선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그 전에 Nordbring-Hertz(1978)는 침입 후 선충 내부에 감염구(infection bulb)를 형성한다고 하였으며 Borrebaeck et al.(1985) 등과 같이 A. oligospora의 포획 기관에서 분리한 렉틴(lectin)과 그 수용체에 대해서 연구 하였다. 렉틴은 특별한 단백질로써 오직 포획기관에서만 발견되며 선충에서 나오는 렉틴의 수용체는 렉틴과의 친화성이 포획능력과 관련된다고도 하였다.
- 따라서 본 연구의 목적은 Arthrobotrys속의 대표적 살선충곰팡이인 A. oligospora, A. dactyloides, A. conoides의 생장속도 및 살선충 기작을 알아보고, 소나무재선충에 대한 감염능력을 알고자 하는 것이다.
- Arthrobotrys속 균은 불완전균으로 토양선충을 포획하는 살선충 곰팡이다. 본 논문에서는 선충포획성 균종인 A. oligospora, A. dactyloides, A. conoides의 균사생장, 선충 포획기작의 특성, 그리고 소나무재선충에 대한 감염 능력을 이해하여 살선충 효과가 높은 균종을 알고자 하였다. 소나무재선충은 잿빛곰팡이(Botrytis cinera)에 접종해증식시켰으며 여기에 Arthrobotrys속 3종 각각의 균사배양체 1 cm2씩 접종하고 배지, 온도, pH, 소나무재선충 접종밀도, 영양조건이 균사의 생장에 미치는 영향을 측정하였다.
제안 방법
- Arthrobotrys 균의 선충 포획기관을 관찰하기 위하여 PDA배지에서 배양된 Arthrobotrys속 3종의 균에 재선충이 있는 PDA 배지를 떼어 접종하였다. 재선충이 접종된 배지를 25°C의 항온기에 넣고 6시간 후부터 6시간 간격으로 1% acid fuchsin 염색약을 포획기관이 있는 배지 절편에 떨어뜨리고 2~3분 후 알코올로 희석시켜 광학현미경으로 포획기관을 관찰하였다.
- Arthrobotrys속 균사가 자란 PDA 배지 1 cm2를 소나무 재선충 만연한 플레이트에 접종하고 25°C 항온기에 두고서 날마다 7일 동안 균산생장량을 면적(cm2)으로 측정하였다.
- Arthrobotrys속 균사를 PDA 배지 플레이트 전체에 자라게 한 후, 여기에 잿빛곰팡이에서 자란 재선충을 플레이트반 크기로 접종하였다. 7일 후 배지 전체를 믹서기로 분쇄하고 바에르만 깔대기법으로 분리하였다.
- 재선충이 접종된 배지를 25°C의 항온기에 넣고 6시간 후부터 6시간 간격으로 1% acid fuchsin 염색약을 포획기관이 있는 배지 절편에 떨어뜨리고 2~3분 후 알코올로 희석시켜 광학현미경으로 포획기관을 관찰하였다. Arthrobotrys속의 포획기관을 주사전자현미경으로 관찰하기 위해 재선충의 포획이 의심되는 곳의 배지 절편을 서울대 농업과학공동기기센터(2005)과 충북대 식물의학과 실험실의 전처리 과정에 따라 처리하였다.
- 그리고 균사생장에 대한 pH 영향을 알기 위하여, PDA에서는 malic acid와 phosphate buffer, NaOH를 사용해 pH값을 낮추었고, MMN배지는 phosphate buffer로 조절하였다. PDA배지의 pH는 4.0, 5.6, 10.0의 수준으로 하였으며 MMN배지는 4.5, 5.5, 7.5 수준으로 2일마다 10일간 측정하였다. 소나무재선충 수에 따른 균사 생장량을 측정하기 위하여 바에르만 깔대기 법으로 재선충을 분리하여 모은 후 10 µl pipet 안의 재선충 수를 세어 10, 100, 500, 그리고 약 5000~10000마리의 수준으로 Arthrobotrys속 균종과 같이 접종하여 2일 마다 10일간 균사 생장량을 측정하였다.
- 각 10 µl안에 있는 재선충 수에 100배를 하고 평균을 하여 한 플레이트 내의 재선충의 수를 세었다.
- 균사의 생장량 측정은 처음 접종 크기를 포함하여 콜로니의 장-단경의 평균 생장 길이를 측정하였고 각 처리는 3반복 하여 평균하였다.
- 그리고 온도가 이들 균사 생장에 미치는 영향을 알기 위하여 항온기 15°C, 20°C, 25°C, 30°C에서 2일마다 10일간 측정하였다. 그리고 균사생장에 대한 pH 영향을 알기 위하여, PDA에서는 malic acid와 phosphate buffer, NaOH를 사용해 pH값을 낮추었고, MMN배지는 phosphate buffer로 조절하였다. PDA배지의 pH는 4.
- )으로 측정하였다. 그리고 배지 전체를 바에르만 깔대기에 넣어 재선충을 분리하고 재선충 수를 세었다. 접종은 균종별로 3반복 하였다.
- 접종은 균종별로 3반복 하였다. 그리고 생장속도와 감염율간의 상관 관계를 조사하였다. 한번 포획되어 감염된 선충은 움직이지 못하므로 분리되지 않은 선충은 모두 감염된 것으로 간주하였다.
- 그리고 온도가 이들 균사 생장에 미치는 영향을 알기 위하여 항온기 15°C, 20°C, 25°C, 30°C에서 2일마다 10일간 측정하였다.
- 배양된 잿빛곰팡이가 있는 배지 위에 잿빛곰팡이와 함께 분양 받은 소나무재선충을 접종하여 25°C 항온기에 두고 소나무재선충이 잿빛곰팡이 균사를 섭식하면서 배지 전체에 퍼질 때 까지 증식시켰다.
- 분리된 재선충을 원심분리기에 넣고 2000 rpm에서 약 5분간 돌려 모여진 재선충만을 뽑아 1 ml씩 microtube에 넣고 흔들어 섞은 후 피펫으로 10 µl씩 3회 추출하여 슬라이드글라스에 놓고 저배율의 광학현미경으로 보며 재선충 수를 세었다.
- 각 10 µl안에 있는 재선충 수에 100배를 하고 평균을 하여 한 플레이트 내의 재선충의 수를 세었다. 비교를 위해 잿빛곰팡이에도 재선충을 접종하였으며 균종별로 5반복 하였다. 재선충 수로 대조군과 감염능력을 비교하였다.
- 균종 조합은 Table 3과 같다. 비병원성 선충에 대한 Arthrobotrys 균의 영향을 측정하기 위하여 이들 균이 자란 PDA 배지에 비병원성 선충(BM: Bursaphelenchus mucronatus)을 앞에서 서술한 소나무재선충 처리방법으로 접종하고 분리하여 소나무재선충(BX: B. xylophilus)과 비교하였다.
- 소나무재선충 수에 따른 균사 생장량을 측정하기 위하여 바에르만 깔대기 법으로 재선충을 분리하여 모은 후 10 µl pipet 안의 재선충 수를 세어 10, 100, 500, 그리고 약 5000~10000마리의 수준으로 Arthrobotrys속 균종과 같이 접종하여 2일 마다 10일간 균사 생장량을 측정하였다.
- conoides의 균사생장, 선충 포획기작의 특성, 그리고 소나무재선충에 대한 감염 능력을 이해하여 살선충 효과가 높은 균종을 알고자 하였다. 소나무재선충은 잿빛곰팡이(Botrytis cinera)에 접종해증식시켰으며 여기에 Arthrobotrys속 3종 각각의 균사배양체 1 cm2씩 접종하고 배지, 온도, pH, 소나무재선충 접종밀도, 영양조건이 균사의 생장에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 전체적으로 A.
- 소나무재선충 수에 따른 균사 생장량을 측정하기 위하여 바에르만 깔대기 법으로 재선충을 분리하여 모은 후 10 µl pipet 안의 재선충 수를 세어 10, 100, 500, 그리고 약 5000~10000마리의 수준으로 Arthrobotrys속 균종과 같이 접종하여 2일 마다 10일간 균사 생장량을 측정하였다. 영양 조건에 따른 균사 생장량 측정하기 위하여 PDA를 50%, 10%, 순수 한천으로 하여 Arthrobotrys속 균종을 접종하고 2일마다 10일간 생장량을 측정하였다.
- 비교를 위해 잿빛곰팡이에도 재선충을 접종하였으며 균종별로 5반복 하였다. 재선충 수로 대조군과 감염능력을 비교하였다. 균종 조합은 Table 3과 같다.
- 재선충이 접종된 배지를 25°C의 항온기에 넣고 6시간 후부터 6시간 간격으로 1% acid fuchsin 염색약을 포획기관이 있는 배지 절편에 떨어뜨리고 2~3분 후 알코올로 희석시켜 광학현미경으로 포획기관을 관찰하였다.
- 탄소원 및 질소원이 이 균들의 생장에 미치는 영향을 알기 위하여 PDA, CMA(Corn meal agar) 배지, 질소원이 많아 버섯 균사 배양에 이용되는 MMN(Modified Melin-Norkran's) 배지, 그리고 GYA(Glycerol yeast extract agar)의 총 4종류 배지(Table 2)를 사용하였으며 2일 마다 10일간 생장량과 균밀도를 측정하였다.
대상 데이터
- 2007년 한국미생물보존센터(KCCM)와 한국생명공학연구원(KRIBB)으로부터 분양 받은 Arthrobotrys속 3종 (A. oligospora, A. dactyloides, A. conoides)의 균사(Table 1)를 PDA 배지에 접종하여 25°C 항온기에 두고 배양시켰다.
- 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 2006년 국립산림과학원 남부 연구소에서 분양 받아 PDA(Potato dextrose agar, 39 g/l) 배지가 있는 직경 85 mm 페트리 플레이트에 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)를 접종하여 25°C 항온기에 두고 균사가 플레이트 전체에 퍼질 때 까지 배양시켰다.
- 한천배지에 Arthrobotrys속 균을 1 cm2 크기로 잘라서 접종하여 25°C, pH 5.6에서 배양하였다.
이론/모형
- Arthrobotrys속 균사를 PDA 배지 플레이트 전체에 자라게 한 후, 여기에 잿빛곰팡이에서 자란 재선충을 플레이트반 크기로 접종하였다. 7일 후 배지 전체를 믹서기로 분쇄하고 바에르만 깔대기법으로 분리하였다. 분리된 재선충을 원심분리기에 넣고 2000 rpm에서 약 5분간 돌려 모여진 재선충만을 뽑아 1 ml씩 microtube에 넣고 흔들어 섞은 후 피펫으로 10 µl씩 3회 추출하여 슬라이드글라스에 놓고 저배율의 광학현미경으로 보며 재선충 수를 세었다.
성능/효과
- 10,000마리 이상으로 많은 재선충을 접종하였을 때 Arthrobotrys 균사 생장량은 모두 낮아졌다. 특히 A.
- 10~100마리 정도의 적은 양의 재선충을 넣었을 때는 선충을 넣지않은 무처리와 비교하여 차이가 나지 않았으나 500마리의 재선충을 넣었을 때는 A. oligospora와 A. conoides의 생장이 모두 빨라졌다(Fig. 1E). 하지만 A.
- 3가지 균의 생장은 PDA배지, 25°C, pH 4.5의 조건에서 가장 양호하였다.
- 이것은 dextrose 등의 탄소원이 Malt extract등의 질소원 보다 균사 생장에 많이 이용이 된다고 여겨지며 탄소원이 질소원보다 포획기관 형성에 유리하다고 한 Persson and Beath(1992)과 박 (1982)의 연구와 일치하였다. 4가지의 배지 중 가장 효과적인 것으로는 PDA배지로 생장이 균일하고 균밀도가 높았다(Table 4). 또한 MMN외의 배지에서 균사생장은 균종간에 그리고 배지간에 차이가 현저하였다(p<0.
- 5의 조건에서 가장 양호하였다. A. conoides 균과 A. oligospora 균은 500마리의 재선충 접종으로 생장이 촉진됐으나, 10,000마리 접종으로는 느려졌다. A.
- dactyloides는 오히려 재선충의 밀도를 증가시켰다. A. conoides 균은 빠른 생장률과 초기 포획으로, A. oligospora는 균밀도를 증가시켜서 재선충 감염율을 높였다. 결론적으로 A.
- dactyloides의 포획기관은 단일한 원모양으로 선충이 없어도 형성되었다. A. conoides가 A. oligosora 보다 포획기관 형성이 빨랐으며, 재선충 포획 후 균사가 재선충 내부로 침입하여 작고 많은 침입구(infection bulb)를 만들고 선충을 소화하였다. 그러나 A.
- dactyloides는 산성에서 생장하지 않았으며 재선충이 많을수록 더 느렸다. A. conoides와 A. oligospora의 선충포획기관은 균사보다 굵은 고리들의 망상 구조로서 선충 존재시만 형성되었으나, A. dactyloides의 포획기관은 단일한 원모양으로 선충이 없어도 형성되었다. A.
- dactyloides는 포획기관의 수가 적었고 포획도 하지 못하였다. A. conoides의 재선충 감염율은 95%였고, A. oligospora의 감염율은 80%였다. 그리고 위 두 균의 조합접종에 의한 선충감염율은 92%였다.
- Arthrobotrys속 균종 조합 중에서 A. dactyloides를 제외한 모든 조합에서 재선충이 높이 감염있고 유의적인 차이는 없었으나 A. conoides가 가장 살선충 효과가 높았다. 그러나 균종 조합은 균종간 경쟁에 의해 그 효과가 낮아진다고 생각된다.
- Arthrobotrys속 균종의 조합처리에서 중에서 가장 적은 수의 재선충이 검출된 균은 A. conoides로 감염율이 약 95%였으며, 다음으로는 A. oligospora와 A. conoides의 조합에서 감염율이 94%였다(Fig. 4A). 하지만 A.
- 1B와 같다. MMN 배지를 제외한 3가지 배지에서 A. conoides의 균사 생장량이 가장 빨랐으며(12.9 mm/day), 모든 배지에서 A. dactyloides의 균사 생장량은 가장 느렸다(2.4 mm/day). 박(1982)은 CMA배지에서 A.
- PDA 배지에서 한천을 제외한 영양조건을 50%, 10%, 0%의 수준에 따라 포획되지 않은 재선충 수를 측정한 결과 100% PDA 배지와 비교하여 영양조건이 낮아질수록 검출된 재선충의 수는 감소하는 경향이 있었지만 유의성은 없었다(Fig. 4B). 이는 A.
- PDA배지에서 한천을 제외한 농도를 50%, 10%, 0% 수준으로 낮추면 그에 따라서 균사신장 속도도 느려졌지만(Fig. 1A) 농도에 비례하지는 않았으며, 대신 균사의 밀도가 낮아졌다(Table 4).
- 결국 균사생장률과 재선충감염율이 모두 높은 균종은 A. conoides로 초기 감염률도 가장 높았다. A.
- 균사생장률과 재선충감염률 간의 관계는, A. oligospora, A.conoides 모두 생장률이 높아질 수록 감염율도 높아지는 정의 상관이 있었고 A. dactyloides는 생장할수록 재선충의 수는 늘어났으나 상관관계는 거의 없다고 보여진다. 대체로 A.
- 소나무재선충은 잿빛곰팡이(Botrytis cinera)에 접종해증식시켰으며 여기에 Arthrobotrys속 3종 각각의 균사배양체 1 cm2씩 접종하고 배지, 온도, pH, 소나무재선충 접종밀도, 영양조건이 균사의 생장에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 전체적으로 A. conoides의 생장이 가장 빨랐으며(13.9 mm/day, PDA) A. dactyloides가 가장 느렸다(3 mm/day, PDA). 3가지 균의 생장은 PDA배지, 25°C, pH 4.
- 우리나라에서 살선충 곰팡이를 이용한 생물학적 방제 연구는 박(1999)이 뿌리혹선충의 방제를 시도 하였다. 그 실험에서 살선충 곰팡이를 처리한 결과 토마토 육묘의 뿌리혹 형성이 감소하였고 작물의 생장이 증진되었다고 하였으며 선충의 방제율이 80~90%에 이른다고 하였다. 그러나 Arthrobotrys 속의 살선충균이 소나무재선충을 포획하기 위한 포획기관의 형성과 그 기작, 재선충 내의 침입, 감염기작, 그리고 포획, 감염효과에 대한 연구는 거의 없으며 우리나라에서는 전무한 상태이다.
- oligospora의 생장은 느려졌지만 대신 균밀도가 높아짐에 따라 포획기관의 수가 많아져 포획 효율이 높아졌기 때문이라고 생각된다. 또한 A. conoides도 생장량이 줄었는데도 재선충 접종 후 5일째까지 계속 감염율이 증가하였다. 하지만 A.
- 또한 MMN외의 배지에서 균사생장은 균종간에 그리고 배지간에 차이가 현저하였다(p<0.01).
- oligospora와는 다르게 균 밀도는 그다지 높아지지 않았으며 빠르게 많은 포자를 형성하였다. 또한 재선충 접종 후 다음날부터 높은 감소율을 나타내었으며 7일까지 항상 가장 높은 감염율을 보였다. 이것은 A.
- dactyloides를 제외한 두 균종은 6일만에 페트리플레이트 전체에 퍼질 만큼 높은 생장을 보였지만 균밀도가 낮아서 콜로니가 희미하였다. 반면 질소원 함량이 많은 MMN 배지에서는 균사들이 매우 느리게 생장하였으며 탄소원과 질소원이 모두 있는 GYA 배지에서는 A. oligospora의 생장은 느렸으나 A. dactyloides의 생장은 빨라졌다. 이것은 dextrose 등의 탄소원이 Malt extract등의 질소원 보다 균사 생장에 많이 이용이 된다고 여겨지며 탄소원이 질소원보다 포획기관 형성에 유리하다고 한 Persson and Beath(1992)과 박 (1982)의 연구와 일치하였다.
- 생장 단위 면적당 재선충 감염율은 A. oligospora의 경우 처음은 낮았다가 균밀도가 높아지면서 감염율도 높아졌으며 5일 이후 부턴 재선충 수가 줄면서 낮아졌다(Fig. 4D). 하지만 A.
- 선충 종류에 따라 Arthrobotrys속 균의 포획능력이 차이가 있는지를 알기 위해, 소나무시들음병을 일으키지 않은 비병원성 선충인 B. mucronatus에도 같은 실험을 한 결과 A. conoides와 A. oligospora 균은 선충을 98% 이상 감염시켰고, 재선충을 거의 포획하지 못하였던 A. dactyloides는 이 비병원성 선충을 약 20% 감염시켰다(Fig. 4C). 이것은 A.
- 온도에 따른 균사 생장량은 종에 따라 차이는 있었지만, 25°C에서 가장 높았으며 30°C에서는 생장속도가 낮았다.
- oligospora 균보다 재선충 인식과 그에 따른 포획기관 형성이 빠르고 생장량이 조금 느려지는 대신 그 에너지로 많은 포자를 만들어 발아된 포자는 길이 생장보다는 포획기관를 많이 형성한다고 여겨진다. 이 두균 모두 1~2일의 차이는 있었지만 재선충 접종 후 5~6일에서 높은 재선충 감소율을 나타냈으며 7일 이후부터는 감소율이 급격히 떨어졌다. 이 결과는 포획기관의 수가 5~6일에서 최대에 이르며 재선충이 줄어들면서 포획기관이 감소되거나 더 이상 형성하지 않는다는 것을 암시한다(Fig.
- 4E). 이로써 두 균이 재선충에 반응하는 생리적 차이는 A. oligospora는 생장이 느려지는 대신 균밀도를 높혔으며 A. conoides는 초기 포획기관의 형성율을 높인다는 것을 알 수 있었다.
- 재선충을 접종 후 6시간 마다 포획기관의 형성을 관찰하였는데 A. conoides는 접종 후 약 6시간 후부터 포획기관이 조금씩 형성되기 시작하였으며 12시간 이후 부터는 비교적 많은 수의 포획기관이 형성되었고 그 후로 더 많은 포획기관이 형성되었다. 균사가 재선충의 움직임이나 분비물 등으로 인한 화학적, 물리적 자극을 받아 재선충의 존재를 인식하기 시작하면 수초에서 수분 내에 재선충이 있는 곳뿐만 아니라 페트리 플레이트 전체로 포획기관이 조금씩 형성되었다.
- dactyloides는 부생성이 약하여 잘 경쟁할 수 없다고 한 박(2005)과 일치하였다(Table 4). 탄소원이 많은 PDA와 CMA배지에서 A. dactyloides를 제외한 두 균종은 6일만에 페트리플레이트 전체에 퍼질 만큼 높은 생장을 보였지만 균밀도가 낮아서 콜로니가 희미하였다. 반면 질소원 함량이 많은 MMN 배지에서는 균사들이 매우 느리게 생장하였으며 탄소원과 질소원이 모두 있는 GYA 배지에서는 A.
- 5에서 생장율이 가장 높다는 것과는 반대 결과였다. 특히 A. oligospora는 pH 4.5에서 A. conoides 보다 빠른 생장을 하였는데 이 결과로 A. oligospora는 넓은 pH 범위를 갖는다는 것을 알 수 있었다. pH 4.
후속연구
- oligospora는 균밀도를 증가시켜서 재선충 감염율을 높였다. 결론적으로 A. conoides균은 균사생장률과 재선충감염율이 높으므로 소나무재선충의 생물학적 방제에 이용될 수 있을 것이라 생각한다.
- conoides의 장점은 재선충이 증가되는 속도보다 빠른 시간 내에 생장하고 많은 포획기관을 형성하므로써 재선충의 살선충 효과가 크다고 생각된다. 이런 A. conoides의 특성을 소나무재선충의 생물학적 방제에 응용할 수 있을 것이라 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.