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문제 정의
- 하지만 그 중요성에도 불구하고 이들 두 종간 비교를 한 연구 실적은 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 C. militaris와 P. tenuipes 균사의 배양특성을 비교하고 버섯균의 생육특성을 이용하여 액체배양을 할 경우, 그 생육조건에 따라 항균활성을 갖는 중간 대사산물을 얻을 수 있다고 보고한 바(Kim et al., 2006), C. militaris와 P. tenuipes의 항균활성 비교를 통해 천연물질로서의 이용 가능성을 확인코자 하였다.
제안 방법
- 각각의 배지는 121℃에서 20분간 고압 멸균 후 petri dish(87×15 mm, 녹십자)에 분주하여 제조하 였고 시험균주의 균사 선단 부분을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하여 3주 후 colony 직경 및 균사 밀도를 측정하였다.
- tenuipes J2는 MCM과 YMA 배지에 각각 접종하였으며, 배양온도 10～30℃범위에서 5℃ 간격으로 14일간 정치배양한 후 colony 직경을 측정하였다. 균사의 계대횟수에 따른 변화를 조사하기 위하여 PDA 배지를 이용하여 25℃에서 14일 간격으로 총 5회 계대하여 colony 직경을 측정하였다.
- 지름이 8 mm인 paper disc (Advantec)에 희석액 60 ㎕를 흡수시켜 배지 표면상에 고정시키고 28～37℃의 조건에서 48시간 배양 후 paper disc 주위의 inhibition zone 크기를 측정하 여 항균활성을 확인하였다. 대조는 ampicillin과 streptomycin sulfate salt (Sigma)를 1:1의 비율로 혼합하여 50 ppm 농도로 사용하였으며 inhibition zone의 크기는 세균의 생육이 나타나지 않는 부분의 크기로 측정하였다.
- 멸균된 petri dish (87×15 mm, 녹십 자)에 NA 또는 BHIA 배지를 각각 20 ㎖ 분주하였다.
- 멸균된 petri dish (87×15 mm, 녹십 자)에 NA 또는 BHIA 배지를 각각 20 ㎖ 분주하였다. 배양된 세균은 동일한 농도가 되도록 생리식염수를 이용하여 단계희석 후 600 ㎚에서 흡광도(Optical Density, O.D)를 측정(Ultrospec 6300 pro)하였다. 세균수는 4.
- 접종균은 25℃ 배양기에 서 14일간 정치 배양한 후 colony 직경 및 균사 밀도를 측정하였다. 적정 온도 선발을 위해 C. militaris J233과 P. tenuipes J2는 MCM과 YMA 배지에 각각 접종하였으며, 배양온도 10～30℃범위에서 5℃ 간격으로 14일간 정치배양한 후 colony 직경을 측정하였다. 균사의 계대횟수에 따른 변화를 조사하기 위하여 PDA 배지를 이용하여 25℃에서 14일 간격으로 총 5회 계대하여 colony 직경을 측정하였다.
- 각 배지는 121℃에서 20분간 고압멸균 후 petri dish (87×15 mm, 녹십자)에 분주하였고 시험균주의 균사 선단 부분을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하였다. 접종균은 25℃ 배양기에 서 14일간 정치 배양한 후 colony 직경 및 균사 밀도를 측정하였다. 적정 온도 선발을 위해 C.
- 8×106 CFU 정도 되도록 조절한 후 각각의 배지에 100 ㎕씩 spreader를 이용하여 균일하게 도말하였다. 지름이 8 mm인 paper disc (Advantec)에 희석액 60 ㎕를 흡수시켜 배지 표면상에 고정시키고 28～37℃의 조건에서 48시간 배양 후 paper disc 주위의 inhibition zone 크기를 측정하 여 항균활성을 확인하였다. 대조는 ampicillin과 streptomycin sulfate salt (Sigma)를 1:1의 비율로 혼합하여 50 ppm 농도로 사용하였으며 inhibition zone의 크기는 세균의 생육이 나타나지 않는 부분의 크기로 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 세균은 KACC(한국농업미생물자원센터)에서 분양받아 사용하였다. Gram (+)균으로는 Bacillus cereus KACC 10004와 Listeria monocytogenes KACC 10764를 사용하였으며 Gram (-)균으로는 Salmonella enterica KACC 10763, Escherchia coli KACC 10115, Pseudomonas aeruginosa KACC 10260을 사용하였다. 배지 및 배양조 건은 KACC의 product information sheet에 따라 Table 4에 나타냈다.
- PDA 배지 상에서 배양된 시험균주인 C. militaris J233 과 P. tenuipes J2의 균사 선단 부분을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 250 ㎖ 삼각플라스크에 100 ㎖씩 분주된 PDB (Potato Dextrose Broth) 배지에 접종하였다. 접종된 균은 14일간 150 rpm의 25℃ 조건의 진탕배 양기(Daeil DSK 522)에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 세균은 KACC(한국농업미생물자원센터)에서 분양받아 사용하였다. Gram (+)균으로는 Bacillus cereus KACC 10004와 Listeria monocytogenes KACC 10764를 사용하였으며 Gram (-)균으로는 Salmonella enterica KACC 10763, Escherchia coli KACC 10115, Pseudomonas aeruginosa KACC 10260을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 동충하초 균주는 국립농업과학원 잠사 양봉소재과 보존주로 C. militaris J233(번데기동충하초) 과 P. tenuipes J2(눈꽃동충하초)를 사용하였다. 균주를 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에 접종하여 25℃ 배양기에서 14일간 정치 배양하여 접종원으로 이용하였다.
- 접종된 균은 14일간 150 rpm의 25℃ 조건의 진탕배 양기(Daeil DSK 522)에서 배양하였다. 액체배양균은 멸균된 여과지(Whatman No. 1)를 이용하여 배양액과 균사 체로 분리하였으며, 배양액은 동결건조(Ilshin Lap Co., Ltd.)하여 일정한 농도로 희석 후 실험에 사용하였다(Fig. 1).
- 적정 배지 선발을 위해 PDA 배지 등 7종의 배지를 시험에 사용하였다(Table 1). 각 배지는 121℃에서 20분간 고압멸균 후 petri dish (87×15 mm, 녹십자)에 분주하였고 시험균주의 균사 선단 부분을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하였다.
- 각각의 배지는 121℃에서 20분간 고압 멸균 후 petri dish(87×15 mm, 녹십자)에 분주하여 제조하 였고 시험균주의 균사 선단 부분을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하여 3주 후 colony 직경 및 균사 밀도를 측정하였다. 탄소원은 Table 2와 같이 glucose를 비롯하여 12종을 사용하였으며 질소원은 적정 탄소원으로 선발된 fructose를 고정하고 Table 3과 같이 potassium nitrate를 비롯하여 9종을 사용하였다.
이론/모형
- 항균활성은 paper disc diffusion (Imtiaj et al., 2007)의 방법으로 측정하였다. 멸균된 petri dish (87×15 mm, 녹십 자)에 NA 또는 BHIA 배지를 각각 20 ㎖ 분주하였다.
성능/효과
- P. tenuipes의 경우 YMA 배지에서 colony 직경이 53.6±0.15 mm로 가장 높았으며 MMM 배지를 제외한 6종의 배지에서 생장 밀도가 높았다.
- 균사 생육 적정 온도는 C. militaris과 P. tenuipes가 각각 25℃에서 우수하였으며(Fig. 2), 최근 보고(Choi et al., 1999, Lee et al., 2000, Sung et al., 2002, Shim et al., 2003)와 비교 시 25℃ 온도 범위에서 균사 생장이 우수하 다는 결과와 일치하였다. 균사의 계대 횟수에 따른 변화에 있어 C.
- 균사의 계대 횟수에 따른 변화에 있어 C. militaris는 1회 계대 시 44.3±0.15 mm로 최다 5회 계대 시 39.8±0.13 mm로 점차 생장률이 저하되는 것을 확인할 수 있었다.
- militaris을 3회 이상 계대할 경우 계대 배양에 따른 균사노화로 인해 생육 저하가 일어난다 고 보고하였다. 따라서 C. militaris의 경우 계대 횟수에 따른 생장량 감소는 동일한 결과를 보였으며 균주의 특성 에 따라 횟수의 차이는 다소 있는 것으로 보인다.
- 질소원 선발은 Table 7과 같이 유기태의 경우 C. militaris 와 P. tenuipes 모두 ammonium sulfate의 생장량이 각각 56.5±0.71 mm, 64.0±2.65 mm로 가장 우수하였으나 밀도 고려 시, C. militaris는 calcium nitrate, P. tenuipes는 sodium nitrate가 적합하였다.
- 탄소원 선발 실험결과 단당류에서는 C. militaris 와 P. tenuipes 모두 fructose에서 균사 생육이 각각 52.3±0.21 mm, 57.6±0.27 mm로 생장하여 가장 우수하였다.
- 8 mm인 것에 비해 생장률이 가장 우수하였다. 한편 MMM 배지를 제외한 6종의 배지에 서는 높은 생장 밀도를 확인할 수 있었다. P.
후속연구
- 버섯 중에서도 동충하초는 불로장생과 영양 강장, 면역 기능 증강, 자연 치유력, 항암, 마약 중독 해독, 염증 억제 등의 효능을 가지고 있어 이에 대한 구체적인 연구가 필요하다(Sung, 1996). Park et al. (2002)은 C. militaris는 자실체, P. tenuipes는 균사체에서 항균활성이 있다는 보고를 하였으나 본 실험은 동충하초의 여러 부위 중 배양액으로 실시함으로서 다양한 부위 및 추출방 법에 대한 실험이 요구되며 C. militaris와 P. tenuipes 이외의 종에 대한 항균활성 검정도 요구된다. 또한 항균 활성을 나타내는 동충하초의 특정 물질에 대한 연구와 천연물질로서 동충하초의 특성을 구체화할 필요성이 있다.
- tenuipes 이외의 종에 대한 항균활성 검정도 요구된다. 또한 항균 활성을 나타내는 동충하초의 특정 물질에 대한 연구와 천연물질로서 동충하초의 특성을 구체화할 필요성이 있다. 이를 개선할 경우 천연물질로서 동충하초의 역할을 기대할 수 있을 것이라고 판단된다.
- 또한 항균 활성을 나타내는 동충하초의 특정 물질에 대한 연구와 천연물질로서 동충하초의 특성을 구체화할 필요성이 있다. 이를 개선할 경우 천연물질로서 동충하초의 역할을 기대할 수 있을 것이라고 판단된다.
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