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문제 정의
- 이에 저자는 고지방식이로 유발된 인슐린 저항성 동물모델에 木香 투여가 미치는 영향을 알아보고자 체중, 혈당, 인슐린 저항성, 항염증 효과 등을 관찰한 결과 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 5. 木香은 IL-10 유전자 발현을 증가시켰다.
제안 방법
- Fc Block(BD Pharmingen, USA)(20 μg/ml)을 1:100의 비율로 넣고 10분간 반응시킨 다음 fluorophore-conjugated된 antibodies인 CD45-APC Cy7(BD Pharmingen,USA), F4/80-APC(eBioscience, USA), CD11b-phycoerythrin(CD11b-PE, BD Biosciences, USA)를 넣고 차광상태에서 20분간 반응시킨다. 2% FBS/PBS 용액으로 세척한 다음 FACS LSRII(BD biosciences,USA)를 이용하여 분석한다. 이후 FlowJo 프로그램(Tree star inc, USA)을 이용하여 CD45(+), CD11b(+), F4/80(+)인 macrophage의 퍼센트를 분석한다.
- 지방 세포의 TNF-α, IL-6, IL-10 및 cluster of differentiation 68(CD68) 유전자의 발현 측정은 실시간 정량 역전사 연쇄중합반응(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다. qRT-PCR에 앞서 complementary DNA(cDNA)의 제작은 Advantage RT for PCR Kit(Clontech, USA)을 이용하였다. 지방 조직에서 분리한 1 μg의 RNA에 OligodT와 RNase-free H2O를 넣고 70 ℃에서 2분간 반응시킨 다음 10 nM dNTP, recombinant RNase inhibitor, MMLV reverse transcriptase, 5× reaction buffer를 각각 넣고 42 ℃에서 60분, 94 ℃에서 5분씩 반응시켰다.
- 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 60% fat diet를 12주간 섭취시켜 비만형 제 2형 당뇨병을 유발하였다. 木香 투여군은 60% fat diet에 木香을 5%의 비율로 섞어 12주간 섭취하도록 하였다.
- 경구당부하 검사는 실험 11주째 12시간 이상 금식시킨 후 공복 혈당을 측정한 다음 glucose(2 g/㎏ body weight)를 distilled water에 녹여 경구 투여시킨 다음 30분 후, 60분 후, 90분 후, 120분 후 mouse의 tailvein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당은 strip-operated blood glucose sensor(ONETOUCH ultra, Inverness Medical ltd, UK) 기기를 이용하여 측정하였다.
- 그 후 정상군을 제외한 모든 실험군에 인슐린저항성을 일으킨다고 알려진 60% fat diet(HFD, Research Diets, #D12492)를 12 주간 섭취시켜 비만을 유발하였다(Table 1).
- 실험 시작 12주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방 조직(epididymal fat pad) 및 간의 무게를 측정하였다.
- 인슐린 저항성은 homeostasis model of assessment-insulin resistance(HOMA-IR)를 이용하여 측정하였다. 실험 시작 12주째에 12시간 이상 금식시킨 후 공복 혈당 및 인슐린을 측정하였고, HOMA-IR은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 실험군은 male C57BL/6 mouse 6마리씩 정상군(normal), 대조군(control), 木香 투여군(Inula)으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 60% fat diet를 12주간 섭취시켜 비만형 제 2형 당뇨병을 유발하였다.
- 역전사를 통해 얻어진 각각의 cDNA에 2× SYBRreaction buffer, primers, dH2O를 혼합하여 7,900 HTfast real-time PCR System(Applied Biosystems®,USA)을 이용하여 연쇄중합반응을 시행하였다.
- 유전자 발현 분석은 SDS software 2.4(Applied Biosystems®,USA)를 이용하여 얻은 각각의 유전자에 대한 threshold cycle(CT)값을 GAPDH 기준으로 Relative Quantitation(RQ)값을 환산한 다음 fold change값을 계산하였다.
- 2% FBS/PBS 용액으로 세척한 다음 FACS LSRII(BD biosciences,USA)를 이용하여 분석한다. 이후 FlowJo 프로그램(Tree star inc, USA)을 이용하여 CD45(+), CD11b(+), F4/80(+)인 macrophage의 퍼센트를 분석한다.
- 인슐린 저항성은 HOMA-IR을 이용하여 측정하였다. HOMA법은 일회의 공복 혈당과 인슐린 측정치를 일정한 공식에 대입하여 인슐린 감수성을 측정하는 방법이며 비교적 적은 측정간 오차를 가지고 있으며 표준검사인 클램프법과의 상관관계가 높아서 임상적인 사용에 고려될 수 있는 방법이다4.
- 지방 세포의 TNF-α, IL-6, IL-10 및 cluster of differentiation 68(CD68) 유전자의 발현 측정은 실시간 정량 역전사 연쇄중합반응(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다.
- 지방세포(adipocyte)가 포함된 上淸液을 스포이드를 이용해 분리한 다음 하층의 pellet을 제외한 나머지 용액을 제거하고 PBS에 2% fetal bovine serum(FBS, Sigma, USA)을 넣은 용액에 넣은 다음 100 μm cell strainer(BD biosciences, USA)를 이용하여 불필요한 조직을 제거하고 200 ×g에서 10분 동안 원심분리 하여 하부의 모아진 세포를 RBC lysis buffer(eBioscience, USA)에 10분 간 처리, 원심 분리 하여 SVC를 모은다.
- 지방조직내의 macrophage의 침착량이 증가할수록 염증 관련 인자들의 분비량이 증가하여 염증상태가 유발되므로6 본 실험에서 염증 상태의 개선효과를 알아보기 위해 ATM의 number와 percentage를 분석하였다. ATM number와 percentage에 있어서 대조군에서 정상군보다 모두 유의하게 증가하여 본 실험에서도 고지방식이로 유발된 비만이 지방조직의 염증상태를 유발한 것으로 확인되었다.
- 지방조직에서 분리한 SVC를 cellometer(NexcelomBioscience llc, USA)를 이용하여 세포수를 측정한 다음 각 샘플당 106 cell 농도로 조정한다. Fc Block(BD Pharmingen, USA)(20 μg/ml)을 1:100의 비율로 넣고 10분간 반응시킨 다음 fluorophore-conjugated된 antibodies인 CD45-APC Cy7(BD Pharmingen,USA), F4/80-APC(eBioscience, USA), CD11b-phycoerythrin(CD11b-PE, BD Biosciences, USA)를 넣고 차광상태에서 20분간 반응시킨다.
- 실험 시작 12주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방 조직(epididymal fat pad)을 분리하여 알루미늄 호일에 싸서 신속하게 액화질소에 담가 RNA 분리전까지 -70 ℃에 보관하였다. 지방조직에서의 RNA 분리는 mini RNA isolation IIkitTM(Zymo Research, USA)을 이용하였다. 보관된지방 조직을 해동시켜 tube에 넣고 여기에 ZR RNAbuffer 300 μl씩을 분주한 다음 homogenizer를 이용하여 조직을 분쇄하였다.
- 체중은 실험 개시 일에 최초 측정 한 후 실험 종료일 마지막 sampling하기 전에 측정하였다. 체중측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea)을 사용하여 측정하였으며, 측정 시 mouse의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 mouse을 올려놓고, mouse가 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
- 경구당부하 검사는 실험 11주째 12시간 이상 금식시킨 후 공복 혈당을 측정한 다음 glucose(2 g/㎏ body weight)를 distilled water에 녹여 경구 투여시킨 다음 30분 후, 60분 후, 90분 후, 120분 후 mouse의 tailvein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당은 strip-operated blood glucose sensor(ONETOUCH ultra, Inverness Medical ltd, UK) 기기를 이용하여 측정하였다.
- 고지방 식이 투여 12주째 실험쥐의 tail vein에서 혈액을 채취한 다음 4 ℃에서 2,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 인슐린은ultra sensitive mouse insulin ELISA kit(CrystalChem inc, USA)을 이용하여 측정하였다. 96 wellantibody-coated microplate에 insulin standards 및 샘플을 5 μl씩 분주한 다음 4 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 5차례 세척 후 anti-insulin enzymeconjugate를 각 well에 분주하고 30분간 실온에서 반응시켰다.
대상 데이터
- 19~21 g의 male C57BL/6 mouse(중앙실험동물, Korea)를 구매하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되며, 20~24 ℃의 온도와 40~70%의 습도가 유지되는 stainless-steel cage에서 1주일간 사육시켜 적응기를 거쳤다. 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
- 지방조직은 male C57BL/6 mouse로부터 실험 시작 12 주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방조직(epididymal fat pad)을 채취하였다. mouse로부터 채취한 지방조직은 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, USA)에 2% bovine serum albumin(BSA, Gibco, USA)를 넣은 용액에 넣은 다음 roundshape scissor를 이용하여 1~2 mm 크기의 작은 조각으로 분쇄하였다.
데이터처리
- 통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 2.00, Graphpad software inc, USA)로 이용하였고, 각 군 간의 비교는 one-way analysisof variance(ANOVA)에 이어 Tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 인슐린 저항성은 homeostasis model of assessment-insulin resistance(HOMA-IR)를 이용하여 측정하였다. 실험 시작 12주째에 12시간 이상 금식시킨 후 공복 혈당 및 인슐린을 측정하였고, HOMA-IR은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
- 1. 木香은 공복 혈당을 감소시켰다.
- 120분 후 혈당에서도 대조군(240.14±20.61 mg/dl)이 정상군(124.43±7.28 mg/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(169.20±15.38 mg/dl)은 대조군보다 유의하게 낮았다(P<0.05)(Fig. 1).
- 2. 木香은 경구당부하 검사 결과 고혈당을 감소시켰다.
- 3. 木香은 인슐린 저항성을 완화시켰다.
- 30분 후 혈당에서는 대조군(320.57±59.09 mg/dl)이 정상군(203.14±15.79 mg/dl)과 비교하여 유의한 차이는 없었고, 木香 투여군(398.80±55.24 mg/dl)도 대조군과 비교하여 유의한 차이는 없었다.
- 4. 木香은 ATM number와 percentage를 감소시켰다.
- 6. 木香은 CD68 유전자 발현을 감소시켰다.
- 60분 후 혈당에서는 대조군(368.14±30.10 mg/dl)이 정상군(191.43±9.74 mg/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(329.20±49.33mg/dl)은 대조군과 비교하여 유효한 차이는 없었다.
- 90분 후 혈당에서는 대조군(316.57±33.37 mg/dl)이 정상군(150.00±8.03 mg/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001),木香 투여군(210.20±18.32 mg/dl)은 대조군보다 유의하게 낮았다(P<0.05).
- 본 실험에서 염증 상태의 개선효과를 알아보기 위해 ATM의 number와 percentage를 분석하였다. ATM number와 percentage에 있어서 대조군에서 정상군보다 모두 유의하게 증가하여 본 실험에서도 고지방식이로 유발된 비만이 지방조직의 염증상태를 유발한 것으로 확인되었다.木香 투여군에서는 대조군에 비해서 ATM의 수와 percentage에 있어서 모두 유의하게 감소하여 木香이 지방조직 내의 macrophage의 침착을 억제함으로써 염증 상태를 개선시킨다는 것을 알 수 있었다.
- CD68 유전자의 발현은 대조군(17.72±1.24)이 정상군(1.01±0.02)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(11.99±1.21)은 대조군보다 유의하게 낮았다(P<0.05)(Fig. 2).
- ATM number와 percentage에 있어서 대조군에서 정상군보다 모두 유의하게 증가하여 본 실험에서도 고지방식이로 유발된 비만이 지방조직의 염증상태를 유발한 것으로 확인되었다.木香 투여군에서는 대조군에 비해서 ATM의 수와 percentage에 있어서 모두 유의하게 감소하여 木香이 지방조직 내의 macrophage의 침착을 억제함으로써 염증 상태를 개선시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 동물 실험에서 인슐린 신호를 직접적으로 방해하며 간세포에서 당원이 생성되는 것을 막아서 인슐린 저항성을 유발하는 것으로 알려져 있다2. 본 실험에서 IL-6 유전자 발현은 木香 투여군에서 대조군에 비해 감소하였으나 유의한 억제 효과를 보이지 않았다.
- 당뇨병 진단 시 공복 혈당만을 사용할 경우 약 30%의 미진단군이 발생할 수 있으며, 경구당부하 검사만이 내당능장애를 진단할 수 있는 유일한 방법이다4. 본 실험에서 공복 혈당은 木香 투여군이 대조군보다 유의하게 낮았고, 경구당부하 검사 결과에서도 90분 후, 120분 후 혈당에서 木香 투여군이 대조군보다 유의하게 낮아 당대사를 개선시켰다.
- 본 실험에서 대조군에서는 정상군보다 TNF-α 유전자 발현이 유의하게 증가하였으나 木香 투여군에서는 대조군에 비해 감소하였으나 유의한 억제 효과는 없었다.
- 또한 간은 정상적인 혈당을 유지하는데 중요한 역할을 하기 때문에 췌장과 독립적으로 당대사 질환을 예방 또는 치료하는데 있어 표적기관이 되고있다24. 본 실험에서 부고환 지방 조직과 간의 무게에 있어서 대조군에서는 모두 정상군보다 유의하게 증가하였으나 木香 투여군에서는 모두 대조군에 비해 유의한 감소효과가 나타나지 않았다.
- 실제로 약물을 사용한 경우를 제외하고 생활 습관 개선 등을 통해 체중 감량을 했을 경우 당뇨병 발생의 위험도가 감소되는 것으로 나타났다2. 본 실험에서는 木香 투여군에서 대조군에 비해 유의한 체중 감소 효과가 나타나지 않았다.
- 또한 대식세포의 TNF-α 분비를 억제함으로써 대식세포의 활동을 억제하는 것으로 밝혀졌다29. 본 실험에서는 대조군이 정상군보다 IL-10 유전자 발현이 유의하게 낮았다. 木香 투여군에서는 대조군보다 유의하게 높아, IL-10 유전자 발현을 증가시켜 대식세포의 활동과 염증 반응을 억제시킨 것으로 생각한다.
- 실험 11주째에 시행한 공복 혈당은 대조군(113.29±1.96 mg/dl)이 정상군(75.86±5.28 mg/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(99.00±5.28 mg/dl)은 대조군 보다 유의하게 낮았다(P<0.05)(Fig. 1).
- 실험 12주째에 시행한 공복 혈당은 대조군(109.29±3.26 mg/dl)이 정상군(61.71±2.52 mg/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(93.80±6.06 mg/dl)은 대조군보다 유의하게 낮았다(P<0.05)(Table 2).
- 실험 시작 12주 후 체중은 대조군(38.89±1.24 g)이정상군(26.07±0.59 g)보다 유의하게 높았다(P<0.001).
- 이번 연구를 종합하면 비만을 동반한 인슐린 저항성 동물모델에서 木香 투여군은 비만 자체를 개선시키지는 못하였으나, 고혈당을 억제 하고 인슐린저항성을 완화시켰다. 이는 IL-10, CD68 유전자의발현을 조절하고 대식 세포의 지방 침착을 억제하여 염증 반응을 억제함으로써 나타난 결과로 보여지나 추가적인 실험이 필요하리라 생각한다.
- 혈청 인슐린 농도는 대조군(1.37±0.12 ng/dl)이 정상군(0.65±0.08 ng/dl)보다 유의하게 높았고(P<0.001), 木香 투여군(1.14±0.05 ng/dl)은 대조군과 비교하여 유의한 차이는 없었다(Table 2).
후속연구
- 木香 투여군에서는 대조군보다 유의하게 낮아 유전자 발현을 억제하여,TNF-α, IL-6의 분비를 억제시킬 수 있을 것으로 기대되나 추가적인 실험이 필요하리라 생각한다.
- 이는 IL-10, CD68 유전자의발현을 조절하고 대식 세포의 지방 침착을 억제하여 염증 반응을 억제함으로써 나타난 결과로 보여지나 추가적인 실험이 필요하리라 생각한다. 또한 추후 木香의 장기적인 투여에 따른 치료효과에 대한 평가와 추가적인 임상연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 이번 연구를 종합하면 비만을 동반한 인슐린 저항성 동물모델에서 木香 투여군은 비만 자체를 개선시키지는 못하였으나, 고혈당을 억제 하고 인슐린저항성을 완화시켰다. 이는 IL-10, CD68 유전자의발현을 조절하고 대식 세포의 지방 침착을 억제하여 염증 반응을 억제함으로써 나타난 결과로 보여지나 추가적인 실험이 필요하리라 생각한다. 또한 추후 木香의 장기적인 투여에 따른 치료효과에 대한 평가와 추가적인 임상연구가 필요할 것으로 생각한다.
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