본 연구는 간암세포 HepG2의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 천연소재 발굴을 목적으로, 산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암세포 HepG2의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 간암세포의 생존율에 분획별 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 분획물을 24시간, 48시간 동안 농도별로 처리하여 살아있는 세포를 계수한 결과 24시간 처리 시 모든 분획에서 농도 의존적으로 유의하게 생존율이 감소하였으며 유기용매 분획물들이 수용성 용매 추출물보다 높은 생육 억제 활성을 보였다. 48시간 처리 시에도 같은 경향이 나타났으며 24시간에 비하여 세포 생존율이 비슷하거나 조금 더 감소하였다. MTT assay를 통한 세포 생존 억제율의 측정 결과 BuOH 분획물은 간암세포에 대해 농도 의존적으로 생존 억제율을 증가시켰다. 형광현미경을 이용한 세포형태 관찰에서는 BuOH 분획물의 농도 의존적으로 세포의 형태가 응축되고 무정형으로 세포사멸이 나타나 apoptotic cell의 전형적인 양상을 확인할 수 있었다. Hong 등(10)의 연구에서 산겨릅나무의 추출물 중 ethyl acetat와 butanol 분획에서 뛰어난 항산화성과 항지질과산화 활성이 있음을 밝힌 내용과 Shin 등(11)의 위암, 간암, 폐암 및 유방암 세포 등에서 암세포 생육억제효과의 보고와도 유사한 경향이 나타남을 알 수 있었다. 이상의 실험을 통해 산겨릅나무가 간암세포의 성장을 저해하는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며 앞으로 식용 및 약용자원으로서 활용가능성이 높은 것으로 판단된다.
본 연구는 간암세포 HepG2의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 천연소재 발굴을 목적으로, 산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암세포 HepG2의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 간암세포의 생존율에 분획별 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 분획물을 24시간, 48시간 동안 농도별로 처리하여 살아있는 세포를 계수한 결과 24시간 처리 시 모든 분획에서 농도 의존적으로 유의하게 생존율이 감소하였으며 유기용매 분획물들이 수용성 용매 추출물보다 높은 생육 억제 활성을 보였다. 48시간 처리 시에도 같은 경향이 나타났으며 24시간에 비하여 세포 생존율이 비슷하거나 조금 더 감소하였다. MTT assay를 통한 세포 생존 억제율의 측정 결과 BuOH 분획물은 간암세포에 대해 농도 의존적으로 생존 억제율을 증가시켰다. 형광현미경을 이용한 세포형태 관찰에서는 BuOH 분획물의 농도 의존적으로 세포의 형태가 응축되고 무정형으로 세포사멸이 나타나 apoptotic cell의 전형적인 양상을 확인할 수 있었다. Hong 등(10)의 연구에서 산겨릅나무의 추출물 중 ethyl acetat와 butanol 분획에서 뛰어난 항산화성과 항지질과산화 활성이 있음을 밝힌 내용과 Shin 등(11)의 위암, 간암, 폐암 및 유방암 세포 등에서 암세포 생육억제효과의 보고와도 유사한 경향이 나타남을 알 수 있었다. 이상의 실험을 통해 산겨릅나무가 간암세포의 성장을 저해하는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며 앞으로 식용 및 약용자원으로서 활용가능성이 높은 것으로 판단된다.
The objective of this study was to investigate the anticancer effects of Acer tegmentosum M. extracts. HepG2 hepatocarcinoma cells were treated with ethanol, chloroform, ethylacetate, butanol, aqueous fraction and hot water extract. The antiproliferative effect was evaluated by trypan blue exclusion...
The objective of this study was to investigate the anticancer effects of Acer tegmentosum M. extracts. HepG2 hepatocarcinoma cells were treated with ethanol, chloroform, ethylacetate, butanol, aqueous fraction and hot water extract. The antiproliferative effect was evaluated by trypan blue exclusion, MTT-based viability assay and morphology. The trypan blue test showed that anticancer effect of the A. tegmentosum M. extracts on HepG2 cells increased gradually in proportion to the increasing concentration of the fractions. The butanol fraction showed the highest anticancer activity against HepG2 cells (p<0.05). The MTT assay indicated that the growth inhibition by the butanol fraction was dose-dependent. These results suggest that A. tegmentosum M. has the potential to inhibit the growth of hepatocarcinoma cells.
The objective of this study was to investigate the anticancer effects of Acer tegmentosum M. extracts. HepG2 hepatocarcinoma cells were treated with ethanol, chloroform, ethylacetate, butanol, aqueous fraction and hot water extract. The antiproliferative effect was evaluated by trypan blue exclusion, MTT-based viability assay and morphology. The trypan blue test showed that anticancer effect of the A. tegmentosum M. extracts on HepG2 cells increased gradually in proportion to the increasing concentration of the fractions. The butanol fraction showed the highest anticancer activity against HepG2 cells (p<0.05). The MTT assay indicated that the growth inhibition by the butanol fraction was dose-dependent. These results suggest that A. tegmentosum M. has the potential to inhibit the growth of hepatocarcinoma cells.
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문제 정의
본 연구는 간암세포 HepG2의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 천연소재 발굴을 목적으로, 산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암세포 HepG2의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 간 암세포의 생존율에 분획별 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 분획물을 24시간, 48시간 동안 농도별로 처리하여 살아있는 세포를 계수한 결과 24시간 처리 시 모든 분획에서 농도 의존적으로 유의하게 생존율이 감소하였으며 유기용매 분획물들이 수용성 용매 추출물보다 높은 생육 억제 활성을 보였다.
본 연구에서는 천연물 자원으로부터 항암활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 산겨릅나무 분획별 추출물을 인간 유래의 간암세포에 처리하여 항암효과를 확인함으로서 간암세포 성장 저해제로서의 산겨릅나무의 활용가능성을 조사하였다.
가설 설정
2)a,b,cValues in the column with different lowercase superscripts are significantly different at p<0.05.
3)A,B,C,D,EValues in the row with different uppercase superscripts are significantly different at p<0.05.
제안 방법
Trypan blue exclusion test를 통하여 분획물 중 암세포 생존 억제율이 가장 높았던 BuOH 분획물을 가지고 MTT assay를 실시하여 HepG2 생존 억제활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 실험결과 125, 250, 500, 1,000 µg/mL 각 농도에서의 저해효과는 52.
배양된 HepG2 세포를 12 well plate에 각 well당 5×105개로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 산겨릅나무 분획물인 EtOH, CHCl3, EtOAc, BuOH, aqueous 분획물과 열수추출물을 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 녹여 최종농도가 DMSO는 0.1%, 약물의 농도는 125, 250, 500, 1,000 µg/mL가 되도록 하여 24시간, 48시간 동안 처리하였다.
배양된 암세포를 96 well plate 에 well당 1×104개로 분주한 다음 24시간 동안 안정화시킨 후 DMSO에 녹인 산겨릅나무 BuOH 분획물을 125, 250, 500, 1,000µg/mL 농도로 처리하였다.
연구에 사용된 산겨릅나무는 충북 제천산으로 (주)옴니허브에서 구매하여 사용하였다. 분획별 추출물의 조제를 위해서 가지를 세절하여 시료의 10배 량에 해당하는 70% ethanol(EtOH)을 가하여 진탕배양기에서 2회 반복추출하고 Whatman No. 4 여과지로 여과하여 40℃에서 감압농축한 후 동결건조하여 시료로 사용하였다. 일부의 EtOH 추출물은 다시 hexane, chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EtOAc), butanol(BuOH) 등의 순차적 분획물을 얻었고 열수추출물도 동일한 방법으로 추출하여 사용하였다.
산겨릅나무 분획별 추출물이 간암세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 모든 분획을 0.1% DMSO 용액에 녹여 125, 250, 500, 1,000 µg/mL 농도로 만들어 24시간, 48시간 처리하였고 대조군은 0.1% DMSO 용액만을 처리하였다.
산겨릅나무의 BuOH 분획물 처리에 따른 HepG2 세포주의 형태학적인 변화관찰을 위해 6 well에 1×106 cells/mL 로 2 mL씩 첨가하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, 최종농도가 125, 250, 500, 1,000 µg/mL가 되도록 BuOH 분획물을 처리하였다.
incubator에서 24시간 배양한 후, 최종농도가 125, 250, 500, 1,000 µg/mL가 되도록 BuOH 분획물을 처리하였다. 추출물 처리 24시간 후 inverted microscopy(Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 HepG2의 세포 수와 형태변화를 관찰하였다.
피펫으로 세포를 골고루 분산시킨 현탁액 50 µL에 0.4% trypan blue(Gibco, Grand Island, NY, USA) 50 µL 용액을 혼합하여 세포를 염색시킨 후 TMS 현미경(Nikon, Japan)으로 hemocytometer 를 사용하여 염색되지 않은 생 세포수를 계수하였다.
암세포주는 인체기원 세포주인 간암 세포 HepG2(hepatocarcinoma, human)를 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. 배양액은 10% fetal bovine serum(FBS, Welgene, Daegu, Korea)와 1% antibiotic(Welgene)이 함유된 dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM, Welgene)배지를 사용하였다.
연구에 사용된 산겨릅나무는 충북 제천산으로 (주)옴니허브에서 구매하여 사용하였다. 분획별 추출물의 조제를 위해서 가지를 세절하여 시료의 10배 량에 해당하는 70% ethanol(EtOH)을 가하여 진탕배양기에서 2회 반복추출하고 Whatman No.
데이터처리
각 실험군의 평균치간 유의성은 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
본 실험 결과는 SPSS 통계프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 산출한 평균과 표준편차로 나타내었고 일원 배치 분산분석법에 의해 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
BuOH 분획물의 간암세포에 대한 성장억제 효과를 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다(13). 배양된 암세포를 96 well plate 에 well당 1×104개로 분주한 다음 24시간 동안 안정화시킨 후 DMSO에 녹인 산겨릅나무 BuOH 분획물을 125, 250, 500, 1,000µg/mL 농도로 처리하였다.
성능/효과
MTT assay를 통한 세포 생존 억제율의 측정 결과 BuOH 분획물은 간암세포에 대해 농도 의존적으로 생존 억제율을 증가시켰다. 형광현미경을 이용한 세포형태 관찰에서는 BuOH 분획물의 농도 의존적으로 세포의 형태가 응축되고 무정형으로 세포사멸이 나타나 apoptotic cell의 전형적인 양상을 확인할 수 있었다.
본 연구는 간암세포 HepG2의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 천연소재 발굴을 목적으로, 산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암세포 HepG2의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 간 암세포의 생존율에 분획별 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 분획물을 24시간, 48시간 동안 농도별로 처리하여 살아있는 세포를 계수한 결과 24시간 처리 시 모든 분획에서 농도 의존적으로 유의하게 생존율이 감소하였으며 유기용매 분획물들이 수용성 용매 추출물보다 높은 생육 억제 활성을 보였다. 48시간 처리 시에도 같은 경향이 나타났으며 24시간에 비하여 세포 생존율이 비슷하거나 조금 더 감소하였다.
2%로 상대적으로 낮은 억제율을 나타냈다. 또한 유기용매 분획물인 BuOH 분획물, EtOAc 분획물, EtOH 추출물이 상대적으로 aqueous 분획물, 열수추출물과 같은 수용성 용매 분획물보다 세포 생존 억제율이 높은 것으로 관찰되었다.
모든 분획물에서 대조군에 대하여 농도 의존적으로 유의(p<0.05)하게 세포 생존율이 감소하는 경향을 확인할 수 있었으며 처리시간을 24시간 조건으로 했을 때보다 CHCl3 분획물을 제외한 모든 분획물에서 세포 생존율이 더 감소하는 경향을 나타냈다(p<0.05).
실험결과 125, 250, 500, 1,000 µg/mL 각 농도에서의 저해효과는 52.52, 74.69, 70.17, 73.03%로 농도가 높을수록 생존 억제 효과가 증가하였으며 특히 250, 500, 1,000 µg/mL 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 큰 차이가 나타났다(p<0.05).
특히 1,000 µg/mL 농도에서 세포의 응축정도나 세포 수 감소의 정도가 현저히 높게 나타나 다른 농도에 비해 세포생존 억제효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있었다.
특히 BuOH 분획물은 29.5-0.27%로 가장 높은 세포 생존 억제율을 보였고 EtOH 추출물은 49.7-1.5%, EtOAc 분획물은 72.7-0.28%로 높은 억제율이 관찰되었으며 CHCl3 분획물은 86.4-38.1%, 열수추출물은 71.1-20.3%, aqueous 분획물은 70.4-28.7%로 상대적으로 낮은 억제율을 나타내어 분획별 결과는 24시간 처리했을 때와 같은 경향을 나타냈다.
특히 BuOH 분획물이 36.1-0.83%로 가장 높은 세포 생존 억제율을 보였고 두 번째로 높은 그룹은 EtOAc 분획물 81.3-2.1%와 EtOH 추출물 38.0-4.3%이었으며 CHCl3 분획물은 101.9-23.8%, 열수추출물은 78.2-25.4%, aqueous 분획물은 83.7-30.2%로 상대적으로 낮은 억제율을 나타냈다. 또한 유기용매 분획물인 BuOH 분획물, EtOAc 분획물, EtOH 추출물이 상대적으로 aqueous 분획물, 열수추출물과 같은 수용성 용매 분획물보다 세포 생존 억제율이 높은 것으로 관찰되었다.
MTT assay를 통한 세포 생존 억제율의 측정 결과 BuOH 분획물은 간암세포에 대해 농도 의존적으로 생존 억제율을 증가시켰다. 형광현미경을 이용한 세포형태 관찰에서는 BuOH 분획물의 농도 의존적으로 세포의 형태가 응축되고 무정형으로 세포사멸이 나타나 apoptotic cell의 전형적인 양상을 확인할 수 있었다.
후속연구
이상의 실험을 통해 산겨릅나무가 간암세포의 성장을 저해하는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며 앞으로 식용 및 약용자원으로서 활용가능성이 높은 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
암이란 어떤 질병인가?
현대인의 대표적인 만성질환인 암은 생체 조직 안에서 세포가 무제한으로 증식하여 악성 종양을 일으키는 질병으로서 급격한 산업발달과 식생활의 변화 등으로 암 발생률과 사망률이 해마다 증가하고 있다(1). 통계청의 사망원인 통계에 따르면 2009년 우리나라 국민의 사망원인 1위는 암으로 사망자 10만 명 중 140.
암 치료를 위해 어떤 방법들이 사용되고 있는가?
암 치료를 위해 화학요법, 방사선요법 및 외과적인 수술요법 등이 사용되고 있지만 이러한 방법은 암세포는 물론 정상세포에도 영향을 미쳐 탈모나 구토 등의 심각한 부작용을 초래할 뿐만 아니라(3) 지속된 항암제 사용은 약재내성을 발생시켜 암세포 증식에 영향을 미치게 된다(4). 최근 녹색식물이나 과일, 한약 추출물 등의 천연물에 독성이 적으면서 강력한 항암효과를 나타내는 성분들이 함유되어 있다는 사실이 밝혀지면서(5) 국내외에서 천연물로부터 항암제의 분리 및 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(6,7).
산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암 세포 증식에 미치는 영향을 실험한 결과 알 수 있는 사실은 무엇인가?
본 연구는 간암세포 HepG2의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 천연소재 발굴을 목적으로, 산겨릅나무 분획 추출물을 이용하여 간암세포 HepG2의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 간 암세포의 생존율에 분획별 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 분획물을 24시간, 48시간 동안 농도별로 처리하여 살아있는 세포를 계수한 결과 24시간 처리 시 모든 분획에서 농도 의존적으로 유의하게 생존율이 감소하였으며 유기용매 분획물들이 수용성 용매 추출물보다 높은 생육 억제 활성을 보였다. 48시간 처리 시에도 같은 경향이 나타났으며 24시간에 비하여 세포 생존율이 비슷하거나 조금 더 감소하였다.
참고문헌 (18)
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