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문제 정의
- 이에 본 연구팀에서는 마황에 대한 급성독성 시험을 보고한 바 있으며气 후속 연구로서 마황의 치사율 및 독성증상 등의 안전성 자료를 확보하기 위하여 의약품 등의 독성 시험기준(식품의약품안전청 고시 제 1999- 61호) 및 비임상시험 관리기준(식품의약품안전청고시제 2000-63호)에 따라 4주간 횐쥐에 반복 투여하는 아급성 경구 독성시험을 실시하여 보고하는 바이다.
- 8). 전통적인 물 전탕 추출법에 의해 복용되어 온 한약의 안전성을 평가하기 위하여, 본 연구팀은 麻黃 추출물의 경구투여 최대 용량인 5,000 ㎎/㎏에서 급성 독성을 나타내지 않았음을 보고한 바 있으며气 장기간 복용하는 한약의 특성을 고려하여 아급성 경구독성 시험을 수행하였다.
가설 설정
- a) Values are expressed as dead number/total number of animals.
제안 방법
- 투여용량의 차이를 배제하기 위하여 각 시험물질 용액을 동물 체중 kg당 10 nd에매일 투여하였다. 4 주간 시험물질을 1일 1회 28 일간 연속으로 투여하여 4 주 아급성독성시험을 수행하였다.
- Guide Line'。과 Principles and Methods of Toxicology 1'을 참조하였으며, 예비실험결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 최대용량을 2,000 mg/知으로 정하였고, 마황추출물 투여군을 투여 용량에 따라 2, 000 ㎎/㎏, 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏, 125 ㎎/㎏ 등 모두 5개 군으로 나누었다.
- 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을 위하여 EDTA free tube 에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific, Korea) 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet, reticulocyte 및 protein, albumin, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, glucose, total bilirubin, aspartate aminotransferase(AST)t alanine aminotransferase(ALT)t lactate dehydranase(LDH), alkaline Phospatase(ALP)f total 산loles坨rol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정하였다.
- 대조군(vehicle controD 의 동물에는 증류수만을 투여하였다. 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였으며 경구투여용 존데 (zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 조제시험 물질을 강제 경구투여 하였다.
- 마황에 대한 급성 경구 독성 실험결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 마황추출물 투여군은 2, 000 ㎎/㎏을 최고용량으로 설정한 후, 투여 용량을 1, 000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏, 125 ㎎/㎏으로 반감 시켜 설정하였다.
- 모든 시험동물에 대하여 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 그리고 매일 1회 이상씩 일정 시간에 관찰하여 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망유무 및 시험물질 투여 후 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 대조군과 비교 관찰하였다. 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다面
- 모든 실험동물의 식이는 자유 섭취 방법으로 공급하였다. 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다.
- 1주일간의 순화사육 기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(12 It, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다m
- 대조군(vehicle controD 의 동물에는 증류수만을 투여하였다. 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였으며 경구투여용 존데 (zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 조제시험 물질을 강제 경구투여 하였다. 투여용량의 차이를 배제하기 위하여 각 시험물질 용액을 동물 체중 kg당 10 nd에매일 투여하였다.
- 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여 당일을 0 일로 하여 투여 후 2일 간격으로 4주일간 체중을 측정하였다. 모든 실험동물의 식이는 자유 섭취 방법으로 공급하였다.
- 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(12 It, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다m
- 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다. 식이 효율(food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다 15).
- 모든 실험동물의 식이는 자유 섭취 방법으로 공급하였다. 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다. 식이 효율(food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다 15).
- 실험실 환경에서 1주간 적응시킨 실험동물을 대조군과 마황추출물 투여군으로 나누었으며, 각 군은 수컷 10마리로 하였다. 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다.
- 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 우선 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다 그리고 평균 체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별 카드 표시법으로 실시하였다.
- 대조군과 비교 관찰하였다. 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다面
- 투여 개시일로부터 4주 후에 모든 생존 동물을 어 her로 흡입 마취하여 개복 및 복대동맥 절단법으로 방혈 치사시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안적으로 해부소견을 관찰하였다.
- 투여 직전에 증류수를 용매로 하여 시험물질을 125, 250, 500, 1,000, 2,000 mg/10 mL/kg으로 조제하였다. 대조군(vehicle controD 의 동물에는 증류수만을 투여하였다.
- 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였으며 경구투여용 존데 (zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 조제시험 물질을 강제 경구투여 하였다. 투여용량의 차이를 배제하기 위하여 각 시험물질 용액을 동물 체중 kg당 10 nd에매일 투여하였다. 4 주간 시험물질을 1일 1회 28 일간 연속으로 투여하여 4 주 아급성독성시험을 수행하였다.
- 혈액은 회생시에 heart puncture방법으로 5 mL을 채취하였고, 1 mL는 ethylene-diamine tetraacetic acid(EDTA) 처리된 blood collection tube(BD vacutainer, USA) 에 균등질이 되도록 잘 흔들어 4C 에보관해 4财시간 이내에 complete blood count(CBC) 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을 위하여 EDTA free tube 에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific, Korea) 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet, reticulocyte 및 protein, albumin, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, glucose, total bilirubin, aspartate aminotransferase(AST)t alanine aminotransferase(ALT)t lactate dehydranase(LDH), alkaline Phospatase(ALP)f total 산loles坨rol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정하였다.
대상 데이터
- 1주일간의 순화사육 기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다.
- 300 g을 round flask에 넣고 증류수 6, 000 mL를 가한 다음 냉각가를 부착하여 2시간 동안 가열한 다음 여과지로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum eveoratnr (Eyela, Japan)를 사용하여 감압농축한 후, 농축액을 동결 건조하여 시험에 사용하였으며顼, 수율은 15.1% 로 나타났다.
- 본 연구의 시험물질인 마황(Ephedrae Herba)은 (주)옴니허브(Seoul, Korea)를 통하여 구입하였다. 麻 黃 300 g을 round flask에 넣고 증류수 6, 000 mL를 가한 다음 냉각가를 부착하여 2시간 동안 가열한 다음 여과지로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum eveoratnr (Eyela, Japan)를 사용하여 감압농축한 후, 농축액을 동결 건조하여 시험에 사용하였으며顼, 수율은 15.
- 시험구역은 경희대학교 한의과대학의 청정 동물실험실에서 실시하였으며, 본 연구에 사용된 동물은 SPF(Spedfic Pathogen Free: 특정병원체 부재) Sprague-Dawley계의 5주령 된 수컷 횐쥐로서 중앙실험동물(Japan)로부터 분양받아 온도 23 ± 3G 습도 55 ± 5%, 배기 10-18회/h, light/dark 12 h, 조도 150-300 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육 상자(280W X 420L X 170Hmm)에 각각 5마리씩 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육 기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 체중의 변화에 대한 통계학적 분석은 one-way analysis of variance test(ANOVA) 검정에 의해 대조군과 시험물질 투여군을 비교하였고, ANOVA 검정에서 유의성이 인정된 경우에 Studens t-test 검정법에 의해 刀 < 0.05 수준에서 결정하였다.
이론/모형
- 경구 아급성 독성 시험을 평가하기 위한 투여 용량의 선정 기준으로서, 본 시험물질인 마황은 한약재로서 식품의약품안전청의 "의약품 등의 독성시험기준”에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Lin/과 Principles and Methods of Toxicology13 를 참조하였다. 마황에 대한 급성 경구 독성 실험결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 마황추출물 투여군은 2, 000 ㎎/㎏을 최고용량으로 설정한 후, 투여 용량을 1, 000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏, 125 ㎎/㎏으로 반감 시켜 설정하였다.
- 우선 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다 그리고 평균 체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별 카드 표시법으로 실시하였다.
성능/효과
- 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 체중에 비례한 간의 상대 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며, 1, 000 ㎎/㎏ 투여군과 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 체중에 비례한 고환의 상대무게가 좌측 고환과 우측 고환에서 유의한 증가를 보였으나, 이것은 마황의 약리작용으로 인한 체중감량 결과로 해석된다.
- 마황추출물 반복 투여 4주경과 후 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대 무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 시험물질 투여군 간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 다만 마황추출물 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 간의 상대무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며 (p < 0.05), 마황추출물 1,000 및 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 좌측 고환과 우측 고환의 상대무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(P < 0.05, Table 4).
- 없었다(Table 1). 또한 모든 동물에서 시험물질투여 후 자발적인 운동 및 호흡률의 증가 등과 같은 특이할 만한 임상증상은 관찰되지 않았으며 최종 투여일에 실시한 안구검사에서도 특이한 안구부위의 이상소견은 관찰되지 않았다(Table 2).
- 마황 추출물 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 혈액 생화학적 지표로서 protein, albumin, BUN, creatinine, glucose, total bilirubin, AST, ALT, LDH, ALP, total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정한 결과, 모든 혈액생화학적 지표 수치에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다.
- 마황추출물 반복 투여 4주 경과 후 WBC, RBC, HB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, teticulocyte 수치를 측정한 결과, 모든 혈액학적 지표 수치에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 마황 추출물 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 혈액 생화학적 지표로서 protein, albumin, BUN, creatinine, glucose, total bilirubin, AST, ALT, LDH, ALP, total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정한 결과, 모든 혈액생화학적 지표 수치에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다.
- 마황추출물 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대 무게와 상대 무게를 측정한 결과, 간과 고환을 제외한 모든 장기에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 체중에 비례한 간의 상대 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며, 1, 000 ㎎/㎏ 투여군과 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 체중에 비례한 고환의 상대무게가 좌측 고환과 우측 고환에서 유의한 증가를 보였으나, 이것은 마황의 약리작용으로 인한 체중감량 결과로 해석된다.
- 마황추출물 반복 투여 4주 경과 후 최종 체중을 비교한 결과, 농도에 따른 체중 감량 효과가 나타났으며, 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 최종 체중이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이와 같은 체중 감량 결과는 정상적인 마황의 약리작용에 의한 효과를 반영한다"21).
- 관찰되지 않았다. 마황추출물 반복 투여 4주경과 후 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대 무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 시험물질 투여군 간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 다만 마황추출물 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 간의 상대무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며 (p < 0.
- 마황추출물 반복 투여 경과 동안 시험물질 투여에 의한 사망동물은 없었으며, 자발운동 저하, 호흡수 감소, 유루 및 복와위 등의 일반증상은 관찰되지 않았다. 관찰 기간 동안 모든 생존동물에 대한 해부병리소견에서 시험물질의 투여에 기인한다고 사료되는 변화는 관찰되지 않았다.
- 시험물질을 투여하며 4주 동안 체중 변화를 관찰하였을 때, 대조군 및 시험물질 투여군에서 시간이 경과함에 따라 모두 체중증가가 관찰되었으나, 마황 추출물 2,000 mg佃 농도 투여군에서 최종 체중은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(p < 0.05). 체중증가율과 식이효율이 각각 마황추출물 투여 농도에 비례하여 감소하는 경향을 보였다(Table 3).
- 이상과 같이 마황추출물에 대한 반복 투여 독성 시험에서 체중, 일반증상, 사료섭취량, 음수량 혈액학적검사, 혈액생화학적 검사, 육안적 소견, 병리조직학적검사 등에서 특이한 독성병변은 관찰되지 않았다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 시험물질인 마황 추출물을 흰쥐에 4주간 경구 투여한 아급성 독성시험에서 최대 무해 용량은 2,000 ㎎/㎏ 이상인 것으로 사료된다.
- 05). 체중증가율과 식이효율이 각각 마황추출물 투여 농도에 비례하여 감소하는 경향을 보였다(Table 3).
- 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사에 대한 측정 결과 전 투여용량군에서 대조군에 비해 시험물질 투여에 의한 유의성 있는 변화는 인정되지 않았다 (Table 5, 6).
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