10% FBS 대신 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 교환하여 혈청에 함유된 여러 성분들의 효과를 최소화하였다. 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지로 세포를 24시간 동안 배양한 후 5% charcoal-stripped FBS를 포함하는 배지에 목향 헥산추출물을 여러 농도(0, 1, 2, 3, 4 mg/L)로 첨가하여 교환한 후 세포를 배양하였다.
LNCaP 세포에서 목향 헥산 추출물에 의해 증가된 apoptosis가 미토콘드리아 막 투과성의 변화에 의한 것인지 확인하기 위하여 Western blot을 통해 Bcl-2 family 단백질들의 변화를 조사하였다. Anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1은 목향 헥산추출물의 처리에 의해 변화하지 않았고(Fig. 4A) pro-apoptotic 단백질 중 Bax 단백질 수준은 변화하지 않았으나 Bak 단백질은 목향 헥산추출물의 처리에 의해 발현이 유의적으로 증가하였다(Fig. 4B). BH3 only Bcl-2 family 단백질 중 Bad, Bik, Bmf 단백질 또한 목향 헥산추출물의 처리에 의한 변화가 없었으나 세포 내·외적인 경로를 연결시켜주는 단백질인 Bid는 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 현저하게 감소하였으며 Bid의 분절형태인 t-Bid는 낮은 농도의 목향 헥산추출물을 처리한 경우에는 변화가 없었으나 4 mg/L 농도의 목향 헥산추출물을 처리한 경우 약 1.
BH3 only Bcl-2 family 단백질 중 Bad, Bik, Bmf 단백질 또한 목향 헥산추출물의 처리에 의한 변화가 없었으나 세포 내·외적인 경로를 연결시켜주는 단백질인 Bid는 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 현저하게 감소하였으며 Bid의 분절형태인 t-Bid는 낮은 농도의 목향 헥산추출물을 처리한 경우에는 변화가 없었으나 4 mg/L 농도의 목향 헥산추출물을 처리한 경우 약 1.3배 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4C).
이처럼 apoptosis에 있어 중요한 역할을 하는 caspase의 활성에 미치는 목향 헥산추출물의 효과를 조사하기 위하여 caspase의 활성형태인 cleaved caspase 단백질들의 발현을 조사하였다. 그 결과 initiator caspase인 cleaved caspase-8, -9은 각각 4 mg/L, 3 mg/L 농도에서 약 3배 정도 증가하였다(Fig. 5). 또한 effector caspase인 caspase-7, -3의 cleaved form도 목향 헥산추출물의 농도가 증가함에 따라 현저하게 증가하였다(Fig.
따라서 목향 헥산추출물이 p53 단백질의 발현에 미치는 영향을 먼저 살펴보았다. 그 결과 목향 헥산 추출물은 p53 단백질의 발현에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이는 위암세포에서 목향 에탄올추출물에 의해 p53이 증가된다고 보고한 Ko 등의 보고(7,8)와는 다른 결과이다.
Apoptosis 과정에 작용하는 중요한 단백질 중 하나인 Bcl-2 family 단백질 중 pro-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bak와 BH3 only Bcl-2 단백질인 truncated-Bid의 단백질 수준은 목향 헥산 추출물에 의해 유의적으로 증가한 반면 anti-apoptotic Bcl-2 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL 및 Mcl-1 단백질 수준은 변하지 않았다. 또한 apoptosis를 집행하는 caspase의 활성 형태인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3의 단백질 수준이 목향 헥산추출물의 처리에 의해 증가하였고 caspase-3의 표적 단백질 중 하나인 PARP의 불활성 형태인 cleaved PARP의 단백질 수준도 현저하게 증가하였다. 이 결과들은 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis를 유도함으로써 전립선 암세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이며 목향 헥산추출물에 의한 apoptosis 유도는 caspase 활성 증가와 Bak 및 t-Bid 단백질의 증가에 의한 것임을 제시한다.
목향 헥산추출물을 LNCaP 세포 배양액에 여러 농도(0～4 mg/L)로 첨가하여 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 목향 헥산추출물의 농도가 증가할수록 LNCaP 세포의 증식은 현저하게 감소하였고 apoptosis는 증가함을 관찰하였다. 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis 일으키는 기전을 연구하기 위하여 목향 헥산추출물을 첨가하고 세포를 48시간 배양한 후 cell lysate를 얻어 Western blot을 실시하였다.
사멸되는 세포수를 정량화하기 위하여 세포배양액에 목향 헥산추출물을 처리하고 48시간 배양한 후 Annexin V로 세포를 염색하여 flow cytometry 방법으로 early apoptotic cell 수를 측정하였다. 목향 헥산추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 살아있는 세포수는 감소하였고 early apoptotic cell 수는 현저하게 증가하여 4 mg/L의 농도에서는 apoptotic cell이 약 58%에 달하였다(Fig. 2B). 이는 목향의 주요한 성분인 costunolide와 dehydrocostuslactone이 apoptosis를 유도한다는 다른 연구결과들(9,22)과 일치하는 내용으로 목향 헥산추출물의 전립선암세포 증식 억제 효과는 암세포의 apoptosis를 통해 이루어짐을 알 수 있다.
또한 apoptosis를 집행하는 caspase의 활성 형태인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3의 단백질 수준이 목향 헥산추출물의 처리에 의해 증가하였고 caspase-3의 표적 단백질 중 하나인 PARP의 불활성 형태인 cleaved PARP의 단백질 수준도 현저하게 증가하였다. 이 결과들은 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis를 유도함으로써 전립선 암세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이며 목향 헥산추출물에 의한 apoptosis 유도는 caspase 활성 증가와 Bak 및 t-Bid 단백질의 증가에 의한 것임을 제시한다. 따라서 앞으로 항암효과를 나타내는 성분의 동정 및 동물실험을 통하여 좀 더 면밀한 기전 연구가 수행된다면 목향 헥산추출물은 화학적 암예방 물질이나 치료제로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
이는 목향 에탄올추출물이 위암세포주에서 활성화된 caspase-3 단백질의 발현을 증가시킨다는 보고(7,8) 및 melanoma cell에서 isocostunolid가 procaspase-8, -3를 감소시킨다는 보고(11)와 일치하는 결과이다. 이들 결과로부터 목향 헥산추출물의 apoptosis 유도 효과는 Bcl-2 family 단백질의 변화와 더불어 활성화된 caspase 단백질의 발현 증가에 의한 것임을 확인할 수 있다.
이상의 결과들을 통해 목향 헥산추출물은 전립선암세포인 LNCaP 세포에서 Bcl-2 family 단백질들의 변화와 caspase-8, -9, -3, -7의 활성 증가에 의해 PARP를 불활성화시킴으로써 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다. 최근에는 강력한 PARP-1 억제제를 암환자의 임상시험으로도 사용하고 있어(37) PARP를 억제함으로써 apoptosis를 유도한 목향 헥산추출물은 향후 화학적 암예방 물질이나 치료제로 개발될 가능성을 지님을 제시한다.
따라서 p53의 변화 여부도 Bcl-2 family 단백질들의 발현 특성에 차이를 나타내는 이유 중 하나가 될 수 있다고 판단된다. 이상의 결과를 통해 목향 헥산추출물은 Bcl-2 family 단백질들의 수준을 변화시켜 apoptosis를 유도한다는 결론을 내릴 수 있다.

후속연구

이 결과들은 목향 헥산추출물이 LNCaP 세포의 apoptosis를 유도함으로써 전립선 암세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이며 목향 헥산추출물에 의한 apoptosis 유도는 caspase 활성 증가와 Bak 및 t-Bid 단백질의 증가에 의한 것임을 제시한다. 따라서 앞으로 항암효과를 나타내는 성분의 동정 및 동물실험을 통하여 좀 더 면밀한 기전 연구가 수행된다면 목향 헥산추출물은 화학적 암예방 물질이나 치료제로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
특히, 목향 헥산추출물은 아주 낮은 농도(1～4 mg/L)에서 그 효능을 나타냄으로 효능이 높은 항암제로 개발되기 위해서 transgenic mouse prostate adenocarcinoma(TRAMP) mouse 동물모델을 이용하여 동물실험을 수행할 가치가 있다고 사료된다. 또한 이러한 용도로 목향 헥산추출물을 사용하기 위해서는 항암효과를 나타내는 성분의 동정 및 좀 더 세밀한 기전연구 등 추후에도 계속적으로 다양한 연구가 수행되어야 할 것이다.
최근에는 강력한 PARP-1 억제제를 암환자의 임상시험으로도 사용하고 있어(37) PARP를 억제함으로써 apoptosis를 유도한 목향 헥산추출물은 향후 화학적 암예방 물질이나 치료제로 개발될 가능성을 지님을 제시한다. 특히, 목향 헥산추출물은 아주 낮은 농도(1～4 mg/L)에서 그 효능을 나타냄으로 효능이 높은 항암제로 개발되기 위해서 transgenic mouse prostate adenocarcinoma(TRAMP) mouse 동물모델을 이용하여 동물실험을 수행할 가치가 있다고 사료된다. 또한 이러한 용도로 목향 헥산추출물을 사용하기 위해서는 항암효과를 나타내는 성분의 동정 및 좀 더 세밀한 기전연구 등 추후에도 계속적으로 다양한 연구가 수행되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	목향이란?	목향은 국화과에 속한 다년생 식물인 Saussurea lappa의 뿌리로서 한의학에서는 구토, 설사 및 염증치료 등에 사용되고 있다. 목향 추출물 및 그 성분들은 항균 작용, 항염증 작용, 혈관생성 억제 효능 등을 지니고 있으며 위암과 대장암의 세포증식을 억제하는 것으로 알려져 있다.
	세포사멸은 Bcl-2 family protein의 변화를 통해 미토콘드리아에서 무엇의 분비를 조절하는가?	최근 연구에 따르면 많은 종류의 항암제와 항암화학요법에 사용되는 물질들은 많은 암에서 암세포 세포사멸을 유도함으로써 암의 발생과 진행을 억제하는 것으로 알려져 있다(11). Apoptosis는 Bcl-2 family protein의 변화를 통해 미토콘드리아에서 cytochrome c의 분비를 조절함으로써 apoptosis를 조절하는 내적인 경로와 Fas 매개 신호체계를 통해 apoptosis를 조절하는 외적인 경로로 크게 나눌 수 있다(14). 식품에 들어있는 여러 가지 성분들은 단백질의 발현 및 기능 조절, mRNA의 발현 조절 등을 통해 직·간접적으로 유전자 발현을 변화시켜 apoptosis를 조절할 수 있다(12).
	목향 추출물 및 그 성분들은 어떤 효능을 지니고 있는가?	목향은 국화과에 속한 다년생 식물인 Saussurea lappa의 뿌리로서 한의학에서는 구토, 설사 및 염증치료 등에 사용되고 있다. 목향 추출물 및 그 성분들은 항균 작용, 항염증 작용, 혈관생성 억제 효능 등을 지니고 있으며 위암과 대장암의 세포증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 전립선암에 대한 목향의 효과는 연구된 바 없다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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