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문제 정의
- 이 연구에서는 예로부터 널리 이용되어 왔던 약용식물 24종의 메탄올 추출물에 대한 선행 연구로 총 페놀 함량과 전자공여능을 측정하였다. 그 중 총 페놀 함량과 전자공여능이 높았던 목향을 선택하여 메탄올 추출물을 극성별 유기 용매로 분획하고 분획별 항산화 및 항암 활성을 측정하였다.
제안 방법
- 건조시료 5배량의 methanol을 가하여 5일간 때때로 흔들어 주며 3회 반복 추출하고 여과지(Adventec toyo2)를 사용하여 여과하였다. 여액을 45。(2에서 감압 농축하고 농축액을 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다.
- 전자공여능을 측정하였다. 그 중 총 페놀 함량과 전자공여능이 높았던 목향을 선택하여 메탄올 추출물을 극성별 유기 용매로 분획하고 분획별 항산화 및 항암 활성을 측정하였다.
- 대장암과 위암 세포에는 RPMI1640 배지를, 자궁경부암 세포에는 DMEM 배지를 사용하였고, 각각에 FBS 10%(v/v)와 antibiotics l%(v/v)를 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 incubatoi에서배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3회 80% 이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 또한 항암활성을 알아보기 위해 세 가지 인간 유래 암세포에 대한 성장 저해활성을 측정하였다.
- 목향의 각 분획별 항산화 활성으로 총 페놀 함량, DPPH를 이용한 전자공여능, 아질산염 소거능을 측정하였고, 효소 저해활성으로 xanthine oxidase 저해 활성을 측정하였다. 또한 항암활성을 알아보기 위해 세 가지 인간 유래 암세포에 대한 성장 저해활성을 측정하였다.
- 분획 추출물은 100% DMSO에 녹인 후 희석하여 DMSCO의 배지 내 최종농도가 0.02%가 되도록 하였으며 20 时씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 5, 10, 50, 100 瞄/n起로 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1 칼럼(6 wells)을 동일한 조건으로 사용하였으며, 나머지 한 칼럼에는 추출물 대신 0.
- 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 incubatoi에서배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3회 80% 이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 4 血을 가하여 잘 혼합하였다. 실온에서 15분간 방치한 후 520nm에서 흡광도를 측정하고 잔존하는 아질산량을 측정하였다. 이때 추출물 무 첨가구는 증류수 0.
- 각각의 분획 을 100 μg/mZ, 500 ng/ml, 1000 의 농도로 methan이에 녹여 조제하고 1 mZ를 test tube에 취하였다. 여기에 4X 10-4 M의 DPPH 용액 4mZ를 가하여 vortex mixer로 1C초간 진탕하고 실온에서 20분 동안 방치한 후에 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물무 첨가구에는 시료 대신 methanol 1 mZ를 첨가하여 동일하게 실험하고 추출물 첨가구에 대한 흡광도의 감소 비율로 전자공여능을 나타내었다.
- 여액을 45。(2에서 감압 농축하고 농축액을 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. 용매별 분획은 methanol 추출물에 약 5배수의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 증류수와 같은 양의 hexane을 가하여 진탕하고 방치한 후 용매층을 감압 농축하고 동결 건조하여 hexane 분획을 얻었으며 수용성 층을 동일한 방법으로 chloroform, EtOAc 및 BuOH을 첨가하여 순차적으로 분획한 후 농축하여 각각 chloroform, EtOAc 및 BuOH 분획으로 사용 하였고, 남은 수용성층은 농축하여 water 분획으로 하였다.
- 실온에서 15분간 방치한 후 520nm에서 흡광도를 측정하고 잔존하는 아질산량을 측정하였다. 이때 추출물 무 첨가구는 증류수 0.5 m2를 가하여 같은 방법으로 실험하였으며, positive controls, ascorbic acid를 사용하여 아질산염 소거능을 비교하였다. 실험에 사용된 농도는 100 gg/m/, 500 ng/mZ, 1000 μg/m/였고소거능(%)은 다음 식에 따라 구하였다.
- 여기에 탄산나트륨 포화용액 1 m/을 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기위해 표준물질 tannic acid를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 각 분획의 총 페놀 함량을 측정하였다.
- 02%가 되도록 하였으며 20 时씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 5, 10, 50, 100 瞄/n起로 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1 칼럼(6 wells)을 동일한 조건으로 사용하였으며, 나머지 한 칼럼에는 추출물 대신 0.2%의 DMSO만을 20 財씩 첨가하여 100% 생존군으로 하였다. 암세포와 추출물이 접종된 plate를 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양 후 MTT 시약 25 山를 모든 well에 가하고 다시 4시간 배양하였다.
- Positive controls. 합성 항산화제인 BHH를 동일한 방법으로 실험하여 각각의 분획 추출물이 가지는 환원력과 비교하였으며, 다음 식으로 전자공여능(%)을 구하였다.
대상 데이터
- 배양 후 바닥에 형성된 formazan 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 모든 well의 배지를 제거하고 각 well에 DMSO를 200|H/well씩 가하여 10분간 가볍게 진탕하여 결정을 용해한 후 microplate spectrophotometers. 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해 form azan으로 분해된 양을 나타내며, 이 값은 각 well에 살아있는 세포 수와 비례한다.
- 사용하였다. 세 포배 양에 사용된 Dulbecco's modified eagle's mediumDMEM, 4.5 g/Z glucose & L-Glutamine), fetal bovine serum(FBS)은 Cambrex사, Roswell park memorial institute medium(RPMI, 2.05 mM L- Glutamine), penicilline Hyclone사 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약은 특급 및 일급 시약으로 Folin- docalteu's phenol reagent, 2, 2-diphenyl- 1-picryl-hydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, trichloroacetic acid (TCA), ascorbic acid, butylated hydroxy toluene (BHT), potassium phosphate (monobasic, dibasic), sulfanilic acid, naphthylamine, 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyterazoliumbroinide(MTT) 은 Sigma사, dimethyl sulfoxide(DMSO), sodium nitrite, sodium carbonate, tannic acide Merck사 제품을, methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate 및 n-butanole Burdick & Jacksor사의 HPLC급 시약을 사용하였다. 세 포배 양에 사용된 Dulbecco's modified eagle's mediumDMEM, 4.
- 실험에 사용한 3종류의 인간유래 세포는 대장암 세포인 HT-29((KCLB 30038), 위암 세포인 SNU-1 (KCLB 00001), 자궁경부암 세포인 HeLa(KCLB 10002)로서 한국세포주은행 (KCLB 고로부터 분양받아 사용하였다.
- 실험에 사용한 기기로는 rotary vacuum evaporator (N-1000, Eyela, Japan), UV/VIS spectrophotometer (V-550, JASCO, USA), microplate spectrophotometer (SPECTRA max 340PC, Molecular Devices, USA), CO2 incubator(MCO-17AIC, Sanyo, Japan), microplate shaker(SH30, FINEPCR, Korea), high speed centrifuge (Supra22K, Hanil, Korea) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용한 목향(Sauswrea lappa、)은 2006년 10월 대구약령시에서 건조 상태의 국산재료를 구입하여 사용하였다. 2 *
이론/모형
- XOase 저해활성은 Stripe舟 Corte의 방법啊 따라 측정하였다. 효소의 반응에 사용된 기질액은 0.
- 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법μ)에 따라 측정하였다. 1 mM NaNQ용액 1 血에 각각의 분획 추출물을 농도별로 0.
- 용매별 분획에 대한 총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법 ”에 따라 분석하였다. 각각의 분획을 DMSO에 일정 농도로 녹인 후 0.
- 전자공여능은 Blois의 방법”)으로 측정하였다. 각각의 분획 을 100 μg/mZ, 500 ng/ml, 1000 의 농도로 methan이에 녹여 조제하고 1 mZ를 test tube에 취하였다.
성능/효과
- 1과 같다. EtOAc 분획 이 35.83%(100 曲/ ml), 93.10%(500 ng/m/), 94.34%(1000 昭用)로 합성항산화제인 BHT보다 모든 농도에서 높았고, hexane과 water 분획은 농도와 관계없이 낮았으며, 나머지 분획은 농도가 증가할수록 전자공여능 또한 증가하였다.
- 3과 같다. EtOAc 분획에서 81.95%(500μg/ ml), 90.37%(1000 μg/mZ)로 대조구인 ascorbic acid의 77.03%(500 gg/mT), 92.37%(1000 μg/m/)보다 XOase 저해활성이 높았고, 100 姒血에서는 모든 분획뿐만 아니라 대조구에서도 효소저해활성이 나타나지 않았다. 여 등", 이 녹차, 오룡차, 홍차 추출물의 XOase 억제 효과를 측정한 결과 차의 polyphenol 화합물과 catechin류 함량에 비례하여 효소의 활성을 저해한다고 보고하였다.
- 대장암세포인 HT-29, 위암 세포인 SNU-1에 대해서 hexane과 chloroform 분획이 높은 성장 저해활성을 보인 반면 자궁경부암세포인 HeLa同포에 대해서는 낮은 성장 저해활성을 보였다. Hexane 분획에서 HT-29, SNU-1, HeLa세포에 대한 각각의 성장 저해율은 64.50%-98.56%, 63.13%-96.81%, 9.22%-66.74%로 다른 분획들에 비해 가장 높았고, chloroform 분획이 다음으로 높았으며, 나머지 분 획의 암세포 성장 저해율은 상대적으로 낮았다.
- Hexane 분획이 22.38%(500 ng/ml), 42.81%(1000 μg/mZ)로 대조구 인 ascorbic acid의 19.22%(500 昭‘ ml), 34.19%(1000ng/mZ) 보다 높게 나타났으며, 총 페놀 함량 및 전자공여능이 가장 높았던 EtOAc 분획은 17.60%(500 ng/mZ), 28.09%(1000 ?丄g/m/)로 대 조구에 비해 낮았다.
- Table 2와 같다. 대장암세포인 HT-29, 위암 세포인 SNU-1에 대해서 hexane과 chloroform 분획이 높은 성장 저해활성을 보인 반면 자궁경부암세포인 HeLa同포에 대해서는 낮은 성장 저해활성을 보였다. Hexane 분획에서 HT-29, SNU-1, HeLa세포에 대한 각각의 성장 저해율은 64.
- 가지고 있다고 보고하였다. 또한 목단피, 백작약, 복분자, 두충을 hexane, chloroform, EtOAc 용매로 분획하여 라디칼소거능을 조사한 결과 EtOAc 분획에서 높은 활성을 보였다고 하였으며, 이 연구 결과와 동일한 경향을 보였다. 따라서 목향의 EtOAc 분획은 천연항산화제로서 사용이 가능할 것으로 생각된다.
- 목향의 메탄올 추출물에 대한 분획별 총 페놀 함량은 EtOAc 분획에서 37.06%, 가장 높았고, 전자공여능 또한 35.83%(100 p.g/m/), 93.10%(500 gg/m/), 94.34% (1000pg/m/)로 합성항산화제인 BHT보다 모든 농도에서 높았다.
- 아질산염 소거능은 hexane 분획이 22.38%(500 eg/ m/), 42.81%(1000μg/m/)로 대조구인 ascorbic acid 보다 높았으며, 총 페놀 함량 및 전자공여능이 가장 높았던 EtOAc 분획은 대조구에 비해 낮은 소거 능을 보였다.
- 암세포 성장 저해활성을 측정한 결과 hexane 분 획이 대장암세포인 HT-29에 대해 64.50%-98.56%, 위암 세포인 SNU-1에 대해 63.13%-96.81%로 높은 성장 저해 활성을 보인 반면 자궁경부암세포인 HeLa세포에 대해서는 9.22%-66.74%로 상대적으로 저해활성이 낮았다.
- 이상의 결과, 목향의 EtOAc 분획에서 총 페놀, 전자공여 능, 효소저해활성이 높았으며, hexane, chloroform 분획에서 암세포의 성장 저해활성이 높았다. 따라 서목 향의 EtOAc 분획은 항산화 활성이 있는 기능성 식품으로의 개발이 가능할 것으로 생각되며, hexane, chloroform 분획은 위암, 대장암과 자궁경부암 치료보조제로서의 개발을 위한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 총페놀 함량 및 전자공여능, 아질산염 소거능이 높았던 EtOAc 분획에서는 암세포의 성장 저해능이 없었다. 일반적으로 phenol성 물질이 항산화 및 항암 활성을 갖는 것으로 알려져 있으나 목향의 경우 EtOAc 분획물의 총 페놀 함량 및 전자공여능 측정 결과 높은 항산화 활성을 가졌다고는 할 수 있으나, 암세포의 성장에 대한 저해 활성은 낮았다.
후속연구
- 따라 서목 향의 EtOAc 분획은 항산화 활성이 있는 기능성 식품으로의 개발이 가능할 것으로 생각되며, hexane, chloroform 분획은 위암, 대장암과 자궁경부암 치료보조제로서의 개발을 위한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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