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문제 정의
- 산겨릅나무는 중국과 우리나라에서 한약제로 널리 유통되고 있으며 특히 강원도를 위시한 고랭지에 서식하는 작목 중의 하나이다. 따라서, 산겨릅나무의 효능을 추구하고자 하는 연구의 일환으로 in vitro에서 DPPH 소거활성, 지질과산화형성 저해효과 및 in vivo에서 D-GaIN 유발 간장해 보호효과를 검토하였다. D-GaIN은 기능과 형태에서 있어서 바이러스성 간염과 유사한 간독성을 일으키는 것으로 알려져 있다24,25).
- 이에 본 실험에서는 산겨릅나무에서 분리한 추출물 및 분리한 단일화합물의 간보호작용을 검색하고 그 기전을 연구함으로써 새로운 간보호 약물의 개발을 시도하고자 실험동물을 이용하여 간독성물질을 투여하고서 혈중의 생화학적 변화를 관찰하고 또한 활성산소의 해독계에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- 이때 효소 활성의 일중 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00) 내에서 처치하였다. D-galactosamine((D-GaIN)의 투여는 생리식염수에 750 mg/kg으로 녹여서 복강주사로 투여하였으며 투여 마지막날 24시간 경과 후 채혈 및 치사하였다.
- 산겨릅나무로부터 분리한 salidroside를 대상으로 각 분획 및 성분을 2주간 흰쥐에 투여하고서 d-galactosamine 유발 간장해 병태 모델 흰쥐를 대상으로 간장해 보호효과를 검색하였다. d-Galactosamine 처치로 유발된 간장해 흰쥐에서 혈중 AST , ALT 및 LDH의 활성이 현저히 증가되던 것이 salidroside의 전처리로 유의성 있게 억제되었다.
- 상지대학교 박희준교수님 연구실에서 공급받은 산겨드릅나무 추출물 및 Salidroside(Sal)을 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 추출물(200 mg/kg) 및 Sal(20 mg/kg) 및 대조약물인 silymarin(25 mg/kg)을 oral jonde를 사용하여 경구로 실험동물에 2주간 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
- 실험동물을 CO2 gas로 가볍게 마취시킨 후, 복부 대동맥에서 채혈하여 실혈사 시키고 간장을 생리식염수로 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 간장을 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여지로 간에 남아 있는 혈액 및 기타 이물질을 제거한 다음 간조직 1 g 당 4배 양의 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 가하여 빙냉상에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 냉장 원심분리기로 600 xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 고속 원심분리기로 10,000 xg에서 20분간 원심분리한 후, 그 침전물은 동량의 0.
- 5)을 만들었다. 이 substrate solution 3 ml에 각 sample 100 ㎕을 가한 후, 43.6 m-1 cm-1의 extinction coefficient를 사용하여 분광광도계로 240 nm에서 phophate buffer를 blank로 하고 2분 동안 absorbance를 측정하고, 분당 흡광도 변화를 평균으로 하여 다음 식에 의해 효소 활성을 계산하였다. 효소활성은 비활성(Specific activity=Unit/min/mg of protein)으로 나타내었다, Catalase 1 unit는 단백질 1 mg이 1분 동안에 반응하여 분해시킨 H2O2량으로 나타낸 것이다.
- 9 ml를 가하여 standard absorbance로 사용하였다. 이 substrate 용액에 각 sample 0.1 ml를 가하고 분광광도계를 사용해 420 nm에서 tris-acetate buffer를 blank로 하고 3분 동안 absorbance를 측정하고, 분당 흡광도 변화를 평균내어 다음 식에 의해 효소 활성을 계산하였다. 효소활성은 비활성(Specific activity=Unit/min/mg of protein)으로 나타내었다.
- 4)를 가하여 빙냉상에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 냉장 원심분리기로 600 xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 고속 원심분리기로 10,000 xg에서 20분간 원심분리한 후, 그 침전물은 동량의 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) 용액을 가하여 현탁시킨 시료액을 다시 10,000 xg에서 30분간 원심분리한 상징액은 다시 105,000 xg에서 60분간 초고속 원심분리하여 얻은 상징액을 cytosolic 분획으로 하여 효소활성 측정용으로 사용하였다. 상기의 실험은 4℃에서 행하였다.
- 한편 양성대조약물 silymarin 25 mg/kg 투여군에서도 혈청 중 AST, ALT 및 LDH의 활성도는 대조군에 비하여 유의한 상승억제효과가 인정되었다. 이에 본 예비 실험에서 산겨릅나무 부탄올 분획에서 D-GaIN에 의해 유도되는 간독성의 보호효과를 관찰하고서 부탄올 분획에서 활성 성분인 Sal을 동정하고서 아래의 실험을 행하였다.
- Lactate dehydrogenase (LDH)의 측정은 Wroblewskin의 방법15)에 따라 조제된 kit를 사용하였다. 즉 기질액 (100 ml당 lithium lactate 2.31 g 및 tris (hydroxymethyl) aminomethane 2.42 g 함유)과 정색시액 (100 ml당 NAD 574 mg 및 1-methylphenassium metalsulfate 3.4 ml 함유)을 1:1 로 혼합하여 37℃에서 5분간 preincubation후에 시료를 가하여 잘 혼합하고 37℃에서 10분간 방치하여 염산으로 반응을 종료시켜 파장 570 nm에서 흡광도를 읽고 표준곡선에 준해 그 활성도를 측정하였다.
대상 데이터
- 상지대학교 박희준교수님 연구실에서 공급받은 산겨드릅나무 추출물 및 Salidroside(Sal)을 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 추출물(200 mg/kg) 및 Sal(20 mg/kg) 및 대조약물인 silymarin(25 mg/kg)을 oral jonde를 사용하여 경구로 실험동물에 2주간 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
- 실험동물은 효창사이언스로부터 분양받아 동물사의 일정한 조건(온도 : 24±2℃, 습도 : 40-60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle)하에서 1주가량 충분하게 적응시켜 사육한 체중 200±10g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였고, 실험 시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- Free radical scavenging 작용은 비교적 안정한 free radical인 DPPH(1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl)를 이용한 Blois의 방법12)을 사용하였고, 지질과산화형성 저해 활성은 간 균질액을 이용한 Yakozawa의 방법13)에 준하였다.
- Hydrogen peroxide의 분해에 따라 감소하는 흡광도를 측정하는 Aebi의 방법19)을 이용하였다. 50 mM phosphate buffer(pH 7.
- 0 ml를 가하여 혼합한 후 10분간 실온에서 방치하고 파장 505 nm에서 흡광도를 측정하여 활성도를 표준검량선에 준하여 혈청 1 ml당 Karmen unit로 표시하였다. Lactate dehydrogenase (LDH)의 측정은 Wroblewskin의 방법15)에 따라 조제된 kit를 사용하였다. 즉 기질액 (100 ml당 lithium lactate 2.
- Mertens등의 방법16)에 준하여 간조직 1 g 당 9배 양의 생리식염수를 가하여 마쇄한 다음 이 마쇄액 0.4 ml에 8.1% thiobarbituric acid를 가한 후 95℃에서 1시간 동안 반응시키고 실온에 방치한 다음 증류수 1.0 ml와 n-butanol : pyridine (15:1) 5.0 ml를 첨가해 잘 섞은 후 원심분리하여 n-butanol : pyridine 층을 취하여 파장 532 nm에서 생성되는 홍색의 malondialdehyde의 양을 측정하여 검량선은 1,1,3,3-tetraethoxypropane을 이용하여 산정하였다.
- Pyrogallol autoxidation의 저해를 관찰하는 Stefan과 Gudrun의 방법17)을 사용하였다. 50 mM tris-acetate buffer (pH 8.
- 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법20)에 준하여 bovine serum albumin(Sigma, Fr. V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.
성능/효과
- D-GaIN 처치 대조군의 SOD가 3.73±0.19 U/min/mg protein으로 생리식염수를 처치한 정상군 7.25±0.48 U/min/mg protein에 비하여 유의적(p<0.05)으로 현저히 억제 되었으며 산겨릅나무 부탄올 분획 200 mg/kg 투여군에서는 4.98±0.38 U/min/mg protein으로 대조군에 비하여 유의한 현저히 증가되었다.
- 1%의 유의한 치료효과가 인정되었으며 한편 LDH는 간, 심장, 신장, 근육 등 생체내에 널리 분포하며 transaminase와 함께 간세포 장애시에 혈중에 증가하는 이탈효소이나 체내 분포가 광범위하기 때문에 장기특이성이 낮지만15). D-GaIN으로 유발된 간장해 흰쥐의 혈청 중으로 이탈한 LDH 효소활성도는 정상군에 비하여 약 2.5배 정도 증가하였다. 한편, 산겨릅나무 부탄올 분획 200 mg/kg 투여군은 대조군에 비하여 85.
- In vitro에서 산겨릅나무의 목부에서 분리한 salidroside(Sal)의 항산화활성을 시험관 내에서 측정한 결과를 Table 1에 나타난 바와 같이 DPPH에 대한 소거 활성은 IC50가 0.126 mg/ml, D-GaIN으로 유발한 흰쥐의 지질과산화 생성에 대한 저해활성은 IC50가 23.8 mg/ml로 양성대조 약물로 사용한 vitamin C의 각각 활성 0.005 mg/ml 및 11.8 mg/ml로 활성의 차이는 현저하였으나, 시험관내 시험에서 Sal의 항산화 활성을 관찰할 수 있었다.
- 산겨릅나무로부터 분리한 salidroside를 대상으로 각 분획 및 성분을 2주간 흰쥐에 투여하고서 d-galactosamine 유발 간장해 병태 모델 흰쥐를 대상으로 간장해 보호효과를 검색하였다. d-Galactosamine 처치로 유발된 간장해 흰쥐에서 혈중 AST , ALT 및 LDH의 활성이 현저히 증가되던 것이 salidroside의 전처리로 유의성 있게 억제되었다. 간 cytosol중 지질과산화 함량의 지표인 MDA의 함량도 현저히 간장해 유발로 증가되던 것이 억제되었으며, 항산화 효소로 알려진 superoxide dismutase, glutathione peroxidase 및 catalase의 효소 활성도 유의성 있게 개선되었다.
- d-Galactosamine 처치로 유발된 간장해 흰쥐에서 혈중 AST , ALT 및 LDH의 활성이 현저히 증가되던 것이 salidroside의 전처리로 유의성 있게 억제되었다. 간 cytosol중 지질과산화 함량의 지표인 MDA의 함량도 현저히 간장해 유발로 증가되던 것이 억제되었으며, 항산화 효소로 알려진 superoxide dismutase, glutathione peroxidase 및 catalase의 효소 활성도 유의성 있게 개선되었다. 시험관내 시험에서 DPPH 라디칼 소거활성과 지질과산화의 형성도 저해되는것을 관찰 할 수 있었다.
- 따라서, 이들 효소들은 surperoxide radical과 과산화수소 증가에 따른 조직손상을 방어하는 효능이 있는 것으로 알려져 있다34,35). 과산화수소(H2O2)를 H2O로 전환하는 GSH-Px 및 catalse의 활성도 대조군에 비해 Sal을 2주간 투여군에서 유의성 있게 증가하는 경향을 보였다.
- 그 결과 D-GaIN 처치한 대조군의 MDA량은 1.92±0.13 μg/mg protein으로 생리식염수를 처리한 정상군 1.18±0.18 μg/mg protein에 비하여 약 63% 유의성(p<0.05) 있게 증가됨이 관찰되었다.
- . 따라서, 간 중에 생성된 지질과산화물을 TBA법을 이용하여 측정한 결과 D-GaIN를 투여한 대조군은 생리식염수를 투여한 정상군에 비하여 약 45% 정도의 지질과산화 함량이 증진되는 것을 관찰하였다. 산겨릅나무 부탄올 및 이곳에서 분리한 Saldmf 전처리 하므로서 D-GaIN에 의하여 증가되던 지질과산화의 함량이 약 61.
- 또한 물층에서 다소 억제하는 경향을 보였으나 산겨릅나무 부탄올, 클로르포름 및 에틸아세테이트 분획의 투여에서는 대조군과 활성의 차이는 있었으나 통계적(p<0.05)인 유의성은 없었다.
- 본 연구에서도 D-GaIN 처리한 대조군에서의 transminase 효소활성도는 생리식염수를 주사한 정상군에 비하여 유의한 상승을 보여 간독성이 유발됨을 알 수 있었다. 따라서, D-GaIN 처리 전에 산겨릅나무 각분획을 2주간 경구투여하고서 D-GaIN 간독성 예방효과를 검토한 바 검액 부탄올 분획 200 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비하여 AST 및 ALT 효소활성도는 각각 52.
- 산겨릅나무 각분획(메탄올, 물, 부탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트) 200 mg/kg 투여군에서 분탄올 분획을 투여한 군에서 1250.8±121.3 IU/L로 대조군에 비하여 효소활성의 상승 억제효과를 보였다.
- 따라서, 간 중에 생성된 지질과산화물을 TBA법을 이용하여 측정한 결과 D-GaIN를 투여한 대조군은 생리식염수를 투여한 정상군에 비하여 약 45% 정도의 지질과산화 함량이 증진되는 것을 관찰하였다. 산겨릅나무 부탄올 및 이곳에서 분리한 Saldmf 전처리 하므로서 D-GaIN에 의하여 증가되던 지질과산화의 함량이 약 61.3%의 유의한 지질과산화물 형성촉진을 억제하였다.
- 산겨릅나무 부탄올 분획 200 mg/kg 투여군에서는 1.61±0.15 μg/mg protein으로 대조군에 비하여 유의한 지질과산화물질 형성저해효과를 보였고, 이의 성분으로 추정되는 Sal 20 mg/kg의 투여에서도 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되는 경향을 보였다.
- 산겨릅나무에서 활성 성분의 검색을 목적으로 D-GaIN 투여로 유발된 간장해 흰쥐에서 혈청중의 transaminase 및 LDH의 활성을 산겨릅나무 각분획(메탄올, 물, 부탄올, 클로로포름, 에틸 아세테이트)을 투여하고서 검색하여 본 결과 부탄올 분획에서 GaIN으로 유도한 간독성이 현저히 억제됨을 관찰하였으며 부탄올, 클로르포름 및 에틸아세테이트 분획의 투여에서는 대조군과 활성의 차이는 있었다.
- 간 cytosol중 지질과산화 함량의 지표인 MDA의 함량도 현저히 간장해 유발로 증가되던 것이 억제되었으며, 항산화 효소로 알려진 superoxide dismutase, glutathione peroxidase 및 catalase의 효소 활성도 유의성 있게 개선되었다. 시험관내 시험에서 DPPH 라디칼 소거활성과 지질과산화의 형성도 저해되는것을 관찰 할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 산겨릅나무에서 분리한 salidroside는 간보호작용이 있는 것으로 향후 기능성 물질의 소재로 활용할수 있을 것으로 사료된다.
- 05)인 유의성은 없었다. 이러한 결과는 혈청중 alanine transaminase(ALT)활성 및 lactate dehydrogenase(LDH)의 활성에서도 d-galactosamine을 처치한 군에서 정상군에 비하여 현저히 증가되던 각각의 효소 활성이 산겨릅나무 부탄올 분획 200 mg/kg 투여에서 현저히 억제되었다. 한편 양성대조약물 silymarin 25 mg/kg 투여군에서도 혈청 중 AST, ALT 및 LDH의 활성도는 대조군에 비하여 유의한 상승억제효과가 인정되었다.
- 활성산소의 해독계로 알려진 GSH-Px 및 catalase의 활성도 D-GaIN 처치 대조군에서 생리식염수를 처치한 정상군에 비하여 유의적(p<0.05)으로 현저히 억제 되던 것이 산겨릅나무 부탄올 분획 200 mg/kg 투여 및 이의 성분으로 추정되는 Sal 20 mg/kg의 투여로서 대조군에 비하여 유의성 있게 증가되는 경향을 보였다.
- 흰쥐에 D-GaIN를 처치하면 혈중의 aspartate aminotransferase (AST) 활성은 1,873.3±145.7 IU/L로 생리식염수를 투여한 정상군의 활성인 226.3±54.2 IU/L에 비하여 현저히 증가되었다.
후속연구
- 시험관내 시험에서 DPPH 라디칼 소거활성과 지질과산화의 형성도 저해되는것을 관찰 할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 산겨릅나무에서 분리한 salidroside는 간보호작용이 있는 것으로 향후 기능성 물질의 소재로 활용할수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 실험성적을 종합하여 볼 때 D-GaIN의 처리로 유발된 간장해에 대한 산겨릅나무의 간보호효과의 일부는 산화적 stress에 대한 방어적 작용에 기인하는 것으로 앞으로 계속 연구되어야 할 것으로 사료된다.
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