[논문]노루궁뎅이 버섯의 Proteasome 저해 작용

이한나; 김유진; 심상희

노루궁뎅이 버섯의 Proteasome 저해 작용
Proteasome Inhibition Activity of Hericium erinaceum 원문보기

생약학회지, v.39 no.4 = no.155, 2008년, pp.365 - 368

이한나 (영남대학교 생명공학부) , 김유진 (영남대학교 생명공학부) , 심상희 (영남대학교 생명공학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Recently proteasome inhibitors have been emerged as potential anticancer agents. In a continuous study on exploring proteasome inhibitors from natural products, fruiting body of Hericium erinaceum was investigated. The MeOH extracts of the fruiting body of Hericium erinaceum was fractionated with several solvents and the fractions were evaluated on the activity to screen the proteasome inhibitors. The n-Hexane and CHCl3 frs. showed potent activity, of which chemical investigations led to ergosterol peroxide (1), hericenones C (2) and D (3). Their structures were determined by spectroscopic methods such as $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, and FABMS spectra.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구실에서는 천연물로부터 proteasome 저해 작용이 있는 성분을 규명하는 연구를 진행해 왔으며 이 일환으로 노루궁뎅이 버섯의 메타놀 추출물을 극성에 따라 5개의 분획으로 나누고 각각의 분획물에 대해 proteaseome 저해 효과를 측정하여 이를 보고하고자 한다. 또한 활성 분획에서 분리된 3 종의 화합물의 구조에 대해서도 보고하고자 한다.
본 연구실에서는 천연물로부터 proteasome 저해 작용이 있는 성분을 규명하는 연구를 진행해 왔으며 이 일환으로 노루궁뎅이 버섯의 메타놀 추출물을 극성에 따라 5개의 분획으로 나누고 각각의 분획물에 대해 proteaseome 저해 효과를 측정하여 이를 보고하고자 한다. 또한 활성 분획에서 분리된 3 종의 화합물의 구조에 대해서도 보고하고자 한다.

제안 방법

− NMR spectra는 Bruker ARX spectrometer (250 MHz)의 Bruker’s standard pulse program을 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다.
가장 활성이 강한 CHCl₃ 분획물을 대상으로 column chrmatography를 시행하여 2 종의 화합물을, n-Hexane 분획 물로부터 1종의 화합물을 분리하였고 이들의 구조를 ¹HNMR 및 ¹³C-NMR을 측정하여 결정할 수 있었다.
측정 시 먼저 assay buffer에 3% SDS를 가하여 activation 시킨 후 96 well에 sample, enzyme을 가한 후 37℃에서 10분간 incubation 시켰다. 그 후 기질 (Suc-LLVY-AMC)을 가하였고, 이로써 proteasome의 chymotrypsin-like activity는 효소-기질 반응의 결과 유리되는 AMC의 양을 fluorescence plate reader로 excitation 355 nm, emission 460 nm에서 측정함으로써 결정되었다.
이 중 22번 분획을 Ethyl acetate 및 MeOH 용매로 재결정하여 화합물 1을 분리하였다. 그리고 semipreparative HPLC를 이용하여 더욱 정제하였다. 또한 chloroform 층 (13.
그리고 semipreparative HPLC를 이용하여 더욱 정제하였다. 또한 chloroform 층 (13.4 g)에 대하여 n-Hexane 및 Ethyl acetate의 gradient 용매로 용리시켜 전부 17개의 분획을 얻었다. 이 중 세번째 분획을 MeOH 용매로 재결정하여 화합물 2와 3 (102 mg)을 분리하였다.
− 노루궁뎅이 버섯 330 g 을 잘게 자른 후 메타놀로 추출하였다 (3 L×4 회). 메타놀 추출물을 농축한 후 극성에 따라 n-Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, n-BuOH 순으로 분획하였다. 이 중 n-Hexane 층 (10.
메타놀 추출물을 농축한 후 극성에 따라 n-Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, n-BuOH 순으로 분획하였다. 이 중 n-Hexane 층 (10.2 g)에 대하여 n-Hexane 및 Ethyl acetate의 gradient 용매로 용리 시켜 전부 26개의 분획을 얻었다. 이 중 22번 분획을 Ethyl acetate 및 MeOH 용매로 재결정하여 화합물 1을 분리하였다.
이상의 ¹H-NMR spectral data를 검토하고 문헌^16-17)과 비교하여 화합물1을 ergosterol peroxide로 동정하였다.

대상 데이터

− 노루궁뎅이 버섯은 류충현 약용버섯에서 구입하여 사용하였다.
TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Merck의 70~230 Mesh의 silica gel을 사용하였다. Proteasome 저해 작용 측정을 위해 효소, 기질, buffer 등은 Biomol^¨International LP의 20S Proteasome Assay Kit (AK-740)을 사용하였고 기질로 사용된 Suc-LLVY-AMC 에서 유리된 AMC의 flourescence를 측정하기 위한 fluorescence plate reader로 FLOUoptima가 사용되었다.
추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Merck의 70~230 Mesh의 silica gel을 사용하였다.

성능/효과

Table 1에서 볼 수 바와 같이 노루궁뎅이버섯의 MeOH 추출물은 91% 로 강한 proteasome 저해 작용을 나타냈다. 분획물들 중 n-Hexane 층, CHCl₃ 층 및 EtOAc 층이 각각 74%, 97%, 및 94% 로 강한 proteasome 저해 작용을 나타냈다.
88 에서 지방산의 terminal methyl group의 존재를 확인하여 이 화합물에 지방산이 acylation 되어 있음을 추정할 수 있었다. 이 화합물의 (+) FAB-MS spectrum에서 m/z 571 및 599 에서 [M + H]⁺에 해당하는 pseudo-molecular ion peak이 나타나 지방산의 chain의 길이만 다른 (각각 palmitic acid 및 stearic acid) 두 화합물이 혼합물로서 존재함을 추정할 수 있었다.
이상의 (+) FAB-MS spectrum 과 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR data를 바탕으로 이 화합물을 노루궁뎅이 버섯에서 분리, 보고된 바 있는 hericenones C 및 D로 동정하였고 이는 기존에 보고된 문헌치와 잘 일치하였다.¹⁰⁾
화합물 1의 1H-NMR spectrum에서 δ 0.79 및 δ 0.86에서 2개의 angular methyl기를, δ 0.78, 0.81, 0.88, 및 0.97에서 4개의 secondary methyl기를 확인하여 이 화합물이 steroid 골격을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.
화합물 2 및 3의 1H-NMR spectrum에서 δ 12.38에서 chelated hydroxyl group을, δ 10.11에서 aldehyde group을, δ 3.91에서 benzene ring에 직접 치환된 methoxyl group을 확인할 수 있었고 δ 6.51에서 singlet으로 나타난 하나의 aromatic proton의 존재를 확인하여 이 화합물이 pentasub-stituted phenyl group을 지니고 있음을 추정할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	항암, HeLa 세포 증식 억제, 항염, 항균 등의 약리작용 등이 나타나는 노루궁뎅이 버섯의 성분은 무엇인가?	노루궁뎅이 버섯의 성분에 관한 연구도 상당히 진행되어 왔다. 알려진 성분으로는 9,10-dihydroxy-8-oxo-12-octadecenic acid 와 chitin, heteroxyloglucan, galactoxyloglucan, glucoxylanprotein, glucoxylan, xylan 등의 다당체,7) erinacines A, B, C, D,8) hericenones A, B, C, D, E, F, G, H9-11) 등 이 있 으며, 이들 성분들에 의해 항암, HeLa 세포 증식 억제, 항염, 항균 등의 약리작용이 나타나는 것으로 알려져 왔다.
	Hericium erinaceum 자실체는 어디에서 발생하는가?	중국에서는 원숭이머리버섯 (Monkeyhead mushroom) 또는 곰머리버섯으로 알려져 있으며 일본에서는 Yamabu shitake로 불려지고 있다. Hericium erinaceum 자실체는 목재 백색 부후성으로 가을철에 떡갈나무, 너도밤나무 등 활엽수의 상처부위에 발생한다. 자실체의 크기는 5~30 cm 정도로 처음에는 계란형 또는 반구형이나 점차 생장하면서 자실체 윗면에는 짧은 털이 빽빽히 나고, 앞면에는 2~6 cm 길이의 수많은 수염털(spines)이 향지성(向地性)으로 자란다.
	Hericium erinaceum 자실체의 외형적 특징은 무엇인가?	Hericium erinaceum 자실체는 목재 백색 부후성으로 가을철에 떡갈나무, 너도밤나무 등 활엽수의 상처부위에 발생한다. 자실체의 크기는 5~30 cm 정도로 처음에는 계란형 또는 반구형이나 점차 생장하면서 자실체 윗면에는 짧은 털이 빽빽히 나고, 앞면에는 2~6 cm 길이의 수많은 수염털(spines)이 향지성(向地性)으로 자란다. 자실체는 초기에 백색을, 후에 담황색을 띤다. 자실층은 침 표면에 발달 되었고 조직은 백색이고 스펀지 모양이다.1)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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